3周模拟失重对大鼠后肢骨生长代谢的影响
作者：曹新生 付崇建 杨连甲 吴兴裕 张乐宁 张立藩
单位：曹新生(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；吴兴裕(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；张乐宁(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；张立藩(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；付崇建(第四军医大学口腔医学院病理学教研室)；杨连甲(第四军医大学口腔医学院病理学教研室)
关键词：失重模拟；生物力学；股骨；胫骨；骨密度
中华航空航天医学杂志000407 【摘要】 目的 观察3周模拟失重对大鼠后肢骨形态、生物力学特性和生长情况的影响。 方法 14只雄性SD大鼠按体重配对后随机等分为对照组和模拟失重组，采用尾部悬吊方法模拟失重，3周实验结束后处死大鼠，取后肢骨检测股骨物理性状、生物力学特性、钙含量以及胫骨组织学变化(三色染色法)。 结果 3周悬吊期间大鼠生长良好，未出现明显应激反应；与对照组相比，3周模拟失重组大鼠股骨湿重、干重、灰分、直径和密度均降低(P<0.01)；弹性载荷、最大载荷、刚性系数等均下降(P<0.01)，最大挠度和韧性系数增大(P<0.01或P<0.05)；钙在股骨头部位百分含量降低(P<0.05)，在股骨干有下降的趋势。切片三色染色结果显示胫骨哈佛氏系统周围骨样组织钙化障碍，原有钙化基质内钙盐脱钙现象明显。 结论 3周模拟失重使大鼠后肢骨生长受抑，钙盐代谢障碍，生物力学性能降低。
, 百拇医药
【中国图书资料分类法分类号】 R852.22
Effects of 3 wk simulated weightlessness on the growth and metabolism of hindlimb bones in rats
CAO Xinsheng,FU Chongjian,YANG Lianjia
(Department of Aerospace Medicine,Department of Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
【Abstract】 Objective To investigate effects of 3 wk simulated weightlessness on morphology, mechanical parameters and growth of hindlimbs in tail-suspension rats. Methods Fourteen male SD rats were matched in weight and divided into control group(C) and suspension group(S), in which tail-suspension was used to simulate weightlessness. After 3 wk tail-suspension, the rats were killed. Physical parameters, mechanical parameters and calcium concentration of femur were measured, and histological changes (using trichrome stain) of tibia sections were observed. Results During 3 wk tail-suspension, the rats grew well, no apparent stimulating reaction was observed. As compared with control group, wet weight, dried weight, ash, diameter and density of femur in suspension group were significantly lower(P<0.01), elastic load, maximum load, and bending rigidity coefficient significantly decreased(P<0.01), while maximum deformation and bending toughness coefficient markedly increased(P<0.01 or P<0.05). Calcium content in head of femur declined markedly(P<0.05), and in diaphysis showed tendency of decline. Trichrome stain tibia sections showed that mineralization of harversion lamella system was inhibited, and demineralization of former mineralized matrix was prominant. Conclusions After 3 wk tail-suspension, the growth of rat's hindlimb bones was suppressed, their bio-mechanical properties were declined, and calcium deposition was inhibited.
, 百拇医药
【Key words】 Weightlessness simulation; Biomechanics; Femur; Tibia; Bone density
失重性骨丧失(包括骨量减少，骨质变化和钙代谢障碍)是人类长期停留太空和探索其它星球的主要障碍之一[1，2]。虽然经过大量研究，但目前对于失重性骨丧失的机理仍缺乏深刻认识。已有结果表明，失重性骨丧失主要发生在承重骨，因而了解中长期失重中承重骨变化十分必要。由于航天条件的限制，尾吊大鼠模型是较理想的地面模拟失重的动物模型。本实验旨在考察3周尾吊大鼠的一般生长代谢状况，后肢骨的物理性状、生物力学特性、组织形态等方面与正常对照组大鼠的差异。
材料与方法
一、动物分组及动物模型的制备
采用14只雄性SD大鼠，均为上海实验动物中心引进的清洁级大鼠。实验开始当日按体重配对随机等分为对照组(C)和悬吊组(S)。大鼠体重为：C组：(198.3±4.9) g；S组：(199.5±4.3) g。
, 百拇医药
3周实验期间，给予充足清洁饮水，摄食(饲料为第四军医大学动物中心提供的标准大鼠饲料)；大鼠可自由活动。室温保持在(22±2)℃，人工控制室内照明，保持12 h光照(8：00～20：00)和黑暗(20：00～次日8：00)交替循环。S组大鼠采用陈杰等[3]改进的方法做尾部悬吊，大鼠始终保持30°头低位及后肢自由悬垂不荷重状态。
二、标本处理及测定项目
1.体重测量及一般情况观察：实验期间密切观察大鼠生活情况(包括饮食、饮水、活动情况、皮毛色泽等)。在实验前,实验第1,4,8,12,16 d及实验结束日分别测量大鼠体重,采用ACA-100型电子天平(Denver instrument company，USA，精度1×10-4 g)。实验期满日取各大鼠左侧肾上腺称重。
2.物理性状测定：自实验期满开始，按配对顺序依次断头处死大鼠，右侧股骨去净附着结缔组织后测量一般物理指标，包括湿重、长度、直径、体积、密度、干重和灰分，除后两项外其余均在处死大鼠后立即测量。湿重和干重采用ACA-100型电子天平测量，灰分采用TMP-1上皿式电子天平(中国湖南仪器仪表总厂天平厂，长沙，精度1×10-3 g)测量。标本在118℃加热烘烤48 h至质量恒定后测干重；灰化炉800℃、24 h完全灰化后测灰分。长度和直径(骨干中段最细处)使用精度为0.02 mm游标卡尺测量。体积用排水法测量。湿重密度为湿重和体积的比值。
, 百拇医药
3.生物力学特性测定：左侧股骨去净附着结缔组织后即刻密封保存于-70℃环境中，并于3 d内进行三点弯曲实验。三点弯曲实验在1195电子拉伸机(Instron，England)上进行。股骨放置方向及位置保持不变，跨距为16 mm，加载砝码2 kg，加载速度为0.05 mm*min-1。通过所得载荷-应变曲线计算弹性载荷、最大载荷、弹性挠度、最大挠度、刚性系数和韧性系数等力学指标。
4.能谱分析：取上述干燥后股骨，在股骨干中段最细处平面和股骨头最大平面打磨抛光，真空喷碳处理后在1000B 扫描电镜下进行能谱分析(Amary, USA)。加速电压为20 kV，每处采样时间为50 s。每一处标本测定三个视野，取其平均值为最后结果。测定的元素包括钙(Ca)，磷(P)。
5.组织学观察：取左侧胫骨上段(以胫腓结合处为界)，去净附着软组织，自关节隆突下横断，分别观察松质骨和皮质骨改变。标本即刻入4%多聚甲醛固定24 h，后在4℃脱钙液(20%甲酸：20%柠檬酸三钠=1∶1)中脱钙5 d 至终点，室温逐级酒精脱水，氯仿透明，石蜡包埋，纵向切片，厚度为6 μm。采用文献[4]改良三色染色法染色，光镜下(Olympus, Japan)观察形态学变化。
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四、统计分析
所得数据均以
±s表示，采用SPSS7.0统计软件进行统计分析，利用方差分析和t检验检测各组间差异的显著性。
结果
一、一般情况
C,S组大鼠在实验期间体重持续增加。实验结束时，两组大鼠的体重分别为：C组：(324.8±16.1) g；S组：(318.8±10.0) g，两组之间差异无显著性意义。肾上腺重量分别为:C组：(19.0±3.9) mg；S组：(22.2±3.2) mg，两组之间差异无显著性意义。提示采用本模型大鼠生长良好，应激反应较小。
二、悬吊大鼠股骨物理性状改变
, 百拇医药
S组大鼠股骨的湿重、干重、灰分、直径和密度均较C组大鼠下降(P<0.01)，长度间差异无显著意义，见表1。提示模拟失重抑制了大鼠股骨的生长代谢。
三、悬吊大鼠股骨生物力学特性改变
S组大鼠在股骨弹性载荷、最大载荷、刚性系数等方面均较C组下降(P<0.01)，最大挠度和韧性系数增大(P<0.01或P<0.05)，见表2。提示模拟失重引起大鼠股骨生物力学性能的全面下降。
四、能谱分析结果
S组大鼠股骨钙的百分比含量在股骨头部位较C组显著降低(P<0.05)，股骨干部位有下降的趋势；磷在两组之间差异无显著性意义，见表3。提示股骨局部钙的含量减少，以松质骨部分更显著。
表1 C,S组大鼠股骨(右)物理性状(±s,各组n=7 )
, 百拇医药
Tab 1 Basic physical items of rat femur(right) in C, S groups(±s，n=7 for each group)
对照组
Control group
悬吊组
Suspension group
t值
t value
P值
P value
, 百拇医药
湿重
Fresh femur(mg)
901±50
807±32
4.157
<0.01
干重
Dried femur(mg)
600±36
510±14
6.113
<0.01
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灰分
Mineral femur(mg)
342±39
248±48
4.416
<0.01
直径
Diameter(mm)
2.37±0.21
2.00±0.15
3.833
<0.01
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长度
Length(mm)
35.43±0.80
35.75±0.89
0.715
>0.05
湿重密度
Density(g*cm-3)
1.485±0.020
1.397±0.031
6.243
<0.01
, 百拇医药
表2 C,S组大鼠股骨(左)生物力学特性(±s,各组n=7 )
Tab 2 Mechanical parameters of rat femur(left) in C， S groups(±s，n=7 for each group)
对照组
Control group
悬吊组
Suspension group
t值
, 百拇医药 t value
P值
P value
弹性载荷
Elastic load(N)
66±17
40±3
3.991
<0.01
最大载荷
Maximum load (N)
102±19
, 百拇医药
68±9
4.256
<0.01
弹性挠度
Elastic deformation (mm)
0.25±0.04
0.24±0.06
0.543
>0.05
最大挠度
Maximum deformation(mm)
0.56±0.06
, 百拇医药
0.67±0.08
2.470
<0.05
刚性系数
Bending rigidity coefficient
(N*mm2×104)
2.2±0.5
1.5±0.3
3.396
<0.01
韧性系数
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Bending toughness coefficient
(mm*N-1×10-2)
0.87±0.15
1.53±0.27
5.048
<0.01
表3 C,S组大鼠股骨(左)能谱分析结果(±s,各组n=7)
Tab 3 Energy spectrum analysis of rat femur(left) in C, S groups(±s，n=7 for each group) 组别
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Groups
股骨头
Head of femur
股骨干
Midst of femur
钙
Calcium
磷
Phosphorus
钙
Calcium
磷
Phosphorus
, 百拇医药
对照组
Control group
77.20±0.21
19.29±0.33
82.93±2.74
14.86±3.15
悬吊组
Suspension group
75.20±1.78
20.07±1.34
79.60±5.57
, 百拇医药 18.50±5.67
t值
t value
2.647
1.383
1.315
1.371
P值
P value
<0.01
>0.05
>0.05
>0.05
, 百拇医药
五、组织形态学观察
C，S组大鼠胫骨组织切片在光学显微镜下观察见明显差别。三色染色法结果为骨样组织深蓝色、骨髓黄或橘黄色、矿化较好的骨基质砖红色、骨细胞橘黄或红色、软骨淡蓝色、钙化骨橘黄色、纤维组织蓝色、肌肉组织黄色或黄红色。在松质骨部分，C组大部分呈互相移行的红色区域，表明该处骨基质矿化良好，见图1(封4)；S组染色则以蓝色为主，表明骨基质中的矿物成分丧失，提示基质向矿化的骨样组织转化受到抑制，见图2(封4)。在骨干部位的皮质骨中，C组可见骨细胞和哈佛氏系统呈橘黄色，周围被砖红色的骨基质包围，钙盐主要通过哈佛氏系统运送至骨基质中，形成明显的矿化区，反映正常条件下皮质部分基质钙化作用显著，见图3(封4)；而S组中骨皮质主要是蓝色的骨细胞和蓝色的骨样组织围绕的哈佛氏系统，反映模拟失重后哈佛氏系统对钙盐的运送减少，骨基质钙化障碍。同时，S组的皮质骨中还可见到大量散在的蓝色点状着色，部分融合成较大的不规则蓝色区域，表明皮质骨中不仅有钙盐的丢失，而且伴随钙盐沉积不良，原有的沉积的钙盐出现了脱钙现象，见图4(封4)。讨论
, 百拇医药
在地面条件下，后肢去负荷大鼠模型能够成功地复制失重性骨丧失，同时应激作用很小，保持了大鼠健康生长，是一种被公认并得到广泛应用的模拟失重模型[5，6]。本实验采用我实验室改进的尾吊大鼠模型，大鼠在整个实验过程中生长状况良好。生长曲线反映出S组的体重在整个实验过程中始终保持增长趋势，与C组的体重始终无明显差异。实验结束时测量肾上腺重量两组间差异也无显著性意义。说明此模型产生的应激反应较小，对大鼠的整体生长无明显的影响。
生物力学特性是反映骨的生长代谢的一个重要指标。航天失重和模拟失重均可引起力学特性的显著降低，Cosmos飞行发现大鼠股骨和脊柱的力学性能下降[2]。Shaw等[7]利用后肢悬吊大鼠模型发现股骨的所有弯曲参数(硬度、负荷、能量)较对照组显著降低。以上结果提示失重引起骨力学性能降低，且主要发生在承重骨。崔伟等[8](1996)观察了不同时间长度的悬吊对松质骨(大鼠椎骨L3)生物力学特性的影响，发现L3的结构力学特性、杨氏模量、材料力学性能和骨强度均显著降低。马进等[9](1994)曾测量模拟失重90 d后密质骨的力学特性变化，发现股骨的硬度、强度、刚度各项参数均较对照组显著下降。本实验主要观察了3周模拟失重对股骨结构力学特性的影响，结果S组大鼠股骨的刚性(包括弹性载荷、最大载荷和刚性系数)和韧性性能(包括最大挠度、韧性系数)较C组显著下降，反映大鼠股骨结构力学特性的全面降低。提示3周悬吊引起大鼠后肢密质骨中小梁骨质量、结构连续性和皮质厚度降低[10]。
, 百拇医药
通过X线设备的骨密度检测仪，或灰分的测量，以及钙磷的光密度分析等方法，大量证据都证实了失重/模拟失重情况下骨密度降低，骨钙含量下降[5，8]。本实验能谱分析得到类似的结果，模拟失重3周引起股骨头和股骨干两个部位钙的相对百分含量降低，同时灰分测定结果也表明总矿物质也是显著降低的。本实验还利用三色染色法直接观察了模拟失重后大鼠后肢骨的钙盐代谢的形态学变化，发现3周模拟失重后，原来矿化的骨皮质和骨松质都发生了明显的矿物盐的丢失(由红变蓝)，而且脱矿的骨样组织向骨基质的转化过程受到抑制。脱钙的方式在形态学上主要表现为两种类型：钙盐沉积障碍，即围绕哈佛氏系统周围形成脱钙环形区；原已钙化骨基质出现钙盐丢失，即骨基质中发生斑点状的钙丢失(蓝色斑点)，然后逐步扩大形成片状的脱钙区。能谱分析和三色染色结果均表明尾吊模拟失重可引起大鼠后肢骨钙盐的丢失，在松质骨部分主要表现为骨样组织向基质的转化不良，在皮质骨部分则表现为钙沉积障碍的同时伴随钙盐丢失。以上结果提示失重破坏了骨的钙盐沉积和吸收之间的平衡，调节钙盐的代谢机制发生了障碍，但其机理还有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：全军医药卫生科研基金资助项目(98Z083)
参考文献
1，Morey-Holton ER, Whalen RT, Arnaud SB, et al. The skeleton and its adaptation to gravity. Handbook of physiology, section 4: Environmental physiology. New York: Oxford University Press,1996.691-719.
2，Oganov VS, Schneider VS. Skeletal system. Humans in spaceflight. Volume 3, BookⅠ. Effects of microgravity. Reston VA:AIAA, 1996.247-266.
, 百拇医药
3，陈杰,马进,丁兆平,等.一种模拟长期失重影响的大鼠尾部悬吊模型.空间科学学报,1993,13(2)：159-162.
4，裘秀春,蒋维中,文艳华,等.生物活性材料动物实验组织制片法.第四军医大学学报,1999,20(12):S134-135.
5，Morey-Holton ER, Globus RK. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight.Bone,1998,22(5,Suppl):83S-88S.
6，Bikle DD, Halloran BP. The response of bone to unloading. J Bone Miner Metab,1999,17(4):233-244.
, 百拇医药
7，Shaw SR, Vailas AC, Grindeland RE, et al. Effects of a 1-wk spaceflight on morphological and mechanical properties of growing bone. Am J Physiol, 1988,254(1 Pt 2):R78-83.
8，崔伟,史之祯,郑强.不同悬吊时间对大鼠椎骨骨质和生物力学特性的影响.航天医学与医学工程.1996,9(3):190-194.
9，马进,陈杰,丁兆平,等.模拟失重九十天对大鼠长骨生物力学特性的影响.第四军医大学学报,1994,15(3)：218-220.
10，Mosekidle L, Danielsen CC, Knudsen UB, et al. The effect of aging and ovariectomy on the vertebral bone mass and biomechanical properties of mature rats. Bone, 1993,14(1): 1-6.
[收稿日期：2000-06-19], http://www.100md.com
单位：曹新生(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；吴兴裕(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；张乐宁(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；张立藩(710032 西安，第四军医大学航空航天医学系)；付崇建(第四军医大学口腔医学院病理学教研室)；杨连甲(第四军医大学口腔医学院病理学教研室)
关键词：失重模拟；生物力学；股骨；胫骨；骨密度
中华航空航天医学杂志000407 【摘要】 目的 观察3周模拟失重对大鼠后肢骨形态、生物力学特性和生长情况的影响。 方法 14只雄性SD大鼠按体重配对后随机等分为对照组和模拟失重组，采用尾部悬吊方法模拟失重，3周实验结束后处死大鼠，取后肢骨检测股骨物理性状、生物力学特性、钙含量以及胫骨组织学变化(三色染色法)。 结果 3周悬吊期间大鼠生长良好，未出现明显应激反应；与对照组相比，3周模拟失重组大鼠股骨湿重、干重、灰分、直径和密度均降低(P<0.01)；弹性载荷、最大载荷、刚性系数等均下降(P<0.01)，最大挠度和韧性系数增大(P<0.01或P<0.05)；钙在股骨头部位百分含量降低(P<0.05)，在股骨干有下降的趋势。切片三色染色结果显示胫骨哈佛氏系统周围骨样组织钙化障碍，原有钙化基质内钙盐脱钙现象明显。 结论 3周模拟失重使大鼠后肢骨生长受抑，钙盐代谢障碍，生物力学性能降低。
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【中国图书资料分类法分类号】 R852.22
Effects of 3 wk simulated weightlessness on the growth and metabolism of hindlimb bones in rats
CAO Xinsheng,FU Chongjian,YANG Lianjia
(Department of Aerospace Medicine,Department of Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
【Abstract】 Objective To investigate effects of 3 wk simulated weightlessness on morphology, mechanical parameters and growth of hindlimbs in tail-suspension rats. Methods Fourteen male SD rats were matched in weight and divided into control group(C) and suspension group(S), in which tail-suspension was used to simulate weightlessness. After 3 wk tail-suspension, the rats were killed. Physical parameters, mechanical parameters and calcium concentration of femur were measured, and histological changes (using trichrome stain) of tibia sections were observed. Results During 3 wk tail-suspension, the rats grew well, no apparent stimulating reaction was observed. As compared with control group, wet weight, dried weight, ash, diameter and density of femur in suspension group were significantly lower(P<0.01), elastic load, maximum load, and bending rigidity coefficient significantly decreased(P<0.01), while maximum deformation and bending toughness coefficient markedly increased(P<0.01 or P<0.05). Calcium content in head of femur declined markedly(P<0.05), and in diaphysis showed tendency of decline. Trichrome stain tibia sections showed that mineralization of harversion lamella system was inhibited, and demineralization of former mineralized matrix was prominant. Conclusions After 3 wk tail-suspension, the growth of rat's hindlimb bones was suppressed, their bio-mechanical properties were declined, and calcium deposition was inhibited.
, 百拇医药
【Key words】 Weightlessness simulation; Biomechanics; Femur; Tibia; Bone density
失重性骨丧失(包括骨量减少，骨质变化和钙代谢障碍)是人类长期停留太空和探索其它星球的主要障碍之一[1，2]。虽然经过大量研究，但目前对于失重性骨丧失的机理仍缺乏深刻认识。已有结果表明，失重性骨丧失主要发生在承重骨，因而了解中长期失重中承重骨变化十分必要。由于航天条件的限制，尾吊大鼠模型是较理想的地面模拟失重的动物模型。本实验旨在考察3周尾吊大鼠的一般生长代谢状况，后肢骨的物理性状、生物力学特性、组织形态等方面与正常对照组大鼠的差异。
材料与方法
一、动物分组及动物模型的制备
采用14只雄性SD大鼠，均为上海实验动物中心引进的清洁级大鼠。实验开始当日按体重配对随机等分为对照组(C)和悬吊组(S)。大鼠体重为：C组：(198.3±4.9) g；S组：(199.5±4.3) g。
, 百拇医药
3周实验期间，给予充足清洁饮水，摄食(饲料为第四军医大学动物中心提供的标准大鼠饲料)；大鼠可自由活动。室温保持在(22±2)℃，人工控制室内照明，保持12 h光照(8：00～20：00)和黑暗(20：00～次日8：00)交替循环。S组大鼠采用陈杰等[3]改进的方法做尾部悬吊，大鼠始终保持30°头低位及后肢自由悬垂不荷重状态。
二、标本处理及测定项目
1.体重测量及一般情况观察：实验期间密切观察大鼠生活情况(包括饮食、饮水、活动情况、皮毛色泽等)。在实验前,实验第1,4,8,12,16 d及实验结束日分别测量大鼠体重,采用ACA-100型电子天平(Denver instrument company，USA，精度1×10-4 g)。实验期满日取各大鼠左侧肾上腺称重。
2.物理性状测定：自实验期满开始，按配对顺序依次断头处死大鼠，右侧股骨去净附着结缔组织后测量一般物理指标，包括湿重、长度、直径、体积、密度、干重和灰分，除后两项外其余均在处死大鼠后立即测量。湿重和干重采用ACA-100型电子天平测量，灰分采用TMP-1上皿式电子天平(中国湖南仪器仪表总厂天平厂，长沙，精度1×10-3 g)测量。标本在118℃加热烘烤48 h至质量恒定后测干重；灰化炉800℃、24 h完全灰化后测灰分。长度和直径(骨干中段最细处)使用精度为0.02 mm游标卡尺测量。体积用排水法测量。湿重密度为湿重和体积的比值。
, 百拇医药
3.生物力学特性测定：左侧股骨去净附着结缔组织后即刻密封保存于-70℃环境中，并于3 d内进行三点弯曲实验。三点弯曲实验在1195电子拉伸机(Instron，England)上进行。股骨放置方向及位置保持不变，跨距为16 mm，加载砝码2 kg，加载速度为0.05 mm*min-1。通过所得载荷-应变曲线计算弹性载荷、最大载荷、弹性挠度、最大挠度、刚性系数和韧性系数等力学指标。
4.能谱分析：取上述干燥后股骨，在股骨干中段最细处平面和股骨头最大平面打磨抛光，真空喷碳处理后在1000B 扫描电镜下进行能谱分析(Amary, USA)。加速电压为20 kV，每处采样时间为50 s。每一处标本测定三个视野，取其平均值为最后结果。测定的元素包括钙(Ca)，磷(P)。
5.组织学观察：取左侧胫骨上段(以胫腓结合处为界)，去净附着软组织，自关节隆突下横断，分别观察松质骨和皮质骨改变。标本即刻入4%多聚甲醛固定24 h，后在4℃脱钙液(20%甲酸：20%柠檬酸三钠=1∶1)中脱钙5 d 至终点，室温逐级酒精脱水，氯仿透明，石蜡包埋，纵向切片，厚度为6 μm。采用文献[4]改良三色染色法染色，光镜下(Olympus, Japan)观察形态学变化。
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四、统计分析
所得数据均以
±s表示，采用SPSS7.0统计软件进行统计分析，利用方差分析和t检验检测各组间差异的显著性。结果
一、一般情况
C,S组大鼠在实验期间体重持续增加。实验结束时，两组大鼠的体重分别为：C组：(324.8±16.1) g；S组：(318.8±10.0) g，两组之间差异无显著性意义。肾上腺重量分别为:C组：(19.0±3.9) mg；S组：(22.2±3.2) mg，两组之间差异无显著性意义。提示采用本模型大鼠生长良好，应激反应较小。
二、悬吊大鼠股骨物理性状改变
, 百拇医药
S组大鼠股骨的湿重、干重、灰分、直径和密度均较C组大鼠下降(P<0.01)，长度间差异无显著意义，见表1。提示模拟失重抑制了大鼠股骨的生长代谢。
三、悬吊大鼠股骨生物力学特性改变
S组大鼠在股骨弹性载荷、最大载荷、刚性系数等方面均较C组下降(P<0.01)，最大挠度和韧性系数增大(P<0.01或P<0.05)，见表2。提示模拟失重引起大鼠股骨生物力学性能的全面下降。
四、能谱分析结果
S组大鼠股骨钙的百分比含量在股骨头部位较C组显著降低(P<0.05)，股骨干部位有下降的趋势；磷在两组之间差异无显著性意义，见表3。提示股骨局部钙的含量减少，以松质骨部分更显著。
表1 C,S组大鼠股骨(右)物理性状(
±s,各组n=7 ), 百拇医药
Tab 1 Basic physical items of rat femur(right) in C, S groups(
±s，n=7 for each group)对照组
Control group
悬吊组
Suspension group
t值
t value
P值
P value
, 百拇医药
湿重
Fresh femur(mg)
901±50
807±32
4.157
<0.01
干重
Dried femur(mg)
600±36
510±14
6.113
<0.01
, http://www.100md.com
灰分
Mineral femur(mg)
342±39
248±48
4.416
<0.01
直径
Diameter(mm)
2.37±0.21
2.00±0.15
3.833
<0.01
, http://www.100md.com
长度
Length(mm)
35.43±0.80
35.75±0.89
0.715
>0.05
湿重密度
Density(g*cm-3)
1.485±0.020
1.397±0.031
6.243
<0.01
, 百拇医药
表2 C,S组大鼠股骨(左)生物力学特性(
±s,各组n=7 )Tab 2 Mechanical parameters of rat femur(left) in C， S groups(
±s，n=7 for each group)对照组
Control group
悬吊组
Suspension group
t值
, 百拇医药 t value
P值
P value
弹性载荷
Elastic load(N)
66±17
40±3
3.991
<0.01
最大载荷
Maximum load (N)
102±19
, 百拇医药
68±9
4.256
<0.01
弹性挠度
Elastic deformation (mm)
0.25±0.04
0.24±0.06
0.543
>0.05
最大挠度
Maximum deformation(mm)
0.56±0.06
, 百拇医药
0.67±0.08
2.470
<0.05
刚性系数
Bending rigidity coefficient
(N*mm2×104)
2.2±0.5
1.5±0.3
3.396
<0.01
韧性系数
, http://www.100md.com
Bending toughness coefficient
(mm*N-1×10-2)
0.87±0.15
1.53±0.27
5.048
<0.01
表3 C,S组大鼠股骨(左)能谱分析结果(
±s,各组n=7)Tab 3 Energy spectrum analysis of rat femur(left) in C, S groups(
±s，n=7 for each group) 组别, http://www.100md.com
Groups
股骨头
Head of femur
股骨干
Midst of femur
钙
Calcium
磷
Phosphorus
钙
Calcium
磷
Phosphorus
, 百拇医药
对照组
Control group
77.20±0.21
19.29±0.33
82.93±2.74
14.86±3.15
悬吊组
Suspension group
75.20±1.78
20.07±1.34
79.60±5.57
, 百拇医药 18.50±5.67
t值
t value
2.647
1.383
1.315
1.371
P值
P value
<0.01
>0.05
>0.05
>0.05
, 百拇医药
五、组织形态学观察
C，S组大鼠胫骨组织切片在光学显微镜下观察见明显差别。三色染色法结果为骨样组织深蓝色、骨髓黄或橘黄色、矿化较好的骨基质砖红色、骨细胞橘黄或红色、软骨淡蓝色、钙化骨橘黄色、纤维组织蓝色、肌肉组织黄色或黄红色。在松质骨部分，C组大部分呈互相移行的红色区域，表明该处骨基质矿化良好，见图1(封4)；S组染色则以蓝色为主，表明骨基质中的矿物成分丧失，提示基质向矿化的骨样组织转化受到抑制，见图2(封4)。在骨干部位的皮质骨中，C组可见骨细胞和哈佛氏系统呈橘黄色，周围被砖红色的骨基质包围，钙盐主要通过哈佛氏系统运送至骨基质中，形成明显的矿化区，反映正常条件下皮质部分基质钙化作用显著，见图3(封4)；而S组中骨皮质主要是蓝色的骨细胞和蓝色的骨样组织围绕的哈佛氏系统，反映模拟失重后哈佛氏系统对钙盐的运送减少，骨基质钙化障碍。同时，S组的皮质骨中还可见到大量散在的蓝色点状着色，部分融合成较大的不规则蓝色区域，表明皮质骨中不仅有钙盐的丢失，而且伴随钙盐沉积不良，原有的沉积的钙盐出现了脱钙现象，见图4(封4)。讨论
, 百拇医药
在地面条件下，后肢去负荷大鼠模型能够成功地复制失重性骨丧失，同时应激作用很小，保持了大鼠健康生长，是一种被公认并得到广泛应用的模拟失重模型[5，6]。本实验采用我实验室改进的尾吊大鼠模型，大鼠在整个实验过程中生长状况良好。生长曲线反映出S组的体重在整个实验过程中始终保持增长趋势，与C组的体重始终无明显差异。实验结束时测量肾上腺重量两组间差异也无显著性意义。说明此模型产生的应激反应较小，对大鼠的整体生长无明显的影响。
生物力学特性是反映骨的生长代谢的一个重要指标。航天失重和模拟失重均可引起力学特性的显著降低，Cosmos飞行发现大鼠股骨和脊柱的力学性能下降[2]。Shaw等[7]利用后肢悬吊大鼠模型发现股骨的所有弯曲参数(硬度、负荷、能量)较对照组显著降低。以上结果提示失重引起骨力学性能降低，且主要发生在承重骨。崔伟等[8](1996)观察了不同时间长度的悬吊对松质骨(大鼠椎骨L3)生物力学特性的影响，发现L3的结构力学特性、杨氏模量、材料力学性能和骨强度均显著降低。马进等[9](1994)曾测量模拟失重90 d后密质骨的力学特性变化，发现股骨的硬度、强度、刚度各项参数均较对照组显著下降。本实验主要观察了3周模拟失重对股骨结构力学特性的影响，结果S组大鼠股骨的刚性(包括弹性载荷、最大载荷和刚性系数)和韧性性能(包括最大挠度、韧性系数)较C组显著下降，反映大鼠股骨结构力学特性的全面降低。提示3周悬吊引起大鼠后肢密质骨中小梁骨质量、结构连续性和皮质厚度降低[10]。
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通过X线设备的骨密度检测仪，或灰分的测量，以及钙磷的光密度分析等方法，大量证据都证实了失重/模拟失重情况下骨密度降低，骨钙含量下降[5，8]。本实验能谱分析得到类似的结果，模拟失重3周引起股骨头和股骨干两个部位钙的相对百分含量降低，同时灰分测定结果也表明总矿物质也是显著降低的。本实验还利用三色染色法直接观察了模拟失重后大鼠后肢骨的钙盐代谢的形态学变化，发现3周模拟失重后，原来矿化的骨皮质和骨松质都发生了明显的矿物盐的丢失(由红变蓝)，而且脱矿的骨样组织向骨基质的转化过程受到抑制。脱钙的方式在形态学上主要表现为两种类型：钙盐沉积障碍，即围绕哈佛氏系统周围形成脱钙环形区；原已钙化骨基质出现钙盐丢失，即骨基质中发生斑点状的钙丢失(蓝色斑点)，然后逐步扩大形成片状的脱钙区。能谱分析和三色染色结果均表明尾吊模拟失重可引起大鼠后肢骨钙盐的丢失，在松质骨部分主要表现为骨样组织向基质的转化不良，在皮质骨部分则表现为钙沉积障碍的同时伴随钙盐丢失。以上结果提示失重破坏了骨的钙盐沉积和吸收之间的平衡，调节钙盐的代谢机制发生了障碍，但其机理还有待进一步研究。
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基金项目：全军医药卫生科研基金资助项目(98Z083)
参考文献
1，Morey-Holton ER, Whalen RT, Arnaud SB, et al. The skeleton and its adaptation to gravity. Handbook of physiology, section 4: Environmental physiology. New York: Oxford University Press,1996.691-719.
2，Oganov VS, Schneider VS. Skeletal system. Humans in spaceflight. Volume 3, BookⅠ. Effects of microgravity. Reston VA:AIAA, 1996.247-266.
, 百拇医药
3，陈杰,马进,丁兆平,等.一种模拟长期失重影响的大鼠尾部悬吊模型.空间科学学报,1993,13(2)：159-162.
4，裘秀春,蒋维中,文艳华,等.生物活性材料动物实验组织制片法.第四军医大学学报,1999,20(12):S134-135.
5，Morey-Holton ER, Globus RK. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight.Bone,1998,22(5,Suppl):83S-88S.
6，Bikle DD, Halloran BP. The response of bone to unloading. J Bone Miner Metab,1999,17(4):233-244.
, 百拇医药
7，Shaw SR, Vailas AC, Grindeland RE, et al. Effects of a 1-wk spaceflight on morphological and mechanical properties of growing bone. Am J Physiol, 1988,254(1 Pt 2):R78-83.
8，崔伟,史之祯,郑强.不同悬吊时间对大鼠椎骨骨质和生物力学特性的影响.航天医学与医学工程.1996,9(3):190-194.
9，马进,陈杰,丁兆平,等.模拟失重九十天对大鼠长骨生物力学特性的影响.第四军医大学学报,1994,15(3)：218-220.
10，Mosekidle L, Danielsen CC, Knudsen UB, et al. The effect of aging and ovariectomy on the vertebral bone mass and biomechanical properties of mature rats. Bone, 1993,14(1): 1-6.
[收稿日期：2000-06-19], http://www.100md.com