高压氧对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤血管通透性的影响(论著)

http://www.100md.com 《中华航海医学与高气压医学杂志》 1998年第2期

     作者：李金声 郭守一 刘立 高建保 谢小萍 马丽云

    单位：710032 西安，第四军医大学空军医学系(李金声、郭守一、刘立、高建保、谢小萍)；上海航空公司医务室(马丽云)

    关键词：高压氧；；；脑缺血；局灶性；；脑水肿；血管源性；；；免疫组织化学

    高压氧对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注 损伤血管通透性的影响摘要 目的:探讨高压氧(HBO)对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤血管通

    透性的影响。方法：应用血管内细丝栓堵脑中动脉(MCA)的局灶性脑缺血大

    鼠模型。利用免疫组织化学方法，观察MCA缺血1小时，再灌注4、11、23、71小时脑血管通透性的变化，在以上期间同时应用常压纯氧和常规临床治

    疗压力0.25 MPa HBO于开始缺血后2、9、21、45和69小时分别治疗1次(1小

    时)。结果：常压纯氧组与缺血再灌注(IR)组相比脑水肿面积无明显差异，而HBO组和IR组相比脑水肿面积分别缩小了12.28%(视交叉前平面)，20.47%

    (视交叉平面)和8.51%(视交叉后平面)，两组间存在非常显著性差异(P<0.01)。

    结论：HBO可明显抑制大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤血管通透性的增加。

    Effect of hyperbaric oxygen on vascular permeability after acute

    focal cerebral ischemia and reperfusion in rats. Li Jinsheng,Guo

    Shouyi,Liu Li,et al.Department of Aerospace Medicine,The Fourth

    Military Medical University,Xian 710032

    

    Abstract Aim:To investigate the effect of hyperbaric oxygen(HBO) on

    vascular permeability after acute focal cerebral ischemia and reperfusion

    in rats.Methods:Rat model of focal cerebral ischemia induced by intraluminal

    filament occlusion to the middle cerebral artery(MCA) were used.The changes

    of cerebral vascular permeability were examined after 1 h of ischemia and

    at 4,11,23 and 71 h of reperfusion following the removal of MCA occlusion

    using the immunohistochemistry method.At the same time,100% O\-2 or

    0.25 MPa HBO treatment for 1 h each time were applied at 2,9,21,45 and

    69 h after the begining of ischemia.Results:The area of cerebral edema in

    100%O\-2 group was similar to those of ischemia reperfusion(IR) group.

    The edema area of HBO group were 12.28%,20.47% and 8.51% significantly

    lower(P<0.01)in the brain section at the level before,at and behind the optic

    chiasma than that of IR group respectively.Conclusion:HBO treatment could

    obviously reduce the vasogenic brain edema after acute focal cerebral ischemia

    and reperfusion injury in rats.

    Key words Hyperbaric oxygen Cerebral ischemia,focal Cerebral edema,vasogenic

    Immunohistochemistry

    (Chin J Naut Med,1998，5：72)

    目前高压氧(HBO)已被认为是治疗脑部疾病的一种有效的非创伤性方

    法，大量实验和临床资料显示HBO能改善脑部代谢^[1]。但有关HBO对脑

    缺血的神经病理学研究报道较少，而且由于HBO治疗的压力和时机、脑缺

    血程度和持续时间以及所用脑缺血动物模型(全脑、前脑、局灶)的不同，其对脑缺血性损伤的治疗效果各家报道存在很大差异。

    本研究应用血管内细丝栓堵大脑中动脉(MCA)的局灶性脑缺血大鼠模型^[2]，观察MCA缺血1小时，再灌注4、11、23、71小时脑血管通透性的变化，并应用

    常规临床治疗压力0.25 MPa HBO分别治疗1、2、3、5次后观察各时间点脑血管

    通透性的变化，以进一步探讨HBO对局灶性脑缺血的作用及其机理。

     材料与方法

    1.实验器材：(1)HBO舱为宁波NG750型单人舱；(2)实验用气为压缩空气及医用

    纯氧；(3) 兔抗鼠血浆白蛋白抗体(IgG)、小牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶(GOD)、免疫组化ABC试剂盒均购自Sigma公司。

    2.动物模型及分组：SD大鼠置于含乙醚棉球的密闭盒内，待动物麻醉后，固定

    于小手术板上，取颈腹侧旁正中切口，分离暴露一侧颈总动脉、颈内动脉和颈

    外动脉。动物随机分为：(1) 假手术组(JS)5只：同样手术，但不阻断动脉血流。

    (2)假手术+HBO组(JS+HBO)5只：同样手术，不阻断动脉血流，术后行HBO治疗5次，72小时后经心脏灌注取脑(灌注液为0.9%生理盐水100 ml、4%多聚甲醛500 ml)。

    (3)缺血再灌注组(IR)28只：再分为4个小组，每小组7只。参照Koizumi^[2]的

    MCA缺血模型制备方法，操作步骤如下：结扎颈外动脉，距颈内、外动脉交叉0.5 cm

    处剪开颈总动脉，用一长30 mm，直径为0.28～0.32 mm的尼龙细丝栓子顺颈总

    动脉插入颈内动脉，并向前送入约20 mm，用细丝线扎紧颈总动脉开口，以固定

    栓子。缝合切口，注意将栓子尾部留于皮外。将手术过程中发生呼吸困难、发绀

    或大出血的动物弃除。1小时后抽出栓子。4个小组动物分别在插入栓子的时间起，5、12、24、72小时后经心脏灌注处死取脑(灌注液同前)。(4) 纯氧组(100%O₂)

    28只：亦如上再分为4个小组。动物手术过程同缺血再灌注组，于缺血1小时后抽

    出栓子，第1小组在插入栓子的时间(开始缺血)后2小时将动物置于加压舱内，常

    压下吸纯氧1小时。同上在5小时后经心脏灌注处死取脑；第2小组于缺血后2、9小

    时分别吸氧1小时共2次，在12小时后处死取脑；第3小组于缺血后2、9、21小时分

    别吸氧1小时共3次，在24小时后处死取脑；第4小组于缺血后2、9、21、45、69小

    时分别吸氧1小时共5次，在72小时后处死取脑。(5) HBO组28只；动物同上分为4

    个小组，处理方法除在舱内将常压下改为用0.25 MPa压力下吸纯氧1小时外，其余

    均与纯氧组相同。

    3.加压方法：动物进舱后，先用纯氧充分洗舱10分钟，使舱内O₂浓度>90%，加

    压速率为0.0125 MPa/min，加压至0.25 MPa，在高压下停留60分钟，其间用纯氧

    通风10分钟。停留毕，以20分钟匀速减至常压。对照组动物亦置于舱内，模拟除

    压力、氧浓度外的类同实验组的其它处理过程和环境条件。各组动物出舱后2小

    时处死。

    4.免疫组织化学染色：大鼠于腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉下，经升主动

    脉先用生理盐水100 ml快速冲洗，然后灌注4℃ 4%多聚甲醛500 ml(用0.1 mol/L

    PB配制，pH7.4)，持续1.5～2小时，注毕取脑，浸于20%蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4)

    中至其沉底。根据Paxins和Watson鼠脑定位图谱选取视交叉前平面(Bregma-1.20 mm)、视交叉平面(Bregma-0.80 mm)、视交叉后平面(Bregma-2.80 mm)，作冰冻切片，片厚30 μm。切片收集于0.01 mol/L PBS中，4℃保存。血管源性脑水肿免疫组

    化ABC法：切片经0.3%H₂O₂+甲醇溶液、0.3%Triton-X-100分别处理30分钟后入

    兔抗鼠血清白蛋白抗体(IgG 1:100)4 ℃ 48小时，然后入ABC复合物(1：500)37 ℃

    4小时，DAB呈色。上述每步骤间用PBS充分洗涤，切片室温下避尘干燥，系列酒精

    脱水，二甲苯透明，DPX封片，Olympus BH2显微镜(日本)观察照像。

    对照实验：用0.01MPBS代替兔抗鼠血清白蛋白抗体，其余反应过程同前。

    5.血管源性脑水肿面积计算：利用Quantlnet570型图像分析仪(德国Leica公司)

    图象分析系统计算视交叉前平面、视交叉平面和视交叉后平面血管源性脑水肿面

    积，以水肿面积与同侧半球面积百分比表示。

    6.统计学处理：实验组与对照组之间用t检验判断比较差异显著程度。

    结 果

    100%O₂组和IR组相比血管源性脑水肿面积无明显差异，而HBO组治疗3次

    和5次后和IR组相比，血管源性脑水肿面积明显缩小(附表)，两组存在明显差异

    (P<0.05，P<0.01)。缩小的部位主要在纹状体内侧区和皮层区(Fig 1、2、3、4)。提示HBO对局灶性缺血再灌注的脑血管通透性有明显的改善作用，明显减轻

    血管内物质渗漏到组织间隙。假手术组无血管源性脑水肿。

    附表 脑MCA阻塞1小时再灌注4、11、23、71小时各组脑水肿面积与同侧半球

    面积百分比(±s，n=7)

    Tab. Percentage of cerebral edema area in homolateral hemisphere at 4,11,23,71 h

    of reperfusion after 1 h occlusion of MCA in different groups 脑平面

    brain level

    组别

    group

    再灌注时间reperfusion time(h)

    4

    11

    23

    71

    视交叉

    optic chiasma

    IR

    12.17±4.21

    27.62±4.01

    50.12±7.51

    58.72±8.33

    100%O₂

    12.87±2.36

    24.98±4.74

    46.68±7.24

    57.69±8.47

    HBO

    11.96±2.16

    22.09±3.68

    36.46±6.46^*

    38.25±7.21^**

    视交叉前

    before optic chiasma

    IR

    8.52±2.13

    15.46±3.14

    32.79±5.28

    38.17±5.25

    100%O₂

    7.24±2.01

    13.89±2.53

    33.61±4.94

    36.84±6.29

    HBO

    7.75±2.72

    12.98±3.19

    13.81±4.83^*

    25.89±4.74^**

    视交叉后

    behind optic chiasma

    IR

    5.85±1.04

    8.16±1.96

    15.83±2.49

    19.73±3.64

    100%O₂

    5.33±1.45

    7.67±1.67

    14.14±2.98

    17.96±3.59

    HBO

    4.28±1.11

    6.39±2.10

    8.56±1.69^*

    11.22±2.52^**

    与IR组比 υs IR group ^*P<0.05 ^**P<0.01

    讨 论

    从理论上讲，脑血流(CBF)降低时给予常压纯氧，可通过增加血液溶解氧浓度，进而增加脑组织PaO₂^[3]。但大量研究资料显示，常压纯氧治疗，很少引起脑

    动脉、静脉、CBF和组织中PaO₂升高^[4]。我们的实验结果也显示常压纯氧治疗

    局灶性脑缺血，血管源性脑水肿面积无明显改善；表明常压纯氧治疗局灶性脑缺血

    可能无显著的临床价值^[5]。

    图1 大鼠脑缺血1小时，再灌注71小时的IgG免疫组化染色 ×3

    Fig1 IgG-immunohistochemistry stained section after1 h ischemia and

    71 h reperfusion in rat brain

    图2 大鼠缺血1小时，再灌注71小时的皮层和皮层下梗塞区IgG免疫组化染色 ×28

    可见神经纤维网和一些细胞呈强阳性反应

    Fig2 IgG-immunohistochemistry stained section after1 h ischemia and

    71 h reperfusion in rat braincortical and subcortical area Shown some

    strong IgG-reactive neurons and neurophils

    图3 缺血1小时、再灌注71小时和HBO治疗5次后的IgG免疫组化染色 ×3

    可见染色反应强度和范围明显减小

    Fig3 IgG-immunohistochemistry stained section after 1h ischemia,71 h

    reperfusion and 5 times of HBO treatment Shown much reduced stained density and area

    图4 缺血1小时，再灌注71小时和HBO治疗5次后皮层和皮层下梗塞

    区的IgG免疫组化染色 ×28

    可见神经纤维网和一些细胞阳性反应减弱

    Fig4 IgG-immunohistochemistry stained section after 1h ischemia,71 h

    reperfusion and 5 times of HBOtreatment in rat brain cortical and subcortical

    area Shown reduced density of IgG-reactive neurons and neurophils

    近年来，脑水肿是有关脑损伤研究的重要内容，如在脑外伤的实验研究

    中证实血脑屏障受损可发生脑水肿。现已证实局灶脑缺血再灌注过程中可发

    生严重的脑水肿^[6]。脑缺血引起的脑水肿包括细胞毒性水肿和血管源性水

    肿，后者系由于血脑屏障受损、通透性增加所致，而血管内血清蛋白成分通

    过损伤的血管内皮渗漏到血管外，是发生脑水肿的重要原因^[7]。用免疫组

    织化学方法检测血脑屏障的通透性和血管源性水肿，不仅可以了解血清蛋白

    成分等大分子物质从血管内渗出的情况，而且能进行形态学观察。我们的实

    验结果显示，在局灶性脑缺血再灌注过程中，血脑屏障开放，血管内的大分

    子物质渗出。神经细胞的血清蛋白成分阳性反应已见于先前学者的报道^[6]。

    对此有如下解释：血清蛋白成分通过受损的细胞膜被动地弥散进入细胞内；

    神经细胞可能主动摄取组织细胞间隙血清蛋白成分以减轻血管源性脑水肿。

    以往认为，在生理条件下HBO可增加动物血脑屏障通透性^[8]。Richard^[9]

    在全脑缺血模型上亦证实HBO可减轻缺血再灌注损伤引起的血脑屏障损害。我

    们的实验结果显示，大鼠脑缺血1小时，再灌注71小时，应用0.25 MPa HBO治

    疗5次可明显减轻局灶性脑缺血再灌注损伤的血管源性脑水肿。对此有如下解

    释：HBO具有增加血氧含量，提高PaO₂的作用，严重脑组织坏死、水肿和损

    伤后，出现氧弥散障碍者，HBO可增加氧的弥散能力，从而改善脑水肿和脑组

    织的缺氧状态。实验发现HBO对颅外血管阻断造成的脑缺血损伤及由此引起的

    颅内压增高具有一定的保护作用^[1]。虽然大量实验结果显示HBO可引起脑血

    管收缩，降低CBF，但这种CBF降低和血管收缩作用可使脑血容量降低，因此可

    以明显降低颅内压。总之，HBO治疗脑水肿的机理可能与其降低脑血容量，增加

    组织有效氧量有关^[9]。

    参 考 文 献

    1 Shiokawa O,Fujishima M,Yanai T,et al.Hyperbaric oxygen therapy in

    experimentally induced acute cerebral ischemia.Undersea Biomed Res,1986,13:337-44.

    2 Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of

    ischemic brain edema:1. A new experimental model of cerebral

    embolism in rats in which recirculation can be introduced in the

    ischemic area.Jpn J stroke,1986,8:1-8.

    3 Jamieson D,Van Den Brenk HAS.Measurement of oxygen tensions in

    cerebral tissues of rats exposed to high pressures of oxygen.J Appl Physiol,1973,18:799-806.

    4 Holbach KH,Wassman H,Hoheluchter KL,et al.Differentiation between

    reversible and irreversible post-stroke changes in brain tissue:Its relevance

    for cerebrovascular surgery.Surg Neurol,1977,7:325-331.

    5 Regli F,Yamaguchi T,Waltz A G.Effects of inhalation of oxygen on blood

    flow and microvasculature of ischemic and nonischemic cerebral cortex.Stroke,1990,1:314-319.

    6 Kitagawa K，Matsumoto M,Tagaya M,et al.Temporal profile of serum

    albumin extravasation following cerebral ischemia in a newly established

    reproducible gerbil model for vasogenic brain edema:a combined

    immunohistochemical and dye tracer analysis.Acta Neuropathol,1992,82(2):164-171.

    7 Sokrab TEO,Johansson BB,Kalimo H,et al.A transcient hypertensive opening

    of the blood-brain barrier can lead to brain damage-Extravasation of serum

    proteins and cellular changes in rats subjected to aortic compression.Acta neuropathol

    (Berl),1988,75:557-565.

    8 Lanse SB,Lee JC,Jacobs EA,et al.Changes in the permeability of the

    blood-brain barrier under hyperbaric conditions.Aviat Space Environ

    Med,1978,49(7):890-894.

    9 Richard BM,Andrew JD.Hyperbaric oxygen after global cerebral

    ischemia in rabbits reduces brain vascular permeability and blood flow.

    Stroke,1995,26(12):2307-2312.

    (收稿：1997-11-17 修回：1998-03-02)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/28/61/185.htm