载脂蛋白E遗传多态性及其与疾病的关系
作者：吴晓兰 龙建秋
单位：吴晓兰(海军医学研究所，上海市 200433)；龙建秋(海军医学研究所，上海市 200433)
关键词：载脂蛋白E；基因型；糖尿病；冠心病；PCR-RFLP
海军医学杂志000113 摘 要：目的：分析载脂蛋白E遗传多态性及其与疾病的关系。方法：采用PCR-RFLP的方法，检测了67例糖尿病患者、114例冠心病患 者及135例正常人ApoE基因型。结果：在基因型频率比较中，糖尿病和冠心病患者组ε3/3基因型频率均有明显下降，其中冠心病患者组ε3/4基因型频率明显升高；在基因频率比较中，二组ε4基因频率均有明显上升，ε3基因频率均有明显下降。结论：以上数据表明ApoE的ε4等位基因可能为糖尿病、冠心病的生物性风险因子，ε3/4基因型与冠心病密切相关。
The Relations between Apolipoprotein E Polymorphism and Diseases
, 百拇医药
Wu Xiaolan and Long Jianqiu
(Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433)
Abstract：Objective：To investigate the influence of a polipoprotein E polymorphism on diabetes mellitus(DM) and coronary heart disease (CHD). Methods：By using PCR-RFLP agarose electrophoresis, the three common alleles of the apolipoprotein E gene were determined in 67 pat ients with DM and 114 patients with CHD and 135 healthy subjects. Results：Compared with the healthy subjects,ε3/3 genotype and ε3 freq uency were significantly decreased in DM and CHD groups, ε3/4 genotype and ε4 frequency were increased in the CHD group. Conclusion：The se data indicate apolipoprotein Eε4 allele is a biological risk factor for CHD and DM, and ε3/4 genotype may be associated with CHD.
, 百拇医药
Key words：apolipoprotein E; genotype; diabetes mellitus; coronary heart disease; PCR-RFLP▲
载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)是血浆乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和 高密度脂蛋白(HDL)的重要组成成分。ApoE作为ApoE受体(CM残基受体)与低密度脂蛋白(LDL) 受体(ApoBE受体)的配基，能高亲和性地与这两种受体结合；又是脂蛋白代谢酶辅因子，由 此介导含ApoE脂蛋白的细胞内吞与降解，调节脂代谢[1]。其基因位点具有遗传多 态性，直接影响着ApoE蛋白的活性。ApoE蛋白在脂质代谢中起重要作用，与脂质代谢紊乱、 糖尿病、冠心病等关系密切[2～4]。本文测定了67例糖尿病患者、114例冠心病患 者及135例正常人的ApoE基因型和等位基因频率分布情况，并比较各组之间的差异，现报告 如下：
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1 研究对象
1.1 糖尿病患者组(DM) 糖尿病患者67例，男27例，女40例，年龄37～78岁。根 据世界卫生组织糖尿病诊断标准均属非胰岛素依赖型糖尿病，即Ⅱ型糖尿病(NIDDM)。
1.2 冠心病患者组(CHD) 冠心病患者114例，男60例，女54例，年龄21 ～78岁。诊断依据冠状动脉造影(至少有1支血管管腔狭窄≥50%)或有明确的心肌梗塞史。
1.3 正常对照组(N) 正常人135例，男95例，女40例，年龄23～70岁。 经体检和常规心电图检查正常者。
2 测定方法
2.1 DNA提取 酚-氯仿法。
2.2 ApoE目的基因DNA片段扩增 采用多聚酶链反应(PCR)法，引物按文献制备 [6]。
, 百拇医药
2.3 ApoE基因型检测 取PCR产物加HhaI限制性内切酶，37℃酶切4h，加上样液 ，在4%琼脂糖凝胶电泳1～1.5h(20V/cm)，紫外灯下观察结果，根据每个ApoE等位基因产生 其本身特异的片段[6]是ε2：91、83、38和19bp；ε3：91、48、38、35和19bp； ε4：72、48、38、35和19bp，来确定ApoE基因型。
3 结 果
3.1 糖尿病患者、冠心病患者和正常对照组ApoE基因型测定结果见表1。ε2/2基因型三 组均未测到，糖尿病和冠心病患者组ε3/3基因型频率均较正常对照组有明显下降，另外， 冠心病患者ε3/4杂合型频率明显增高。
表1 DM、CHD和正常人ApoE基因型分布频率比较 组别
n
, 百拇医药
ε2/2(%)
ε3/3(%)
ε4/4(%)
ε2/3(%)
ε2/4(%)
ε3/4(%)
DM
67
0
53.73**
1.47
22.39△
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4.48△
1 7.91△
CHD
114
0
63.16*
0.88
13.16
5.26△[ 〗17.54*
N
135
, http://www.100md.com
0
74.81
0
13.33
2.96
8.89
与正常对照组相比 **P<0.01， * P<0.05， △ P>0.05
3.2 糖尿病患者、冠心病患者和正常对照组ApoE基因频率比较结果见表2。其中糖尿病和 冠心病患者组的ε3基因频率均有明显减少，ε4基因频率均有明显升高。
表2 DM、CHD和正常人ApoE基因频率比较 组别
, http://www.100md.com
ε2(%)
ε3(%)
ε4(%)
DM
13.43△
73.88**
12.67*
CHD
9.21
78.51*
12.28*
, http://www.100md.com
N
8.15
85.93
5.93
与正常对照组相比** P<0.01, * P<0.05, △ P>0.05
4 讨 论
ApoE基因遗传具有多态性，其多态性的分子基础是源于三个等位基因ε2、ε3、ε4单个核 苷酸的置换，即C→T，三个等位基因在3 932位和4 070位分别为T和T(ε2)、T和C(ε3)、C 和C(ε4)，造成ApoE蛋白112位和158位精氨酸(CGC，Arg)和半胱氨酸(TGC，Cys)的互换，Ap oE2均为Cys,ApoE3 112位是Cys，158位是Arg,ApoE4均为Arg，因而ApoE4比ApoE3多一个正电 荷，ApoE2则比ApoE3少一个正电荷[7]。由于这一变化使得其对LDL受体亲和力不 同 ，ApoE4>ApoE3>ApoE2，从而影响脂蛋白代谢及血脂水平。大量人群调查说明ApoE等位基因 影响血浆脂质浓度：ε4等位基因的一般作用是可以显著升高健康人群的总胆固醇(TC)浓度 ，使之易患动脉粥样硬化；相反ε2等位基因的一般作用是降低TC浓度。此外，还发现ε2和 ε4等位基因可能与一般人群中血浆甘油三酯(TG)浓度的增加有关[8]。
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Imari[9]发现携ε4的NIDDM患者不论血脂是否正常或有无高胆固醇血症，其并发 动脉粥样硬化的频率均升高。Ukkola[10]等研究结果表明，ε4有增加NIDDM 大血管并发症的危险性，而ε2则有降低NIDDM大血管并发症危险性的作用。本实验结果表明 ，NIDDM患者ε3/3基因型频率较正常对照组有极显著的下降(P<0.01)， ε2/3、ε2/4、ε3/4基因型频率均有上升，但统计学无意义(P>0.05)；在基因频率比较中(见表2)，NIDDM的ε3基因频率较正常人极显著下降(P<0.01) ，ε4基因频率显著性上升(P<0.05)，这一变化可能与NIDDM 患者血管并发症危险性增加有关，但其机制不明。
由表1可见，CHD患者组ε2/4与ε3/4基因型频率增高，其中ε2/4基因型频率增高统计学无 意义(P>0.05)，可能与标本量不大等有关；在表2基因频率比较中显示C HD患者组的ε4基因频率明显高于正常对照组(P<0.05)，该结果与Peter 等[11]的研究结果一致，无疑提示ε4是CHD的危险性遗传标志。CHD患者组的ε4 基因频率明显增高，很可能是由于ε4等位基因的产物ApoE4显著升高血浆TC浓度，促进动脉 粥样硬化形成，导致CHD的发生。但其机制尚不完全清楚，有待进一步研究。
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总之，ApoE多态性与NIDDM脂质代谢紊乱及血管并发症、CHD之间有一定的联系，希冀通过对 大量人群的ApoE基因型的检测，并调节饮食或药物控制来达到对这些疾病及其相关的血管并 发症的早期预测预防的目的，这在预防医学和流行病学调查上有重要的意义。
参考文献：
[1]Davignon J, Gregg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphism and ather osclerosis. Atherosclerosis, 1988, 8:1
[2]Brown MS, Goldstein JL. A recepter-mediated pathway for cholesterol h omeostasis. Science, 1986, 232:34
[3]Hixson JE. Apolipoprotein E polymorphisms affect atherosclerosis in yo ung males. Arterioscler Tromb, 1991, 11:1237
, 百拇医药
[4]向光大.载脂蛋白E多态性与糖尿病.国外医学*内分泌学分册，1995，15(1): 17
[5]吴晓兰、尹世达、龙建秋等.琼脂糖凝胶电泳PCR-RFLP对载脂蛋白E基因型分型的 方法初探.海军医学，1997，15(2): 146
[6]Appel E, Eisenberg S, Roiteiman J. Improved PCR amplification/HhaI res triction for unambiguous determination of apolipoprotein E alleles. Clin Chem, 1995, 87(190):187
[7]Rall SJ, Weisgraber KH, Mahley RW. Human apolipoprotein E. J Biol Chem , 1982, 257: 4171
, 百拇医药
[8]Boerwinkle E, Visvikis S, Welsh D et al. The use of mea sured genotype information in the analysis of quantitative phenotype in man. Am Med Genet, 1987, 27(3): 567
[9]Imari Y, Koga S, Ibayashi H. Phenotypes of apolipoprotein E and abnorm alities in lipid metabolism in patients with non-insulin-dependent diabetes me llitus. Metabolism, 1988, 37:1134
[10]Ukkola O, Kervinen K, Salmela PI et al. Apolipoprotein E phenotype is related to macro and microangiopathy in patients with non-insul in-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis, 1993, 101:9
[11]Peter WF, Richard H, Martin G et al. Apolipoprotein E alleles, dyslipidemia, and coronary heart disease. 美国医学会杂志(中文版)，1995, 14(3):136
收稿日期：1999-06-28, 百拇医药
单位：吴晓兰(海军医学研究所，上海市 200433)；龙建秋(海军医学研究所，上海市 200433)
关键词：载脂蛋白E；基因型；糖尿病；冠心病；PCR-RFLP
海军医学杂志000113 摘 要：目的：分析载脂蛋白E遗传多态性及其与疾病的关系。方法：采用PCR-RFLP的方法，检测了67例糖尿病患者、114例冠心病患 者及135例正常人ApoE基因型。结果：在基因型频率比较中，糖尿病和冠心病患者组ε3/3基因型频率均有明显下降，其中冠心病患者组ε3/4基因型频率明显升高；在基因频率比较中，二组ε4基因频率均有明显上升，ε3基因频率均有明显下降。结论：以上数据表明ApoE的ε4等位基因可能为糖尿病、冠心病的生物性风险因子，ε3/4基因型与冠心病密切相关。
The Relations between Apolipoprotein E Polymorphism and Diseases
, 百拇医药
Wu Xiaolan and Long Jianqiu
(Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433)
Abstract：Objective：To investigate the influence of a polipoprotein E polymorphism on diabetes mellitus(DM) and coronary heart disease (CHD). Methods：By using PCR-RFLP agarose electrophoresis, the three common alleles of the apolipoprotein E gene were determined in 67 pat ients with DM and 114 patients with CHD and 135 healthy subjects. Results：Compared with the healthy subjects,ε3/3 genotype and ε3 freq uency were significantly decreased in DM and CHD groups, ε3/4 genotype and ε4 frequency were increased in the CHD group. Conclusion：The se data indicate apolipoprotein Eε4 allele is a biological risk factor for CHD and DM, and ε3/4 genotype may be associated with CHD.
, 百拇医药
Key words：apolipoprotein E; genotype; diabetes mellitus; coronary heart disease; PCR-RFLP▲
载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)是血浆乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和 高密度脂蛋白(HDL)的重要组成成分。ApoE作为ApoE受体(CM残基受体)与低密度脂蛋白(LDL) 受体(ApoBE受体)的配基，能高亲和性地与这两种受体结合；又是脂蛋白代谢酶辅因子，由 此介导含ApoE脂蛋白的细胞内吞与降解，调节脂代谢[1]。其基因位点具有遗传多 态性，直接影响着ApoE蛋白的活性。ApoE蛋白在脂质代谢中起重要作用，与脂质代谢紊乱、 糖尿病、冠心病等关系密切[2～4]。本文测定了67例糖尿病患者、114例冠心病患 者及135例正常人的ApoE基因型和等位基因频率分布情况，并比较各组之间的差异，现报告 如下：
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1 研究对象
1.1 糖尿病患者组(DM) 糖尿病患者67例，男27例，女40例，年龄37～78岁。根 据世界卫生组织糖尿病诊断标准均属非胰岛素依赖型糖尿病，即Ⅱ型糖尿病(NIDDM)。
1.2 冠心病患者组(CHD) 冠心病患者114例，男60例，女54例，年龄21 ～78岁。诊断依据冠状动脉造影(至少有1支血管管腔狭窄≥50%)或有明确的心肌梗塞史。
1.3 正常对照组(N) 正常人135例，男95例，女40例，年龄23～70岁。 经体检和常规心电图检查正常者。
2 测定方法
2.1 DNA提取 酚-氯仿法。
2.2 ApoE目的基因DNA片段扩增 采用多聚酶链反应(PCR)法，引物按文献制备 [6]。
, 百拇医药
2.3 ApoE基因型检测 取PCR产物加HhaI限制性内切酶，37℃酶切4h，加上样液 ，在4%琼脂糖凝胶电泳1～1.5h(20V/cm)，紫外灯下观察结果，根据每个ApoE等位基因产生 其本身特异的片段[6]是ε2：91、83、38和19bp；ε3：91、48、38、35和19bp； ε4：72、48、38、35和19bp，来确定ApoE基因型。
3 结 果
3.1 糖尿病患者、冠心病患者和正常对照组ApoE基因型测定结果见表1。ε2/2基因型三 组均未测到，糖尿病和冠心病患者组ε3/3基因型频率均较正常对照组有明显下降，另外， 冠心病患者ε3/4杂合型频率明显增高。
表1 DM、CHD和正常人ApoE基因型分布频率比较 组别
n
, 百拇医药
ε2/2(%)
ε3/3(%)
ε4/4(%)
ε2/3(%)
ε2/4(%)
ε3/4(%)
DM
67
0
53.73**
1.47
22.39△
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4.48△
1 7.91△
CHD
114
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63.16*
0.88
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5.26△[ 〗17.54*
N
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0
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与正常对照组相比 **P<0.01， * P<0.05， △ P>0.05
3.2 糖尿病患者、冠心病患者和正常对照组ApoE基因频率比较结果见表2。其中糖尿病和 冠心病患者组的ε3基因频率均有明显减少，ε4基因频率均有明显升高。
表2 DM、CHD和正常人ApoE基因频率比较 组别
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ε2(%)
ε3(%)
ε4(%)
DM
13.43△
73.88**
12.67*
CHD
9.21
78.51*
12.28*
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N
8.15
85.93
5.93
与正常对照组相比** P<0.01, * P<0.05, △ P>0.05
4 讨 论
ApoE基因遗传具有多态性，其多态性的分子基础是源于三个等位基因ε2、ε3、ε4单个核 苷酸的置换，即C→T，三个等位基因在3 932位和4 070位分别为T和T(ε2)、T和C(ε3)、C 和C(ε4)，造成ApoE蛋白112位和158位精氨酸(CGC，Arg)和半胱氨酸(TGC，Cys)的互换，Ap oE2均为Cys,ApoE3 112位是Cys，158位是Arg,ApoE4均为Arg，因而ApoE4比ApoE3多一个正电 荷，ApoE2则比ApoE3少一个正电荷[7]。由于这一变化使得其对LDL受体亲和力不 同 ，ApoE4>ApoE3>ApoE2，从而影响脂蛋白代谢及血脂水平。大量人群调查说明ApoE等位基因 影响血浆脂质浓度：ε4等位基因的一般作用是可以显著升高健康人群的总胆固醇(TC)浓度 ，使之易患动脉粥样硬化；相反ε2等位基因的一般作用是降低TC浓度。此外，还发现ε2和 ε4等位基因可能与一般人群中血浆甘油三酯(TG)浓度的增加有关[8]。
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Imari[9]发现携ε4的NIDDM患者不论血脂是否正常或有无高胆固醇血症，其并发 动脉粥样硬化的频率均升高。Ukkola[10]等研究结果表明，ε4有增加NIDDM 大血管并发症的危险性，而ε2则有降低NIDDM大血管并发症危险性的作用。本实验结果表明 ，NIDDM患者ε3/3基因型频率较正常对照组有极显著的下降(P<0.01)， ε2/3、ε2/4、ε3/4基因型频率均有上升，但统计学无意义(P>0.05)；在基因频率比较中(见表2)，NIDDM的ε3基因频率较正常人极显著下降(P<0.01) ，ε4基因频率显著性上升(P<0.05)，这一变化可能与NIDDM 患者血管并发症危险性增加有关，但其机制不明。
由表1可见，CHD患者组ε2/4与ε3/4基因型频率增高，其中ε2/4基因型频率增高统计学无 意义(P>0.05)，可能与标本量不大等有关；在表2基因频率比较中显示C HD患者组的ε4基因频率明显高于正常对照组(P<0.05)，该结果与Peter 等[11]的研究结果一致，无疑提示ε4是CHD的危险性遗传标志。CHD患者组的ε4 基因频率明显增高，很可能是由于ε4等位基因的产物ApoE4显著升高血浆TC浓度，促进动脉 粥样硬化形成，导致CHD的发生。但其机制尚不完全清楚，有待进一步研究。
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总之，ApoE多态性与NIDDM脂质代谢紊乱及血管并发症、CHD之间有一定的联系，希冀通过对 大量人群的ApoE基因型的检测，并调节饮食或药物控制来达到对这些疾病及其相关的血管并 发症的早期预测预防的目的，这在预防医学和流行病学调查上有重要的意义。
参考文献：
[1]Davignon J, Gregg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphism and ather osclerosis. Atherosclerosis, 1988, 8:1
[2]Brown MS, Goldstein JL. A recepter-mediated pathway for cholesterol h omeostasis. Science, 1986, 232:34
[3]Hixson JE. Apolipoprotein E polymorphisms affect atherosclerosis in yo ung males. Arterioscler Tromb, 1991, 11:1237
, 百拇医药
[4]向光大.载脂蛋白E多态性与糖尿病.国外医学*内分泌学分册，1995，15(1): 17
[5]吴晓兰、尹世达、龙建秋等.琼脂糖凝胶电泳PCR-RFLP对载脂蛋白E基因型分型的 方法初探.海军医学，1997，15(2): 146
[6]Appel E, Eisenberg S, Roiteiman J. Improved PCR amplification/HhaI res triction for unambiguous determination of apolipoprotein E alleles. Clin Chem, 1995, 87(190):187
[7]Rall SJ, Weisgraber KH, Mahley RW. Human apolipoprotein E. J Biol Chem , 1982, 257: 4171
, 百拇医药
[8]Boerwinkle E, Visvikis S, Welsh D et al. The use of mea sured genotype information in the analysis of quantitative phenotype in man. Am Med Genet, 1987, 27(3): 567
[9]Imari Y, Koga S, Ibayashi H. Phenotypes of apolipoprotein E and abnorm alities in lipid metabolism in patients with non-insulin-dependent diabetes me llitus. Metabolism, 1988, 37:1134
[10]Ukkola O, Kervinen K, Salmela PI et al. Apolipoprotein E phenotype is related to macro and microangiopathy in patients with non-insul in-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis, 1993, 101:9
[11]Peter WF, Richard H, Martin G et al. Apolipoprotein E alleles, dyslipidemia, and coronary heart disease. 美国医学会杂志(中文版)，1995, 14(3):136
收稿日期：1999-06-28, 百拇医药