胆囊胆汁CEA放射免疫分析
作者：杨军 吴友胜 龚少敏 陈健 周峰
单位：杨军 吴友胜 陈健 430015 武汉市职工医学院附属医院核医学科；龚少敏 周峰 430015 武汉市职工医学院附属医院外科
关键词：胆囊胆汁；癌胚抗原；结直肠肿瘤
放射学实践990419 【摘要】 目的：胆汁预处理测定癌胚抗原(CEA)并探讨胆囊胆汁CEA放射免疫分析的临床意义。方法：取胆囊胆汁用无水乙醇处理，38±2℃水浴吹干，1g/LBSA 40倍稀释(A-B法)，去除胆汁中抑制物对CEA测定的干扰，后用常规放免法测定CEA，同时分组观察结直肠良恶性疾病时CEA浓度的变化。结果：重复实验和回收实验结果表明，此法重复5～6次预处理胆汁样品后，变异系数7.3%～11.8%，回收率为56.7%～91.3%，比不经处理胆汁样品直接加样测定，检出值高出4～19倍。对临床结直肠良恶性疾病和结直肠肿瘤早期隐匿性肝转移具有较高的诊断价值。结论：胆囊胆汁CEA测定A-B法预处理时间短，方法简便，是一般实验室都能开展的一种实用可靠的检测方法。
, http://www.100md.com
Radioimmunoassay of carcinoembryonic antigen in
gallbladder bile
Yang Jun,Wu Yousheng,Gong Shaomin,et al.Affiliated Hospital of Wuhan College for Medical Staff,Wuhan 430015
【Abstract】 Objective:To study the clinical significance of determining the level of Carcinoembryonic Antigen in gallbladder bile by RIA.Methods:Gallbladder bile was treated by absolute alcohol then was blown in 38±2℃ water tank for dry and was diluted by 1g/l Bovine Serum Albumin (A-B method). This new method may remove biliary inhibitors that mayinterfere the detection Carcinoembryonic Antigen (CEA).Results:Coefficient of variation was low(7.3%～11.8%) and the rate of recovery high (56.7%～91%).The result of detection rate with this method was markedly greater (4～19 times) than examing bile directly.It is of significant value in the diagnosis of colorectal neoplasma and early diagnosis of small latent liver metastasis from colorectal cancer.Conclusion:It is rapid and easy on methodology that gallbladder bile was treat by A-B method for the detection of CEA.This method is practical and reliable in ordinary laboratory.
, 百拇医药
【Key words】 Gallbladder bile Carcinoembryonic antigen Tumor,Colorectal
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)是临床常用的诊断消化道肿瘤的指标之一。近年来，有人通过检测体液，特别是胆汁中CEA的含量来诊断胆囊的良、恶性疾病[1]，并作为判断结直肠肿瘤有否早期转移的重要指标[2，3]。但是，应用放射免疫分析的常规方法时，因未对胆汁加以有效处理，胆汁中的某些成份可以抑制CEA的检测灵敏度。为此，我们对胆汁作放射免疫分析前预处理，以期提高检出率。
方 法
样品来源 选择胆道和结、直肠癌病人35例，于外科手术中抽取胆囊胆汁5ml左右。立即4 000 rpm离心10min，取上层液待处理。
, http://www.100md.com
样品预处理 样品预处理采用两种方式进行。第一组取离心后胆汁上层液0.1ml置于青霉素小瓶中，加入无水乙醇1ml，充分混匀，放置于38±2℃水浴吹干(约1h左右)；再向青霉素小瓶中加不同量的1g/l牛血清白蛋白(BSA)，即称为A-B法，取得A-B稀释曲线，根据稀释曲线选择合适的稀释度。第二组取离心后胆汁0.1ml，直接用1g/l BSA作不同比例的稀释(称为BSA法)，用以对比两种方法的灵敏度。
实验方法 作胆汁预处理A-B法回收和重复实验，检验方法学灵敏度和可靠性；比较胆汁预处理和不处理结果差异，比较胆汁预处理和不处理对血清比值的差异，并检测部分临床病人胆汁。放免药盒采用3V放免诊断技术公司的产品。处理后胆汁加样量0.2ml，标准管容量差用蒸馏水补齐，全部双管平行测定，其它操作按药盒说明书进行。DFM-96型多管放免γ计数器测样，Log-Logit方式拟合曲线并计算结果。
结 果
, 百拇医药 1.胆汁CEA两种预处理方法稀释曲线结果比较
胆汁CEA A-B预处理和BSA预处理稀释曲线见图1。由图1可以看出：两种方法稀释度在40倍时，检测浓度基本达到峰值，加大稀释倍数，检出浓度不再提高，稀释到70倍左右时，样品CEA浓度不可测。表1是两种方法稀释度曲线比较。由表1可见：A-B法检测灵敏度大于BSA法，40倍时检测浓度高出46%，50～60倍时则高出130%～160%。但由于峰值位于40倍左右，故胆汁CEA预处理方法选用无水乙醇处理后，40倍1g/l BSA稀释即胆汁CEA测定预处理A-B法。
表1 两种方法稀释曲线比较 稀释倍数
A-B(ng/ml)
BSA(ng/ml)
A-B/BSA
, http://www.100md.com
10
177.76
189.86
0.93
20
280.97
253.47
1.11
30
329.37
233.43
1.41
40
, http://www.100md.com
401.95
275.52
1.46
50
411.04
154.53
2.66
60
295.91
126.88
2.33
2.胆汁CEA重复实验和回收实验
, 百拇医药 4组样品重复5～6次实验结果见表2。其中无一份样品大于±2SD，变异系数(CV%)最大11.8%。说明此法重复性好。图2是胆汁CEA A-B预处理回收曲线。加入定量胆汁0.1ml，加入已知含量CEA 0.1ml，5ng/ml CEA回收率为56.7%，10ng/ml为82.1%，20ng/ml为91.3%，40ng/ml为88.7%，80ng/ml为89.2%，相关系数r=0.9997，说明回收较好，检测结果可靠。未经处理的胆汁直接用于放免测定，灵敏度极低，经A-B法预处理后测定含量要高出不经处理的胆汁的测定含量4～19倍，平均约9倍左右。表2 胆汁CEA A-B预处理重复实验结果(ng/ml) 组别
n
N
R
M
SD
, 百拇医药
CV(%)
1
6
211.80-
258.54
236.64
17.71
7.4
2
6
24.22-
33.61
28.76
, 百拇医药
3.41
11.8
3
6
486.41-
608.74
551.53
54.31
9.8
4
5
297.55-
353.93
, 百拇医药
318.24
23.22
7.3
3.病人样品CEA检测水平比较
表3是病人胆汁和血清CEA比值比较。预处理后的胆汁/血清与不处理胆汁/血清比较，前者其比值远大于后者，各组内都存在显著差异。
表3 病人胆汁和血清CEA比值 疾病组
例数
预处理胆汁/血清
未处理胆汁/血清
P值
胆囊炎
, 百拇医药
4
21.93±7.43
4.25±3.42
<0.01
胆道梗阻
6
55.10±27.03
9.31±6.92
<0.01
结直肠癌
11
81.93±48.21
, 百拇医药 9.91±10.05
<0.01
肝转移
6
47.49±26.94
4.63±2.58
<0.01
病人胆汁预处理和不处理测定CEA水平的结果见表4。由表4可以看出：经A-B法处理后的胆汁测定出的CEA含量远高于不处理的胆汁，各组疾病内呈现显著统计学差异。四组疾病间肝转移含量最高，统计学分析除胆道梗阻与肝转移无统计差异外，其余各组间均有显著差异，但预处理后的胆汁测定结果其差异极显著，P值<0.01，而直接测定的胆汁结果P值<0.05。表4 病人胆汁预处理和未处理测定CEA水平(ng/ml) 疾病组
, http://www.100md.com
例数
预处理胆汁
未处理胆汁
P值
胆囊炎
7
107.10±33.49
116.43±8.09
<0.01
胆道梗阻
9
697.65±312.40
117.15±71.66
, 百拇医药
<0.01
结直肠癌
13
378.06±83.08
144.05±28.54
<0.01
肝转移
6
960.92±399.06
105.43±71.88
<0.01
注：四组疾病除胆道梗阻与肝转移组间比较P>0.05外，其余各组间预处理胆汁P<0.01；未处理胆汁P<0.05。讨 论
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CEA是一种分子量200 000的糖蛋白，胆汁中的CEA由于受到胆汁中胆酸、蛋白质和脂质等的抑制，未经处理其检出浓度极低。又因为胆汁成份个体之间有明显差异，抑制物成份越多，检出浓度越低。因此不经处理时检出结果误差极大，常给临床诊断带来困难[2]。单用BSA稀释，虽可调节等电点，去除胆酸的抑制[1]，但无法去除其它大分子蛋白质和脂质的抑制。我们用无水乙醇使胆汁中抑制蛋白变性，使脂质溶解，而糖蛋白在乙醇中不会变性，且即使有部分变性也能在适当的溶剂中恢复原来特性。结果证明，用乙醇处理后再用BSA稀释，检出含量高。重复实验和回收实验证明，此法结果可靠。
近年认为浸浴于肿瘤部位的体液中相关肿瘤标志物浓度增高，当结直肠肿瘤发生肝转移时，胆汁中CEA含量增高[3]，血清不一定能相应增高。本文结直肠肿瘤高于胆囊炎，结直肠癌肝转移时胆汁CEA含量最高，与无转移者相比具有显著统计学差异，有胆道梗阻时，由于胆汁淤积，其胆汁中CEA浓度亦增高。结果显示，胆汁CEA浓度测定，对于结直肠肿瘤是否存在小的隐匿性肝转移灶，即亚临床型肝转移具有明显的临床价值。
, 百拇医药
胆囊胆汁CEA测定A-B预处理方法是一种快速(1h)、高灵敏度的检测方法，它比国内有人采用的单纯BSA稀释法检出灵敏度高，比国外采用的过氯酸处理法简便、快速，且无需过多的设备，在目前国内一般实验室条件有限的情况下，它是一种实用可靠的检测方法。
参考文献
1 吕德明，梁力建，彭宝岗，等.胆囊胆汁CEA测定诊断胆囊良恶性病变的价值.中华消化杂志，1994，14∶79-81.
2 Yeatman TJ,Bland KI,Hollenbeck JI,et al.Relationship between colorectal liver metastases and CEA levels in gallbladder bile.Ann Surg,1989,201∶505.
3 Yeatman TJ,Kimura AK,Copeland EM,et al.Rapid analysis of Carcinoembryonic antigen levels in gallbladder bile.Ann Surg,1991,213∶113.
(1999-04-14 收稿), http://www.100md.com
单位：杨军 吴友胜 陈健 430015 武汉市职工医学院附属医院核医学科；龚少敏 周峰 430015 武汉市职工医学院附属医院外科
关键词：胆囊胆汁；癌胚抗原；结直肠肿瘤
放射学实践990419 【摘要】 目的：胆汁预处理测定癌胚抗原(CEA)并探讨胆囊胆汁CEA放射免疫分析的临床意义。方法：取胆囊胆汁用无水乙醇处理，38±2℃水浴吹干，1g/LBSA 40倍稀释(A-B法)，去除胆汁中抑制物对CEA测定的干扰，后用常规放免法测定CEA，同时分组观察结直肠良恶性疾病时CEA浓度的变化。结果：重复实验和回收实验结果表明，此法重复5～6次预处理胆汁样品后，变异系数7.3%～11.8%，回收率为56.7%～91.3%，比不经处理胆汁样品直接加样测定，检出值高出4～19倍。对临床结直肠良恶性疾病和结直肠肿瘤早期隐匿性肝转移具有较高的诊断价值。结论：胆囊胆汁CEA测定A-B法预处理时间短，方法简便，是一般实验室都能开展的一种实用可靠的检测方法。
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Radioimmunoassay of carcinoembryonic antigen in
gallbladder bile
Yang Jun,Wu Yousheng,Gong Shaomin,et al.Affiliated Hospital of Wuhan College for Medical Staff,Wuhan 430015
【Abstract】 Objective:To study the clinical significance of determining the level of Carcinoembryonic Antigen in gallbladder bile by RIA.Methods:Gallbladder bile was treated by absolute alcohol then was blown in 38±2℃ water tank for dry and was diluted by 1g/l Bovine Serum Albumin (A-B method). This new method may remove biliary inhibitors that mayinterfere the detection Carcinoembryonic Antigen (CEA).Results:Coefficient of variation was low(7.3%～11.8%) and the rate of recovery high (56.7%～91%).The result of detection rate with this method was markedly greater (4～19 times) than examing bile directly.It is of significant value in the diagnosis of colorectal neoplasma and early diagnosis of small latent liver metastasis from colorectal cancer.Conclusion:It is rapid and easy on methodology that gallbladder bile was treat by A-B method for the detection of CEA.This method is practical and reliable in ordinary laboratory.
, 百拇医药
【Key words】 Gallbladder bile Carcinoembryonic antigen Tumor,Colorectal
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)是临床常用的诊断消化道肿瘤的指标之一。近年来，有人通过检测体液，特别是胆汁中CEA的含量来诊断胆囊的良、恶性疾病[1]，并作为判断结直肠肿瘤有否早期转移的重要指标[2，3]。但是，应用放射免疫分析的常规方法时，因未对胆汁加以有效处理，胆汁中的某些成份可以抑制CEA的检测灵敏度。为此，我们对胆汁作放射免疫分析前预处理，以期提高检出率。
方 法
样品来源 选择胆道和结、直肠癌病人35例，于外科手术中抽取胆囊胆汁5ml左右。立即4 000 rpm离心10min，取上层液待处理。
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样品预处理 样品预处理采用两种方式进行。第一组取离心后胆汁上层液0.1ml置于青霉素小瓶中，加入无水乙醇1ml，充分混匀，放置于38±2℃水浴吹干(约1h左右)；再向青霉素小瓶中加不同量的1g/l牛血清白蛋白(BSA)，即称为A-B法，取得A-B稀释曲线，根据稀释曲线选择合适的稀释度。第二组取离心后胆汁0.1ml，直接用1g/l BSA作不同比例的稀释(称为BSA法)，用以对比两种方法的灵敏度。
实验方法 作胆汁预处理A-B法回收和重复实验，检验方法学灵敏度和可靠性；比较胆汁预处理和不处理结果差异，比较胆汁预处理和不处理对血清比值的差异，并检测部分临床病人胆汁。放免药盒采用3V放免诊断技术公司的产品。处理后胆汁加样量0.2ml，标准管容量差用蒸馏水补齐，全部双管平行测定，其它操作按药盒说明书进行。DFM-96型多管放免γ计数器测样，Log-Logit方式拟合曲线并计算结果。
结 果
, 百拇医药 1.胆汁CEA两种预处理方法稀释曲线结果比较
胆汁CEA A-B预处理和BSA预处理稀释曲线见图1。由图1可以看出：两种方法稀释度在40倍时，检测浓度基本达到峰值，加大稀释倍数，检出浓度不再提高，稀释到70倍左右时，样品CEA浓度不可测。表1是两种方法稀释度曲线比较。由表1可见：A-B法检测灵敏度大于BSA法，40倍时检测浓度高出46%，50～60倍时则高出130%～160%。但由于峰值位于40倍左右，故胆汁CEA预处理方法选用无水乙醇处理后，40倍1g/l BSA稀释即胆汁CEA测定预处理A-B法。
表1 两种方法稀释曲线比较 稀释倍数
A-B(ng/ml)
BSA(ng/ml)
A-B/BSA
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10
177.76
189.86
0.93
20
280.97
253.47
1.11
30
329.37
233.43
1.41
40
, http://www.100md.com
401.95
275.52
1.46
50
411.04
154.53
2.66
60
295.91
126.88
2.33
2.胆汁CEA重复实验和回收实验
, 百拇医药 4组样品重复5～6次实验结果见表2。其中无一份样品大于±2SD，变异系数(CV%)最大11.8%。说明此法重复性好。图2是胆汁CEA A-B预处理回收曲线。加入定量胆汁0.1ml，加入已知含量CEA 0.1ml，5ng/ml CEA回收率为56.7%，10ng/ml为82.1%，20ng/ml为91.3%，40ng/ml为88.7%，80ng/ml为89.2%，相关系数r=0.9997，说明回收较好，检测结果可靠。未经处理的胆汁直接用于放免测定，灵敏度极低，经A-B法预处理后测定含量要高出不经处理的胆汁的测定含量4～19倍，平均约9倍左右。表2 胆汁CEA A-B预处理重复实验结果(ng/ml) 组别
n
N
R
M
SD
, 百拇医药
CV(%)
1
6
211.80-
258.54
236.64
17.71
7.4
2
6
24.22-
33.61
28.76
, 百拇医药
3.41
11.8
3
6
486.41-
608.74
551.53
54.31
9.8
4
5
297.55-
353.93
, 百拇医药
318.24
23.22
7.3
3.病人样品CEA检测水平比较
表3是病人胆汁和血清CEA比值比较。预处理后的胆汁/血清与不处理胆汁/血清比较，前者其比值远大于后者，各组内都存在显著差异。
表3 病人胆汁和血清CEA比值 疾病组
例数
预处理胆汁/血清
未处理胆汁/血清
P值
胆囊炎
, 百拇医药
4
21.93±7.43
4.25±3.42
<0.01
胆道梗阻
6
55.10±27.03
9.31±6.92
<0.01
结直肠癌
11
81.93±48.21
, 百拇医药 9.91±10.05
<0.01
肝转移
6
47.49±26.94
4.63±2.58
<0.01
病人胆汁预处理和不处理测定CEA水平的结果见表4。由表4可以看出：经A-B法处理后的胆汁测定出的CEA含量远高于不处理的胆汁，各组疾病内呈现显著统计学差异。四组疾病间肝转移含量最高，统计学分析除胆道梗阻与肝转移无统计差异外，其余各组间均有显著差异，但预处理后的胆汁测定结果其差异极显著，P值<0.01，而直接测定的胆汁结果P值<0.05。表4 病人胆汁预处理和未处理测定CEA水平(ng/ml) 疾病组
, http://www.100md.com
例数
预处理胆汁
未处理胆汁
P值
胆囊炎
7
107.10±33.49
116.43±8.09
<0.01
胆道梗阻
9
697.65±312.40
117.15±71.66
, 百拇医药
<0.01
结直肠癌
13
378.06±83.08
144.05±28.54
<0.01
肝转移
6
960.92±399.06
105.43±71.88
<0.01
注：四组疾病除胆道梗阻与肝转移组间比较P>0.05外，其余各组间预处理胆汁P<0.01；未处理胆汁P<0.05。讨 论
, http://www.100md.com
CEA是一种分子量200 000的糖蛋白，胆汁中的CEA由于受到胆汁中胆酸、蛋白质和脂质等的抑制，未经处理其检出浓度极低。又因为胆汁成份个体之间有明显差异，抑制物成份越多，检出浓度越低。因此不经处理时检出结果误差极大，常给临床诊断带来困难[2]。单用BSA稀释，虽可调节等电点，去除胆酸的抑制[1]，但无法去除其它大分子蛋白质和脂质的抑制。我们用无水乙醇使胆汁中抑制蛋白变性，使脂质溶解，而糖蛋白在乙醇中不会变性，且即使有部分变性也能在适当的溶剂中恢复原来特性。结果证明，用乙醇处理后再用BSA稀释，检出含量高。重复实验和回收实验证明，此法结果可靠。
近年认为浸浴于肿瘤部位的体液中相关肿瘤标志物浓度增高，当结直肠肿瘤发生肝转移时，胆汁中CEA含量增高[3]，血清不一定能相应增高。本文结直肠肿瘤高于胆囊炎，结直肠癌肝转移时胆汁CEA含量最高，与无转移者相比具有显著统计学差异，有胆道梗阻时，由于胆汁淤积，其胆汁中CEA浓度亦增高。结果显示，胆汁CEA浓度测定，对于结直肠肿瘤是否存在小的隐匿性肝转移灶，即亚临床型肝转移具有明显的临床价值。
, 百拇医药
胆囊胆汁CEA测定A-B预处理方法是一种快速(1h)、高灵敏度的检测方法，它比国内有人采用的单纯BSA稀释法检出灵敏度高，比国外采用的过氯酸处理法简便、快速，且无需过多的设备，在目前国内一般实验室条件有限的情况下，它是一种实用可靠的检测方法。
参考文献
1 吕德明，梁力建，彭宝岗，等.胆囊胆汁CEA测定诊断胆囊良恶性病变的价值.中华消化杂志，1994，14∶79-81.
2 Yeatman TJ,Bland KI,Hollenbeck JI,et al.Relationship between colorectal liver metastases and CEA levels in gallbladder bile.Ann Surg,1989,201∶505.
3 Yeatman TJ,Kimura AK,Copeland EM,et al.Rapid analysis of Carcinoembryonic antigen levels in gallbladder bile.Ann Surg,1991,213∶113.
(1999-04-14 收稿), http://www.100md.com