乙肝两对半指标一孔检测法
作者：王发锁 程振球 封 岩 左正斌 赵时溪 汤 琰
单位：海军医学研究所，上海市 200433
关键词：乙型肝炎标志物；酶联免疫吸附试验；检测
海军医学杂志990121 摘要 目的：建立方便的乙肝指标检测法。方法：将乙肝五项指标集中在一个大孔中，通过一次加样得到五项结果。结果：用本方法对196份血清进行检测，并和科华试剂公司产品比较，符合率为92.3%～97.4%；对576份血清检测并和上海传染病医院试剂比较，符合率为93.1%～96.5%，P>0.05。结论：对大批血清检测比较，本法和其它常规试剂结果相近。
Detection on Hepatitis BVirus by One-Hole ELISA
Wang Fasuo, Cheng Zhenqiu, Feng Yan, et al
, 百拇医药
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To establish a more convenient method for detection of hepatitis Bvirus. Methods: Five hepatitis Bvirus markers were collected in one hole to obtain the results simultaneously. Results: 196 sera were measured and compared with the products of Kehua company. The coincidence rate was 92.3% to 97.4%. 576sera were compared with reagents from Shanghai Infectious Disease Hospital. The rate was 93.1% to 96.5%. Conclusion: The results produced by this method are similar to those by other conventional methods.
, 百拇医药
Key words hepatitis Bvirus markers; ELISA; detection
乙肝两对半指标是判断乙型肝炎感染、发病和预后的最主要指标[1]，酶联免疫吸附试验(ELISA)已成为应用最广泛的检测技术，现在常用的两对半试剂盒都是五项指标要在五个孔中分别检测[2]。本研究旨在对乙肝酶标检测技术进行改进，将乙肝两对半五项指标集中在一个大孔中，通过一次加样可以得到五项结果(五合一)，使实验更简便、快速、省时、省力，本文称改进后的检测方法为乙肝两对半一孔法，该项研究具有较大的实用性。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 一孔法酶标反应板(PS)：自行设计，由特约厂制模生产，在一个圆孔中分隔成五个表面积相等的小孔。
, 百拇医药
1.1.2 单克隆抗HBs购自上海生物制品研究所。
1.1.3 单克隆HBe购自天津南开大学博泰生物工程公司。
1.1.4 基因工程HBeAg和HBcAg，南京军区军事医学研究所产品。
1.1.5 纯化HBsAg，北京肝炎试剂中心产品。
1.1.6 人抗HBe和人抗HBcIgG，本实验室从筛选乙肝患者血清中获得。
1.2 方 法
1.2.1 各待检指标的小孔位置依次编号为(1)测HBsAg;(2)测HBeAg;(3)测HBs；(4)测抗HBe;(5)测抗HBc。
1.2.2 抗原抗体的包被。
, 百拇医药
1.2.2.1 将人抗HBe和人抗HBc(5μg/ml,50μl/孔)分别加入4和5小孔，置4℃冰箱中24h后甩去孔内液体，拍干。
1.2.2.2 将HBcAg配成1：7浓度，加入Mc抗HBe(终浓度为1μg/ml)置37℃中反应2h，然后加入第5小孔中50μl/孔，同时再将Mc抗HBs4μg/ml，人抗HBe5μg/ml、HBsAg0.25μg/ml、HBeAg1：5依次加入第1、2、3、4孔中，50μl/孔置4℃中24h，甩去孔内液体，拍干备用。
1.2.3 工作浓度酶标记液的配制
吸取1g/L Mc抗HBs-HRP0.5ml、Mc抗HBe-HRP0.4ml、和人抗HBc-HRP 0.5ml一起加入100ml酶标抗体稀释液中，过滤除菌，分装5ml/瓶备用。
1.2.4 对照血清的配制
, http://www.100md.com
该实验中要配对照血清甲、乙两瓶，甲瓶为HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBs(-)、抗HBe(-)、抗HBc(+)，反应后第1、2、3、4小孔均显色，第5小孔为无色。乙瓶为HBsAg(-)、HBeAg(-)、抗HBs(+)、抗HBe(+)、抗HBc(-)，反应后第1、2、3、4小孔均为无色，第5小孔显色。
1.2.5 操作步骤 每孔滴样品稀释液2滴，加血清100μl，再滴工作浓度酶标记液2滴，置37℃中反应1h，取出后洗涤5次，分别在5个小孔中加显色液50μl，显色10min观察结果。
2 实验结果
2.1 包被板与酶标液的稳定性
一次包被多块反应板，置4℃冰箱中保存，间隔不同时间取出该反应板与新包被的反应板同时检测相应的抗原抗体，实验显示存放不同时间的包被板在检测相同的血清时各小孔显色程度很接近，证明在4℃条件下包被的有效期可达6个月。置4℃中保存，间隔不同时间取出该酶标记液与新配制的同浓度酶标记液检测相同的标本，其结果完全相同。
, 百拇医药
2.2 在检测抗HBc的试验中，若抗HBc包被后再加基因工程HBcAg作第二次包被，在用Mc抗HBc-HRP、Mc抗HBs-HRP和抗HBc-HRP混合酶检测HBeAg阳性血清时，往往抗HBc小孔显色(-)，这与乙型肝炎的常见实验模式有矛盾，而当加HBcAg作第二步包被之前，将计算好的HBcAg浓度与Mc抗HBe在试管中先作用1h，然后再加入小孔中作第二步包被，则实验中检测的抗HBc结果与常见实验模式一致，说明HBcAg被Mc抗HBe封闭后效果非常明显[3]。
2.3 阳性检出率比较
本方法与上海市科华试剂公司生产的普通法乙肝两对半试剂同时检测196份血清标本，结果一孔法检测乙肝两对半免疫标志与上海科华试剂的检测结果符合率很高，经统计学处理，五项指标的P值远大于0.05，表明这两种试剂结果没有差异(见表1、2)。
表1 两法检测196份标本的阳性数 项 目
, 百拇医药
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
科华试剂
81
27
20
60
88
一孔法
78
, 百拇医药
26
17
59
96
χ2
0.10
0.02
0.27
0.01
0.60
两法比较，P均>0.05
表2 两法检测各指标的符合率(%) 符合率
, http://www.100md.com
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
阳性符合率
90.6
90.6
81.1
92.4
93.5
阴性符合率
93.6
, http://www.100md.com
98.5
98.3
96.7
94.2
总符合率
92.3
97.4
96.4
95.4
93.8
用一孔法与用上海传染病医院的试剂同时检测576份血清标本，结果符合率也很高，经统计处理，P值都大于0.05，也表明对大批标本二种方法的检测结果基本一致(表3、4)。表3 两法检测576份标本的阳性数 项 目
, 百拇医药
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
传统试剂
263
110
174
164
282
一孔法
257
, 百拇医药
102
152
170
311
χ2
0.13
0.46
2.07
0.15
2.92
两法比较，P均>0.05
表4 两法检测各指标的符合率(%) 符合率
, 百拇医药
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
阳性符合率
92.3
90.6
90.8
89.8
93.8
阴性符合率
93.7
, 百拇医药
97.6
96.4
95.8
93.4
总符合率
93.1
96.5
94.8
94.8
93.6
3 讨 论
乙肝两对半的普通法是一孔检测一个指标，五个指标的酶标液分5瓶装。五合一检测法，酶标液是装在一个瓶的混合物，这就要使同一瓶的各种酶标记物不能互相作用，包被物与混合酶标物之间不能出现异常反应。在两对半指标中影响比较大的主要是检测HBsAg和抗HBs这一对。若检测这一个指标都用夹心法，则同一瓶酶标混合物中就既有抗HBs-HRP,又有抗HBsAg-HRP，它们同处一液，势必结合成免疫复合物而影响实验的正常反应。另外，采用夹心法时，包被的抗HBs和抗HBsAg又可分别与酶标液中的HBsAg-HRP和抗HBs-HRP结合，结果会出现无论检测血清HBsAg和抗HBs是(-)还是(+)，该两个小孔都显色，使结果无法判断。因此，在五合一方法上这两种指标不能同时用夹心法，只能一个指标用夹心法，另一个指标用竞争法。用竞争法的灵敏度一般比夹心法低[4]，经过多次对比实验证明，竞争法对检测HBsAg的灵敏度影响大，而对检测抗HBs的灵敏度影响较小[5]，于是选择竞争法检测抗HBs。
, http://www.100md.com
该方法的另一难度是检测抗HBc这个指标，基因工程的HBcAg不是很纯的抗原，它上面同时也存在HBeAg决定簇，这样，混合酶标液中同时有抗HBc-HRP和抗HBe-HRP，常常对实验起干扰作用，即出现抗HBc假阴性，克服五合一检测法中这种现象是本研究中的技术难题。经过大量的实验，用单克隆抗HBe封闭HBeAg，解决了抗HBc假阴性这一难题，经大量标本的对比试验，证明这种方法使五合一检测抗HBc的结果与普通法一致。
本检测法与普通的乙肝两对半酶标检测法相比有如下优点：(1)试剂盒包装小巧，运送存储方便；(2)操作方便，节省时间；(3)省略了稀释血清的操作步骤；(4)省略了实验中加中和抗原一步；(5)显色满意，对比清晰，容易观察。 参考文献
1 钱宇平，吴系科，何尚浦等主编.流行病学进展.第一版.北京：人民卫生出版社，1988.140
2 杨守纯.提高病毒性肝炎感染标志检验水平的趋势.中华医学检验杂志，1995，18(1)：5
3 染宝铎，曾 真，赵祥胜.乙型肝炎血清学标志间非特异交叉反应的研究.中华医学检验杂志，1995，18(4)：233
4 张 家.酶联法与放免法检测乙型肝炎病毒标记物的比较.临床检验杂志，1993，(2)：68
5 王东方.HBV感染血清学标志物的研究进展.国外医学流行病传染病分册，1993，(5)：198
(收稿：1999-03-17), http://www.100md.com
单位：海军医学研究所，上海市 200433
关键词：乙型肝炎标志物；酶联免疫吸附试验；检测
海军医学杂志990121 摘要 目的：建立方便的乙肝指标检测法。方法：将乙肝五项指标集中在一个大孔中，通过一次加样得到五项结果。结果：用本方法对196份血清进行检测，并和科华试剂公司产品比较，符合率为92.3%～97.4%；对576份血清检测并和上海传染病医院试剂比较，符合率为93.1%～96.5%，P>0.05。结论：对大批血清检测比较，本法和其它常规试剂结果相近。
Detection on Hepatitis BVirus by One-Hole ELISA
Wang Fasuo, Cheng Zhenqiu, Feng Yan, et al
, 百拇医药
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To establish a more convenient method for detection of hepatitis Bvirus. Methods: Five hepatitis Bvirus markers were collected in one hole to obtain the results simultaneously. Results: 196 sera were measured and compared with the products of Kehua company. The coincidence rate was 92.3% to 97.4%. 576sera were compared with reagents from Shanghai Infectious Disease Hospital. The rate was 93.1% to 96.5%. Conclusion: The results produced by this method are similar to those by other conventional methods.
, 百拇医药
Key words hepatitis Bvirus markers; ELISA; detection
乙肝两对半指标是判断乙型肝炎感染、发病和预后的最主要指标[1]，酶联免疫吸附试验(ELISA)已成为应用最广泛的检测技术，现在常用的两对半试剂盒都是五项指标要在五个孔中分别检测[2]。本研究旨在对乙肝酶标检测技术进行改进，将乙肝两对半五项指标集中在一个大孔中，通过一次加样可以得到五项结果(五合一)，使实验更简便、快速、省时、省力，本文称改进后的检测方法为乙肝两对半一孔法，该项研究具有较大的实用性。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 一孔法酶标反应板(PS)：自行设计，由特约厂制模生产，在一个圆孔中分隔成五个表面积相等的小孔。
, 百拇医药
1.1.2 单克隆抗HBs购自上海生物制品研究所。
1.1.3 单克隆HBe购自天津南开大学博泰生物工程公司。
1.1.4 基因工程HBeAg和HBcAg，南京军区军事医学研究所产品。
1.1.5 纯化HBsAg，北京肝炎试剂中心产品。
1.1.6 人抗HBe和人抗HBcIgG，本实验室从筛选乙肝患者血清中获得。
1.2 方 法
1.2.1 各待检指标的小孔位置依次编号为(1)测HBsAg;(2)测HBeAg;(3)测HBs；(4)测抗HBe;(5)测抗HBc。
1.2.2 抗原抗体的包被。
, 百拇医药
1.2.2.1 将人抗HBe和人抗HBc(5μg/ml,50μl/孔)分别加入4和5小孔，置4℃冰箱中24h后甩去孔内液体，拍干。
1.2.2.2 将HBcAg配成1：7浓度，加入Mc抗HBe(终浓度为1μg/ml)置37℃中反应2h，然后加入第5小孔中50μl/孔，同时再将Mc抗HBs4μg/ml，人抗HBe5μg/ml、HBsAg0.25μg/ml、HBeAg1：5依次加入第1、2、3、4孔中，50μl/孔置4℃中24h，甩去孔内液体，拍干备用。
1.2.3 工作浓度酶标记液的配制
吸取1g/L Mc抗HBs-HRP0.5ml、Mc抗HBe-HRP0.4ml、和人抗HBc-HRP 0.5ml一起加入100ml酶标抗体稀释液中，过滤除菌，分装5ml/瓶备用。
1.2.4 对照血清的配制
, http://www.100md.com
该实验中要配对照血清甲、乙两瓶，甲瓶为HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBs(-)、抗HBe(-)、抗HBc(+)，反应后第1、2、3、4小孔均显色，第5小孔为无色。乙瓶为HBsAg(-)、HBeAg(-)、抗HBs(+)、抗HBe(+)、抗HBc(-)，反应后第1、2、3、4小孔均为无色，第5小孔显色。
1.2.5 操作步骤 每孔滴样品稀释液2滴，加血清100μl，再滴工作浓度酶标记液2滴，置37℃中反应1h，取出后洗涤5次，分别在5个小孔中加显色液50μl，显色10min观察结果。
2 实验结果
2.1 包被板与酶标液的稳定性
一次包被多块反应板，置4℃冰箱中保存，间隔不同时间取出该反应板与新包被的反应板同时检测相应的抗原抗体，实验显示存放不同时间的包被板在检测相同的血清时各小孔显色程度很接近，证明在4℃条件下包被的有效期可达6个月。置4℃中保存，间隔不同时间取出该酶标记液与新配制的同浓度酶标记液检测相同的标本，其结果完全相同。
, 百拇医药
2.2 在检测抗HBc的试验中，若抗HBc包被后再加基因工程HBcAg作第二次包被，在用Mc抗HBc-HRP、Mc抗HBs-HRP和抗HBc-HRP混合酶检测HBeAg阳性血清时，往往抗HBc小孔显色(-)，这与乙型肝炎的常见实验模式有矛盾，而当加HBcAg作第二步包被之前，将计算好的HBcAg浓度与Mc抗HBe在试管中先作用1h，然后再加入小孔中作第二步包被，则实验中检测的抗HBc结果与常见实验模式一致，说明HBcAg被Mc抗HBe封闭后效果非常明显[3]。
2.3 阳性检出率比较
本方法与上海市科华试剂公司生产的普通法乙肝两对半试剂同时检测196份血清标本，结果一孔法检测乙肝两对半免疫标志与上海科华试剂的检测结果符合率很高，经统计学处理，五项指标的P值远大于0.05，表明这两种试剂结果没有差异(见表1、2)。
表1 两法检测196份标本的阳性数 项 目
, 百拇医药
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
科华试剂
81
27
20
60
88
一孔法
78
, 百拇医药
26
17
59
96
χ2
0.10
0.02
0.27
0.01
0.60
两法比较，P均>0.05
表2 两法检测各指标的符合率(%) 符合率
, http://www.100md.com
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
阳性符合率
90.6
90.6
81.1
92.4
93.5
阴性符合率
93.6
, http://www.100md.com
98.5
98.3
96.7
94.2
总符合率
92.3
97.4
96.4
95.4
93.8
用一孔法与用上海传染病医院的试剂同时检测576份血清标本，结果符合率也很高，经统计处理，P值都大于0.05，也表明对大批标本二种方法的检测结果基本一致(表3、4)。表3 两法检测576份标本的阳性数 项 目
, 百拇医药
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
传统试剂
263
110
174
164
282
一孔法
257
, 百拇医药
102
152
170
311
χ2
0.13
0.46
2.07
0.15
2.92
两法比较，P均>0.05
表4 两法检测各指标的符合率(%) 符合率
, 百拇医药
HBsAg
HBeAg
抗HBs
抗HBe
抗HBc
阳性符合率
92.3
90.6
90.8
89.8
93.8
阴性符合率
93.7
, 百拇医药
97.6
96.4
95.8
93.4
总符合率
93.1
96.5
94.8
94.8
93.6
3 讨 论
乙肝两对半的普通法是一孔检测一个指标，五个指标的酶标液分5瓶装。五合一检测法，酶标液是装在一个瓶的混合物，这就要使同一瓶的各种酶标记物不能互相作用，包被物与混合酶标物之间不能出现异常反应。在两对半指标中影响比较大的主要是检测HBsAg和抗HBs这一对。若检测这一个指标都用夹心法，则同一瓶酶标混合物中就既有抗HBs-HRP,又有抗HBsAg-HRP，它们同处一液，势必结合成免疫复合物而影响实验的正常反应。另外，采用夹心法时，包被的抗HBs和抗HBsAg又可分别与酶标液中的HBsAg-HRP和抗HBs-HRP结合，结果会出现无论检测血清HBsAg和抗HBs是(-)还是(+)，该两个小孔都显色，使结果无法判断。因此，在五合一方法上这两种指标不能同时用夹心法，只能一个指标用夹心法，另一个指标用竞争法。用竞争法的灵敏度一般比夹心法低[4]，经过多次对比实验证明，竞争法对检测HBsAg的灵敏度影响大，而对检测抗HBs的灵敏度影响较小[5]，于是选择竞争法检测抗HBs。
, http://www.100md.com
该方法的另一难度是检测抗HBc这个指标，基因工程的HBcAg不是很纯的抗原，它上面同时也存在HBeAg决定簇，这样，混合酶标液中同时有抗HBc-HRP和抗HBe-HRP，常常对实验起干扰作用，即出现抗HBc假阴性，克服五合一检测法中这种现象是本研究中的技术难题。经过大量的实验，用单克隆抗HBe封闭HBeAg，解决了抗HBc假阴性这一难题，经大量标本的对比试验，证明这种方法使五合一检测抗HBc的结果与普通法一致。
本检测法与普通的乙肝两对半酶标检测法相比有如下优点：(1)试剂盒包装小巧，运送存储方便；(2)操作方便，节省时间；(3)省略了稀释血清的操作步骤；(4)省略了实验中加中和抗原一步；(5)显色满意，对比清晰，容易观察。 参考文献
1 钱宇平，吴系科，何尚浦等主编.流行病学进展.第一版.北京：人民卫生出版社，1988.140
2 杨守纯.提高病毒性肝炎感染标志检验水平的趋势.中华医学检验杂志，1995，18(1)：5
3 染宝铎，曾 真，赵祥胜.乙型肝炎血清学标志间非特异交叉反应的研究.中华医学检验杂志，1995，18(4)：233
4 张 家.酶联法与放免法检测乙型肝炎病毒标记物的比较.临床检验杂志，1993，(2)：68
5 王东方.HBV感染血清学标志物的研究进展.国外医学流行病传染病分册，1993，(5)：198
(收稿：1999-03-17), http://www.100md.com