糖尿病患者载脂蛋白E基因多态性的检测
作者：龙建秋 吴晓兰 高 军 谷爱梅 杨书福
单位：
龙建秋 吴晓兰 高 军 谷爱梅：海军医学研究所，上海市 200433；杨书福：解放军第四一一医院
关键词：载脂蛋白E;糖尿病;基因多态性;PCR-RFLP
海军医学杂志990119 摘要 目的:评价载脂蛋白E(apoE)基因多态性与糖尿病危险性的关系。方法：采用PCR-RFLP对67例糖尿病患者和135例正常人进行apoE基因多态性检测。结果：糖尿病组ε3基因频率和ε3/3基因型频率较正常人对照组明显降低(P<0.01);ε4基因频率明显比正常人对照组增强(P<0.05)。结论：ε4基因与糖尿病危险性相关。
The Determination of Apolipoprotein E Genetic
, 百拇医药
Polymorphism in Diabetics
Long Jianqiu, Wu Xiaolan,Yang Shufu, et al
Naval Medical Research Institute,Shanghai 200433
Abstract Purpose: To evaluate the relations hip between apolipoprotein E genetic polymorphism and diabetes. Methods: apoE genetic polymorphism of 67 diabetics and 135 controls was determined by PCR-RFLP. Results: The rates of ε3 gene and ε3/3 gene in diabetics were lower than those in controls (P<0.01); the rate of ε4 gene was higher than that in controls (P<0.05).Conclusion: The results suggest that ε4 gene is related with diabetes.
, 百拇医药
Key words apoE(apolipoprotein E ); diabetes;genetic polymorphism;PCR-RFLP
目前糖尿病(diabetes mellitus,DM)的死亡率已居肿瘤、心血管病之后的第三位。据上海市统计，从1987年到1989年糖尿病患病率由1.01%上升到2.23%,即以平均每年0.10%速度上升,而新增加的DM患者主要是中老年非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者,这种趋势将随着我国老年人口比例的增加而日益加重,其中DM引起的各种慢性血管合并症是中老年DM患者致死或致残的主要原因[1]。糖尿病患者不仅有糖代谢紊乱，同时有脂代谢紊乱。载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)是血浆脂蛋白的一个重要组成部分,其基因位点具有遗传多态性,直接影响着apoE蛋白的活性。apoE蛋白在脂质代谢中起重要作用,与脂质代谢紊乱关系密切。本文测定并分析了apoE基因及基因型频率在NIDDM中的变化。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 糖尿病患者系411医院门诊或住院病人67例,男27例,女40例,年龄37～78岁。根据世界卫生组织糖尿病诊断标准均属NIDDM。对照组为海研所门诊健康体检人员135例,男95例，女40例,年龄23～70岁。
1.2 测定方法 apoE基因型测定采用PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳法[2]。
1.2.1 DNA提取 取外周静脉血500μl,加肝素抗凝,蛋白酶K消化,酚-氯仿抽提，DNA无水乙醇沉淀,真空风干溶解于适量TE中,4℃保存备用。
1.2.2 apoE目的基因DNA片段扩增 采用多聚酶链反应(polymerasechain reaction, PCR )对apoE目的基因扩增,引物按文献设计[3]。PCR反应体系总体积50μl,包括10×Buffer 5μl, 15mmol/LMgCl2 3μl, 2.5mmol/L dNTPs 4μl, DMSO5μl,引物各1μl(50pmol),标本5μl,Taq酶(promega)2u,H2O加至50μl,石蜡油20μl,离心片刻。反应条件：95℃3min, 94℃ 45s,60℃ 30s,72℃ 30s,35个循环,72℃延长5min。取5μlPCR反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,检查PCR产物。
, 百拇医药
1.2.3 apoE基因型检测 取PCR产物25μl加HhaI限制性内切酶5u,混匀,37℃酶切4h,加上样液,在4%琼脂糖凝胶电泳1～1.5h(20V/cm),根据紫外灯下观察结果确定apoE各基因型。
2 结 果
2.1 糖尿病患者67例和正常对照组135例apoE基因型测定结果 ε2/2均未检测到,糖尿病组ε3/3基因型频率明显减少(P<0.01),含ε2、ε4的杂合型频率均有增高，但无统计学意义(P>0.05)(见表1)。
表1 糖尿病患者和正常对照组apoE基因型频率比较 组 别
n
ε2/2(%)
ε3/3(%)
, 百拇医药
ε4/4(%)
ε2/3(%)
ε2/4(%)
ε3/4(%)
糖尿病组
67
0
53.73**
1.47
22.39△
4.48△
17.91△
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对照组
135
0
74.81
0
13.33
2.96
8.89
**P<0.01,*P<0.05,△P>0.05
2.2 糖尿病患者和正常对照组apoE基因频率测定结果 ε3基因频率明显减少(P<0.01)；ε2、ε4基因频率均有增高,其中ε4增高明显(P<0.05),而ε2增高统计学无意义(P>0.05)，见表2。
, 百拇医药
表2 糖尿病患者和正常对照组apoE基因频率比较 组 别
ε2
ε3
ε4
糖尿病组
13.43△
73.88**
12.67*
对照组
8.15
85.93
5.93
, 百拇医药
**P<0.01,*P<0.05,△P>0.05
3 讨 论
apoE基因遗传多态性的分子基础是源于三个等位基因ε2、ε3、ε4核苷酸的置换,即C→T,三个等位基因在3932位和4070位分别为T和T(ε2)、T和C(ε3)、C和C(ε4),造成apoE蛋白112位和158位精氨酸(CGC,Arg)和半胱氨酸(TGC,Cys)的互换,apoE2均为Cys,apoE3112位是Cys,158位是Arg,apoE4均为Arg,因而apoE4比apoE3多一个正电荷,apoE2则比apoE3少一个正电荷[4]。由于这一变化使得其对LDL受体亲和力不同,apoE4>apoE3>apoE2,从而影响脂蛋白代谢及血脂水平。
apoE基因型常见的是ε3/3、ε2/3、ε3/4，三者总和超过85%,ε2/2、ε2/4、ε4/4基因型频率很低，三者之和常低于6.2%[5]。本实验中NIDDM患者ε3/336例(53.73%),ε2/315例(22.39%),ε3/4 12例(17.91%);正常ε3/3 101例(74.81%),ε2/3 18例(13.33%),ε3/412例(8.89%),3种基因型频率略有不同。等位基因频率NIDDM组ε2 13.43%,ε3 73.88%,ε4 12.67%;正常对照组分别为8.15%、85.93%、5.93%。NIDDM组的ε3基因频率明显降低,ε4基因频率明显增高。
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Eto[6]研究发现,携ε2的NIDDM患者并发高脂血症(HLP)的频率高达73.9%,而非DM患者仅为37.5%,并且这类病人家族中HLP的发生率也很高。携ε2的NIDDM患者,血清TG水平明显增高。携ε2的NIDDM患者血浆残基颗粒水平比携ε2的非DM患者更高,可能是由于DM状态下(尤其是血糖控制不良者)富含TG的脂蛋白生成过多和/或清除减少所致。Imari[7]发现,携ε4的NIDDM患者不论血脂是否正常或有无高胆固醇血症,其并发动脉粥样硬化(AS)的频率均升高。Ukkola[8]等研究结果表明,ε4有增加大血管并发症的危险性,而ε2则有降低NIDDM大血管并发症危险性的作用。我们的实验结果发现NIDDM的ε4基因频率明显增高(P<0.05),ε3基因频率明显降低(P<0.01),提示ε4可能与NIDDM患者血管并发症危险性增加有关,进一步证实了Ukkola的结果,且TC、TG也有增加,但其机制不明。
apoE多态性与NIDDM脂质代谢紊乱及血管并发症之间有一定的联系,但对其机制尚不完全清楚,有待进一步研究。我们采用PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳法对apoE基因的多态性进行检测,既节省了时间,又便于临床推广应用,可望达到对NIDDM脂质代谢紊乱及其血管并发症预测性诊断及指导改变“危险”基因的目的,这在预防医学和流行病学上均有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1 钱荣生.加强对糖尿病及其合并症的防治研究.中华医学杂志,1993,9:515
2 吴晓兰,尹世达,龙建秋等.琼脂糖凝胶PCR-RFLP对载脂蛋白E基因型分型的方法初探.海军医学,1997,15(2):146
3 Appel E, Eisenberg S,Roiteiman J.Improved PCR amplification/HhaI res triction for unambiguous determination of apolipoprotein E alleles. Clin Chem, 1995,87(190):187
4 Rall SJ, Weisgraber KH, Mahley RW. Human apolipoprotein E.J Biol Chem ,1982,257:4171
, http://www.100md.com
5 Rall Jr SC, Mahley RW.The role of apolipoprotein E genetic variants in lipoprotein disorder.J Internal Med,1992,231(7):653
6 Eto M, Watanabe K,Sato T et al.Apolipoprotein E2 and hyperlipo-proteinemiainnon-insulin-dependent diabetes mellitus. J Clin En docrinol Metab,1989,69:1207
7 Imari Y,Koga S,Ibayashi H.Phenotypes of apolipoprotein E and abnorm alities in lipid metabolism in patients with non-insulin-dependent diabetes mell itus. Metabolism,1988,37:1134
8 Ukkola O,Kervinen K,Salmela PI et al.Apolipoprot ein E phenotype is related to macro and microangiopathy in patients with non-ins ulin-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis, 1993,101:9
(收稿:1999-02-02), 百拇医药
单位：
龙建秋 吴晓兰 高 军 谷爱梅：海军医学研究所，上海市 200433；杨书福：解放军第四一一医院
关键词：载脂蛋白E;糖尿病;基因多态性;PCR-RFLP
海军医学杂志990119 摘要 目的:评价载脂蛋白E(apoE)基因多态性与糖尿病危险性的关系。方法：采用PCR-RFLP对67例糖尿病患者和135例正常人进行apoE基因多态性检测。结果：糖尿病组ε3基因频率和ε3/3基因型频率较正常人对照组明显降低(P<0.01);ε4基因频率明显比正常人对照组增强(P<0.05)。结论：ε4基因与糖尿病危险性相关。
The Determination of Apolipoprotein E Genetic
, 百拇医药
Polymorphism in Diabetics
Long Jianqiu, Wu Xiaolan,Yang Shufu, et al
Naval Medical Research Institute,Shanghai 200433
Abstract Purpose: To evaluate the relations hip between apolipoprotein E genetic polymorphism and diabetes. Methods: apoE genetic polymorphism of 67 diabetics and 135 controls was determined by PCR-RFLP. Results: The rates of ε3 gene and ε3/3 gene in diabetics were lower than those in controls (P<0.01); the rate of ε4 gene was higher than that in controls (P<0.05).Conclusion: The results suggest that ε4 gene is related with diabetes.
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Key words apoE(apolipoprotein E ); diabetes;genetic polymorphism;PCR-RFLP
目前糖尿病(diabetes mellitus,DM)的死亡率已居肿瘤、心血管病之后的第三位。据上海市统计，从1987年到1989年糖尿病患病率由1.01%上升到2.23%,即以平均每年0.10%速度上升,而新增加的DM患者主要是中老年非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者,这种趋势将随着我国老年人口比例的增加而日益加重,其中DM引起的各种慢性血管合并症是中老年DM患者致死或致残的主要原因[1]。糖尿病患者不仅有糖代谢紊乱，同时有脂代谢紊乱。载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)是血浆脂蛋白的一个重要组成部分,其基因位点具有遗传多态性,直接影响着apoE蛋白的活性。apoE蛋白在脂质代谢中起重要作用,与脂质代谢紊乱关系密切。本文测定并分析了apoE基因及基因型频率在NIDDM中的变化。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 糖尿病患者系411医院门诊或住院病人67例,男27例,女40例,年龄37～78岁。根据世界卫生组织糖尿病诊断标准均属NIDDM。对照组为海研所门诊健康体检人员135例,男95例，女40例,年龄23～70岁。
1.2 测定方法 apoE基因型测定采用PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳法[2]。
1.2.1 DNA提取 取外周静脉血500μl,加肝素抗凝,蛋白酶K消化,酚-氯仿抽提，DNA无水乙醇沉淀,真空风干溶解于适量TE中,4℃保存备用。
1.2.2 apoE目的基因DNA片段扩增 采用多聚酶链反应(polymerasechain reaction, PCR )对apoE目的基因扩增,引物按文献设计[3]。PCR反应体系总体积50μl,包括10×Buffer 5μl, 15mmol/LMgCl2 3μl, 2.5mmol/L dNTPs 4μl, DMSO5μl,引物各1μl(50pmol),标本5μl,Taq酶(promega)2u,H2O加至50μl,石蜡油20μl,离心片刻。反应条件：95℃3min, 94℃ 45s,60℃ 30s,72℃ 30s,35个循环,72℃延长5min。取5μlPCR反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,检查PCR产物。
, 百拇医药
1.2.3 apoE基因型检测 取PCR产物25μl加HhaI限制性内切酶5u,混匀,37℃酶切4h,加上样液,在4%琼脂糖凝胶电泳1～1.5h(20V/cm),根据紫外灯下观察结果确定apoE各基因型。
2 结 果
2.1 糖尿病患者67例和正常对照组135例apoE基因型测定结果 ε2/2均未检测到,糖尿病组ε3/3基因型频率明显减少(P<0.01),含ε2、ε4的杂合型频率均有增高，但无统计学意义(P>0.05)(见表1)。
表1 糖尿病患者和正常对照组apoE基因型频率比较 组 别
n
ε2/2(%)
ε3/3(%)
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ε4/4(%)
ε2/3(%)
ε2/4(%)
ε3/4(%)
糖尿病组
67
0
53.73**
1.47
22.39△
4.48△
17.91△
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对照组
135
0
74.81
0
13.33
2.96
8.89
**P<0.01,*P<0.05,△P>0.05
2.2 糖尿病患者和正常对照组apoE基因频率测定结果 ε3基因频率明显减少(P<0.01)；ε2、ε4基因频率均有增高,其中ε4增高明显(P<0.05),而ε2增高统计学无意义(P>0.05)，见表2。
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表2 糖尿病患者和正常对照组apoE基因频率比较 组 别
ε2
ε3
ε4
糖尿病组
13.43△
73.88**
12.67*
对照组
8.15
85.93
5.93
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**P<0.01,*P<0.05,△P>0.05
3 讨 论
apoE基因遗传多态性的分子基础是源于三个等位基因ε2、ε3、ε4核苷酸的置换,即C→T,三个等位基因在3932位和4070位分别为T和T(ε2)、T和C(ε3)、C和C(ε4),造成apoE蛋白112位和158位精氨酸(CGC,Arg)和半胱氨酸(TGC,Cys)的互换,apoE2均为Cys,apoE3112位是Cys,158位是Arg,apoE4均为Arg,因而apoE4比apoE3多一个正电荷,apoE2则比apoE3少一个正电荷[4]。由于这一变化使得其对LDL受体亲和力不同,apoE4>apoE3>apoE2,从而影响脂蛋白代谢及血脂水平。
apoE基因型常见的是ε3/3、ε2/3、ε3/4，三者总和超过85%,ε2/2、ε2/4、ε4/4基因型频率很低，三者之和常低于6.2%[5]。本实验中NIDDM患者ε3/336例(53.73%),ε2/315例(22.39%),ε3/4 12例(17.91%);正常ε3/3 101例(74.81%),ε2/3 18例(13.33%),ε3/412例(8.89%),3种基因型频率略有不同。等位基因频率NIDDM组ε2 13.43%,ε3 73.88%,ε4 12.67%;正常对照组分别为8.15%、85.93%、5.93%。NIDDM组的ε3基因频率明显降低,ε4基因频率明显增高。
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Eto[6]研究发现,携ε2的NIDDM患者并发高脂血症(HLP)的频率高达73.9%,而非DM患者仅为37.5%,并且这类病人家族中HLP的发生率也很高。携ε2的NIDDM患者,血清TG水平明显增高。携ε2的NIDDM患者血浆残基颗粒水平比携ε2的非DM患者更高,可能是由于DM状态下(尤其是血糖控制不良者)富含TG的脂蛋白生成过多和/或清除减少所致。Imari[7]发现,携ε4的NIDDM患者不论血脂是否正常或有无高胆固醇血症,其并发动脉粥样硬化(AS)的频率均升高。Ukkola[8]等研究结果表明,ε4有增加大血管并发症的危险性,而ε2则有降低NIDDM大血管并发症危险性的作用。我们的实验结果发现NIDDM的ε4基因频率明显增高(P<0.05),ε3基因频率明显降低(P<0.01),提示ε4可能与NIDDM患者血管并发症危险性增加有关,进一步证实了Ukkola的结果,且TC、TG也有增加,但其机制不明。
apoE多态性与NIDDM脂质代谢紊乱及血管并发症之间有一定的联系,但对其机制尚不完全清楚,有待进一步研究。我们采用PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳法对apoE基因的多态性进行检测,既节省了时间,又便于临床推广应用,可望达到对NIDDM脂质代谢紊乱及其血管并发症预测性诊断及指导改变“危险”基因的目的,这在预防医学和流行病学上均有重要意义。
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参考文献
1 钱荣生.加强对糖尿病及其合并症的防治研究.中华医学杂志,1993,9:515
2 吴晓兰,尹世达,龙建秋等.琼脂糖凝胶PCR-RFLP对载脂蛋白E基因型分型的方法初探.海军医学,1997,15(2):146
3 Appel E, Eisenberg S,Roiteiman J.Improved PCR amplification/HhaI res triction for unambiguous determination of apolipoprotein E alleles. Clin Chem, 1995,87(190):187
4 Rall SJ, Weisgraber KH, Mahley RW. Human apolipoprotein E.J Biol Chem ,1982,257:4171
, http://www.100md.com
5 Rall Jr SC, Mahley RW.The role of apolipoprotein E genetic variants in lipoprotein disorder.J Internal Med,1992,231(7):653
6 Eto M, Watanabe K,Sato T et al.Apolipoprotein E2 and hyperlipo-proteinemiainnon-insulin-dependent diabetes mellitus. J Clin En docrinol Metab,1989,69:1207
7 Imari Y,Koga S,Ibayashi H.Phenotypes of apolipoprotein E and abnorm alities in lipid metabolism in patients with non-insulin-dependent diabetes mell itus. Metabolism,1988,37:1134
8 Ukkola O,Kervinen K,Salmela PI et al.Apolipoprot ein E phenotype is related to macro and microangiopathy in patients with non-ins ulin-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis, 1993,101:9
(收稿:1999-02-02), 百拇医药