褪黑素对过氧亚硝基反应体系的调控
作者：张慧 汪家春 沈俊 陈季武
单位：张慧 汪家春 沈俊(海军医学研究所，上海 200433)；陈季武(华东师范大学生物系)
关键词：过氧亚硝基(ONOO-)；褪黑素(MT)；一氧化氮(NO)； 超氧阴离子()；自由基；化学发光
海军医学杂志000204 摘要 目的：通过检测MT对ONOO-、NO、
的影响，探讨MT对过氧亚硝基反应体系的调控作用。方法： 采用多种化学发光体系在体外检测。结果：MT对ONOO-有很好的清 除效应(IC50=15 μg/ml)，对有较好的清除作用(IC50=230 μg/ml)，但对NO无清除作用；结论：MT可能通过对 过氧亚硝基反应体系的调控，参与机体对NO代谢平衡的激素水平调节。
, 百拇医药
中图分类号 Q576 文献标识码 A 文章编号 1009-0754(2 000)02-0106-03
Effect of MT on the Reactive System of Peroxynitrite
ZHANG Hui, CHEN Ji-wu, WANG Jia-chun, et al
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Aim: To investigate the effect of melatonin on the ONOO-、NO and, and study the effect of mel ato nin on the reactive system of peroxynitrite. Methods: Exte rnal Measurement was made by several chemiluminescence analytic systems. Results: The pineal neurohormone melatonin could effectively scav enge peroxynitrite (IC50=15 μg/ml) and superoxide (IC50=230 μg/m l) , but was of little effect on nitric oxide. Conclusion: Me latonin might be involved in the regulation of nitric oxide level in the body.
, 百拇医药
Key words peroxynitrite; melatonin; nitric oxide; sup eroxide; free radical; chemiluminescence
过氧亚硝基(ONOO-)是一氧化氮(NO)和超氧阴离子() 结合 或进一步反应生成的[1，2]，反应速率已接近于受控制的弥散极限，生成的ONOO -在碱性环境下是相对稳定的[3]。而在生理条件下(37 ℃、pH 7.4)，ONOO- 可快 速质子化产生其共轭酸过氧亚硝酸(ONOOH)，ONOO-与ONOOH维持平衡，ONOOH可再生成亚硝 酸盐和硝酸盐。随着对NO研究的逐步深入，已有不少研究发现ONOO-是NO产生病理损伤作 用的主要环节。目前认为ONOO-是较NO及氧化作用更强， 作用范围更广的氧化剂[4]。
, 百拇医药
褪黑素(Melatonin, MT)的化学名为N-乙酰-5-甲氧基-色胺，是松果腺分泌的一种重要激素 。MT有较强的清除多种活性氧的作用[5]。本实验采用多种化学发光体系，在体外 分别检测MT对过氧亚硝基反应体系中的ONOO-、NO和的作 用，以探讨MT对过氧亚硝基反应体系的调控，进而研究MT在机体内对NO代谢的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
MT、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、鲁米诺、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、二氢碱性蕊香红系Sigma产品 ；其他试剂均系国产分析纯。
1.2 仪器
SHB-1型生物化学发光测试仪(上海技术监督局工厂产品)；日立F-3000荧光分光光度计(日本 日立公司产品)。
, 百拇医药
1.3 实验方法
1.3.1 产生的化学发光体系
参考胡天喜等人的方法[6]，采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生的化学发光体系。用pH 7.8磷酸盐缓冲液(PBS)配制0.05 mN黄嘌呤溶液，黄嘌呤 氧 化酶用PBS稀释成0.29 U/ml。鲁米诺先用PBS悬浮再加微量的二乙胺全部溶解，调pH至7.8 ， 用时用PBS稀释成10-4 N。将800 μl黄嘌呤溶液、100 μl含0～400 μg的MT(用PBS 配制) 、鲁米诺50 μl混匀于测试管中，而后注入50 μl黄嘌呤氧化酶，静置10 s后测10 s内的积 分发光强度(counts of per 10 seconds，简称CP10S)。
, http://www.100md.com
1.3.2 NO的荧光法检测体系
根据NO在酸性条件下(pH 1)与NAC反应生成亚硝基硫醇，通过内过滤效应干扰硫酸奎宁荧光 强 度的原理，参考文献[7]，将1 ml用0.1 N硫酸配制成的10-3 N的NAC冷溶液加入到 0.5 ml 1.2×10-3 N亚硝酸钠和0.5 ml由含有4～100 μg MT(对照组用0.1 N硫酸)用0.1 N硫酸 配制成的样品液的冷溶液中，充分振荡，混匀后冰浴45 min，然后加入20 μl 1.2×10 -5 N硫酸奎宁。以2ml 0.1 N硫酸+20 μl硫酸奎宁作为空白。用荧光分光光度计在EX334 nm 、EM453 nm条件下检测荧光强度。
1.3.3 ONOO-的荧光法检测体系
根据ONOO-可把二氢碱性蕊香红123氧化为碱性蕊香红123，碱性蕊香红123可发出荧光的原 理，参考文献[8]，把5 μM ONOO-加入到含10 μM二氢碱性蕊香红123的PBS(已加入0 ～3 00 μg MT)中，22 ℃恒温10 min后，用荧光分光光度计在EX500 nm、EM536 nm条件下测荧 光强度。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 MT对的清除作用(见表1)
表1 MT对的清除作用(n=3) MT(μg/ml)
发光值(CP10S)
抑制率(%)
0
12 299
±
112
0
, 百拇医药
25
11 120
±
81
9.6
50
10 440
±
61
15.1
100
9 347
±
, 百拇医药
83
24.0
200
6 729
±
99
45.3
400
4 084
±
185
66.8
由表1可知，MT可以高效清除，并呈剂量依赖效应。根 据表1绘制曲线，可得MT的IC50=230μg/ml，和陈季武[5]等人采用邻苯三 酚自氧化体系测得的结果一致。
, http://www.100md.com
2.2 MT对NO的影响
采用NO的荧光法检测结果表明，MT对NO无任何清除作用。
2.3 MT对ONOO-的清除作用(见表2))表2 MT对ONOO-的清除作用(n=5) MT(μg/ml)
荧光强度(F)
抑制率(%)
0
23.7
±
0.3
0
1
, 百拇医药
21.1
±
0.2
11.0
10
12.7
±
0.4
46.5
100
6.3
±
0.5
, 百拇医药 73.4
300
2.9
±
0.4
87.8
由表2可知，MT有清除ONOO-的作用，浓度越高测得碱性蕊香红 123的荧光强度越弱。 根据表2绘制曲线，可得15 μg/ml的MT可抑制50%的ONOO-对二氢碱性蕊香红 123的氧化作 用，即MT的IC50=15 μg/ml。加样顺序颠倒对结果无影响，说明MT通过清除ONOO -来抑制二氢碱性蕊香红 123的氧化。
3 讨 论
, 百拇医药
ONOO-在休克、缺血-再灌注损伤、败血症、胰岛素依赖性糖尿病、动脉硬化、肺纤维化及 感染炎症等疾病发生中起重要作用[4]。ONOO-与NO、三者形成了一个相互联系的自由基反应体系，在生理和病理作用上存在复杂的联系， 且三者均在体内众多的生理及病理过程中发挥重要的作用。一些研究者对NO和生成ONOO-有下述看法[9，10]：(1)清除NO并减轻的生物活性；(2)NO捕获，起到抗的保护作用；(3)与NO结合起调 制NO的作用；(4)与NO结合生成ONOO-，加强它们的致病作 用；(5)过量可减少ONOO-的生成；(6)外源性给予NO可减 轻ONOO-引起的氧化损伤作用。总之，它们三者是相互制约又相互调制的。本实验发现，M T对有高效的清除作用，可减轻对机体造成的损伤，并能加强NO的生物活性；MT与NO对 的协同作用，可进一步提高机体的抗能力。ONOO-是及NO引起损伤作用的主要中介物质，也是NO生成过多而呈现毒性 效应的原因之一。本实验发现，MT可高效清除ONOO-，一定程度上减轻了ONOO-的细胞毒 性作用，维持细胞正常机能和代谢平衡；同时MT通过对ONOO-的清除，也间接减轻了NO和的致病作用。
, 百拇医药
ONOO-的作用和反应明显受机体内理化环境的影响。在血浆中ONOO-可氧化抗坏血酸、维 生素E、尿酸、某些芳香族氨基酸和血浆蛋白巯基，这些物质可以看成是ONOO-的清除剂， 在这些物质存在的情况下ONOO-起类似于NO供体的作用[10]。MT作为机体神经 系统分泌的ONOO-清除剂，同样能起到NO供体的作用，而且在内环境不断变化的情况下机 体通过自身的调节机制，调节MT的分泌，进而调制ONOO-生物活性和防护ONOO-对机体可 能的危害。本实验发现，MT不清除NO，从一定程度来讲反而是NO的供体，并通过参与ONOO -与NO和反应体系的调控，调节三者的生理浓度和生物学效 应，有利于发挥NO正常的生理功能，减轻NO对机体的细胞毒性作用。
, 百拇医药 机体内酶氧化失活、脂质过氧化、DNA裂解、能量代谢失衡，与ONOO-和等自由基的病理性损伤作用以及自由基代谢的紊乱密不可分。H2O2增多 可延长ONOO-的半衰期，增强NO的细胞毒性作用，而MT也能很好的清除H2O2[ 5]；同时MT在机体内能清除其它自由基[6](如OH、1O2等)。随着年龄 增大，松果腺钙化增加，MT生物合成与分泌下降，适当补充外源性的MT是有意义的。
NO是一种重要的生物信息传递体，在调节心血管系统、免疫系统、和神经系统功能方面起了 重要作用。在机体内环境不断变化，影响NO作用及ONOO-效应的因素众多的情况下，过氧 亚硝基反应体系可对各种情况造成的NO生成过多加以调节，本实验发现，MT通过调控过氧亚 硝基反应体系和清除其它干扰自由基保护NO，间接地为机体提供NO，可使NO在机体内维持正 常的生理浓度。ONOO-与NO和之间由过氧亚硝基反应体系 形成相互制约又相互调制的关系，MT可调控过氧亚硝基反应体系，而机体通过各系统对机体 内理化因素的反应调节松果腺分泌MT，可能是机体对NO代谢的激素水平调节机制之一。通过 本研究，我们推测，在一些疾病发病过程中，以NO制剂与MT合理配伍进行治疗，似有其临床 意义，对此仍有待于进一步探讨。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathphysidog y, and pharmalogy. Pharmacol Rev, 1991, 43:109
2，Beckmnn JS, Beckmann TW, Chen J et al. Apparent hydroxy l radical production by peroxynitrite: Implications for endothelial injury form nitric peroxynitrite: Implications for endothelial injury form nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:1620
3，Beckmann JS, Koppenal WH. Nitric oxide, supperoxide, and peroxynite : the good the bad, and the ugly. Am J Physiol, 1996, 271:1424
, http://www.100md.com
4，Pryor WA, Squadrito GL. The chemistry of peroxynitrite: a product from the reacton of nitric oxide with superoxide. Am J Physiol, 1995, 268: 699
5，陈季武，朱振勤，张 慧.褪黑素清除活性氧作用的研究.发光学报，1998，19(1 )：66
6，胡天喜，陈季武.用化学发光法检测丹参、红藤、当归、黄芪等中药制剂的抗自 由基作用.上海中医药杂志，1988，9：28
7，卫 国，张均田.荧光分析法测定大鼠脑组织一氧化氮和一氧化氮合成酶.药学学 报，1996，31(7)：530
8，Eli Gilad, Salvatore Cuzzocrea, Basilia Zingarelli et al. Melatonin is a scavenger of peroxynitrite. Life Sciences, 1997, 60:169
9，Rubbo H, Radi R, Trujillo M et al. Nitric oxide regulat ion of superoxide and peroxynitrite dependent lipid peroxidation. J Biol Che m, 1994, 269:26066
10，凌亦凌，黄善生，谷振勇.过氧亚硝基阳离子的细胞代谢及病理损伤作用.生理 学进展，1997，30(1)：70
(收稿：2000-01-21), http://www.100md.com
单位：张慧 汪家春 沈俊(海军医学研究所，上海 200433)；陈季武(华东师范大学生物系)
关键词：过氧亚硝基(ONOO-)；褪黑素(MT)；一氧化氮(NO)； 超氧阴离子()；自由基；化学发光
海军医学杂志000204 摘要 目的：通过检测MT对ONOO-、NO、
的影响，探讨MT对过氧亚硝基反应体系的调控作用。方法： 采用多种化学发光体系在体外检测。结果：MT对ONOO-有很好的清 除效应(IC50=15 μg/ml)，对有较好的清除作用(IC50=230 μg/ml)，但对NO无清除作用；结论：MT可能通过对 过氧亚硝基反应体系的调控，参与机体对NO代谢平衡的激素水平调节。, 百拇医药
中图分类号 Q576 文献标识码 A 文章编号 1009-0754(2 000)02-0106-03
Effect of MT on the Reactive System of Peroxynitrite
ZHANG Hui, CHEN Ji-wu, WANG Jia-chun, et al
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Aim: To investigate the effect of melatonin on the ONOO-、NO and
, and study the effect of mel ato nin on the reactive system of peroxynitrite. Methods: Exte rnal Measurement was made by several chemiluminescence analytic systems. Results: The pineal neurohormone melatonin could effectively scav enge peroxynitrite (IC50=15 μg/ml) and superoxide (IC50=230 μg/m l) , but was of little effect on nitric oxide. Conclusion: Me latonin might be involved in the regulation of nitric oxide level in the body., 百拇医药
Key words peroxynitrite; melatonin; nitric oxide; sup eroxide; free radical; chemiluminescence
过氧亚硝基(ONOO-)是一氧化氮(NO)和超氧阴离子(
) 结合 或进一步反应生成的[1，2]，反应速率已接近于受控制的弥散极限，生成的ONOO -在碱性环境下是相对稳定的[3]。而在生理条件下(37 ℃、pH 7.4)，ONOO- 可快 速质子化产生其共轭酸过氧亚硝酸(ONOOH)，ONOO-与ONOOH维持平衡，ONOOH可再生成亚硝 酸盐和硝酸盐。随着对NO研究的逐步深入，已有不少研究发现ONOO-是NO产生病理损伤作 用的主要环节。目前认为ONOO-是较NO及氧化作用更强， 作用范围更广的氧化剂[4]。, 百拇医药
褪黑素(Melatonin, MT)的化学名为N-乙酰-5-甲氧基-色胺，是松果腺分泌的一种重要激素 。MT有较强的清除多种活性氧的作用[5]。本实验采用多种化学发光体系，在体外 分别检测MT对过氧亚硝基反应体系中的ONOO-、NO和
的作 用，以探讨MT对过氧亚硝基反应体系的调控，进而研究MT在机体内对NO代谢的影响。1 材料与方法
1.1 材料
MT、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、鲁米诺、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、二氢碱性蕊香红系Sigma产品 ；其他试剂均系国产分析纯。
1.2 仪器
SHB-1型生物化学发光测试仪(上海技术监督局工厂产品)；日立F-3000荧光分光光度计(日本 日立公司产品)。
, 百拇医药
1.3 实验方法
1.3.1 产生
的化学发光体系参考胡天喜等人的方法[6]，采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生
的化学发光体系。用pH 7.8磷酸盐缓冲液(PBS)配制0.05 mN黄嘌呤溶液，黄嘌呤 氧 化酶用PBS稀释成0.29 U/ml。鲁米诺先用PBS悬浮再加微量的二乙胺全部溶解，调pH至7.8 ， 用时用PBS稀释成10-4 N。将800 μl黄嘌呤溶液、100 μl含0～400 μg的MT(用PBS 配制) 、鲁米诺50 μl混匀于测试管中，而后注入50 μl黄嘌呤氧化酶，静置10 s后测10 s内的积 分发光强度(counts of per 10 seconds，简称CP10S)。, http://www.100md.com
1.3.2 NO的荧光法检测体系
根据NO在酸性条件下(pH 1)与NAC反应生成亚硝基硫醇，通过内过滤效应干扰硫酸奎宁荧光 强 度的原理，参考文献[7]，将1 ml用0.1 N硫酸配制成的10-3 N的NAC冷溶液加入到 0.5 ml 1.2×10-3 N亚硝酸钠和0.5 ml由含有4～100 μg MT(对照组用0.1 N硫酸)用0.1 N硫酸 配制成的样品液的冷溶液中，充分振荡，混匀后冰浴45 min，然后加入20 μl 1.2×10 -5 N硫酸奎宁。以2ml 0.1 N硫酸+20 μl硫酸奎宁作为空白。用荧光分光光度计在EX334 nm 、EM453 nm条件下检测荧光强度。
1.3.3 ONOO-的荧光法检测体系
根据ONOO-可把二氢碱性蕊香红123氧化为碱性蕊香红123，碱性蕊香红123可发出荧光的原 理，参考文献[8]，把5 μM ONOO-加入到含10 μM二氢碱性蕊香红123的PBS(已加入0 ～3 00 μg MT)中，22 ℃恒温10 min后，用荧光分光光度计在EX500 nm、EM536 nm条件下测荧 光强度。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 MT对
的清除作用(见表1)表1 MT对
的清除作用(n=3) MT(μg/ml)发光值(CP10S)
抑制率(%)
0
12 299
±
112
0
, 百拇医药
25
11 120
±
81
9.6
50
10 440
±
61
15.1
100
9 347
±
, 百拇医药
83
24.0
200
6 729
±
99
45.3
400
4 084
±
185
66.8
由表1可知，MT可以高效清除
，并呈剂量依赖效应。根 据表1绘制曲线，可得MT的IC50=230μg/ml，和陈季武[5]等人采用邻苯三 酚自氧化体系测得的结果一致。, http://www.100md.com
2.2 MT对NO的影响
采用NO的荧光法检测结果表明，MT对NO无任何清除作用。
2.3 MT对ONOO-的清除作用(见表2))表2 MT对ONOO-的清除作用(n=5) MT(μg/ml)
荧光强度(F)
抑制率(%)
0
23.7
±
0.3
0
1
, 百拇医药
21.1
±
0.2
11.0
10
12.7
±
0.4
46.5
100
6.3
±
0.5
, 百拇医药 73.4
300
2.9
±
0.4
87.8
由表2可知，MT有清除ONOO-的作用，浓度越高测得碱性蕊香红 123的荧光强度越弱。 根据表2绘制曲线，可得15 μg/ml的MT可抑制50%的ONOO-对二氢碱性蕊香红 123的氧化作 用，即MT的IC50=15 μg/ml。加样顺序颠倒对结果无影响，说明MT通过清除ONOO -来抑制二氢碱性蕊香红 123的氧化。
3 讨 论
, 百拇医药
ONOO-在休克、缺血-再灌注损伤、败血症、胰岛素依赖性糖尿病、动脉硬化、肺纤维化及 感染炎症等疾病发生中起重要作用[4]。ONOO-与NO、
三者形成了一个相互联系的自由基反应体系，在生理和病理作用上存在复杂的联系， 且三者均在体内众多的生理及病理过程中发挥重要的作用。一些研究者对NO和生成ONOO-有下述看法[9，10]：(1)清除NO并减轻的生物活性；(2)NO捕获，起到抗的保护作用；(3)与NO结合起调 制NO的作用；(4)与NO结合生成ONOO-，加强它们的致病作 用；(5)过量可减少ONOO-的生成；(6)外源性给予NO可减 轻ONOO-引起的氧化损伤作用。总之，它们三者是相互制约又相互调制的。本实验发现，M T对有高效的清除作用，可减轻对机体造成的损伤，并能加强NO的生物活性；MT与NO对 的协同作用，可进一步提高机体的抗能力。ONOO-是及NO引起损伤作用的主要中介物质，也是NO生成过多而呈现毒性 效应的原因之一。本实验发现，MT可高效清除ONOO-，一定程度上减轻了ONOO-的细胞毒 性作用，维持细胞正常机能和代谢平衡；同时MT通过对ONOO-的清除，也间接减轻了NO和的致病作用。, 百拇医药
ONOO-的作用和反应明显受机体内理化环境的影响。在血浆中ONOO-可氧化抗坏血酸、维 生素E、尿酸、某些芳香族氨基酸和血浆蛋白巯基，这些物质可以看成是ONOO-的清除剂， 在这些物质存在的情况下ONOO-起类似于NO供体的作用[10]。MT作为机体神经 系统分泌的ONOO-清除剂，同样能起到NO供体的作用，而且在内环境不断变化的情况下机 体通过自身的调节机制，调节MT的分泌，进而调制ONOO-生物活性和防护ONOO-对机体可 能的危害。本实验发现，MT不清除NO，从一定程度来讲反而是NO的供体，并通过参与ONOO -与NO和
反应体系的调控，调节三者的生理浓度和生物学效 应，有利于发挥NO正常的生理功能，减轻NO对机体的细胞毒性作用。, 百拇医药 机体内酶氧化失活、脂质过氧化、DNA裂解、能量代谢失衡，与ONOO-和
等自由基的病理性损伤作用以及自由基代谢的紊乱密不可分。H2O2增多 可延长ONOO-的半衰期，增强NO的细胞毒性作用，而MT也能很好的清除H2O2[ 5]；同时MT在机体内能清除其它自由基[6](如OH、1O2等)。随着年龄 增大，松果腺钙化增加，MT生物合成与分泌下降，适当补充外源性的MT是有意义的。NO是一种重要的生物信息传递体，在调节心血管系统、免疫系统、和神经系统功能方面起了 重要作用。在机体内环境不断变化，影响NO作用及ONOO-效应的因素众多的情况下，过氧 亚硝基反应体系可对各种情况造成的NO生成过多加以调节，本实验发现，MT通过调控过氧亚 硝基反应体系和清除其它干扰自由基保护NO，间接地为机体提供NO，可使NO在机体内维持正 常的生理浓度。ONOO-与NO和
之间由过氧亚硝基反应体系 形成相互制约又相互调制的关系，MT可调控过氧亚硝基反应体系，而机体通过各系统对机体 内理化因素的反应调节松果腺分泌MT，可能是机体对NO代谢的激素水平调节机制之一。通过 本研究，我们推测，在一些疾病发病过程中，以NO制剂与MT合理配伍进行治疗，似有其临床 意义，对此仍有待于进一步探讨。, http://www.100md.com
参考文献
1，Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathphysidog y, and pharmalogy. Pharmacol Rev, 1991, 43:109
2，Beckmnn JS, Beckmann TW, Chen J et al. Apparent hydroxy l radical production by peroxynitrite: Implications for endothelial injury form nitric peroxynitrite: Implications for endothelial injury form nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:1620
3，Beckmann JS, Koppenal WH. Nitric oxide, supperoxide, and peroxynite : the good the bad, and the ugly. Am J Physiol, 1996, 271:1424
, http://www.100md.com
4，Pryor WA, Squadrito GL. The chemistry of peroxynitrite: a product from the reacton of nitric oxide with superoxide. Am J Physiol, 1995, 268: 699
5，陈季武，朱振勤，张 慧.褪黑素清除活性氧作用的研究.发光学报，1998，19(1 )：66
6，胡天喜，陈季武.用化学发光法检测丹参、红藤、当归、黄芪等中药制剂的抗自 由基作用.上海中医药杂志，1988，9：28
7，卫 国，张均田.荧光分析法测定大鼠脑组织一氧化氮和一氧化氮合成酶.药学学 报，1996，31(7)：530
8，Eli Gilad, Salvatore Cuzzocrea, Basilia Zingarelli et al. Melatonin is a scavenger of peroxynitrite. Life Sciences, 1997, 60:169
9，Rubbo H, Radi R, Trujillo M et al. Nitric oxide regulat ion of superoxide and peroxynitrite dependent lipid peroxidation. J Biol Che m, 1994, 269:26066
10，凌亦凌，黄善生，谷振勇.过氧亚硝基阳离子的细胞代谢及病理损伤作用.生理 学进展，1997，30(1)：70
(收稿：2000-01-21), http://www.100md.com