端粒酶RNA组分和端粒酶活性与喉癌的相关性研究
作者：杜宝东 王苹 刘钢 张凤兰
单位：杜宝东(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；王苹(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；刘钢(吉林大学生命科学院)；张凤兰(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)
关键词：端粒酶活性；喉肿瘤；端粒酶重复扩增法
临床耳鼻咽喉科杂志000902 摘要 目的：进一步了解端粒酶活性和端粒酶RNA组分(hTR)与喉癌发生、发展的关系，并建立喉癌的早期诊断标准。方法：采用端粒酶重复扩增法和原位杂交法对正常组织、声带息肉、癌前病变和喉癌进行hTR和端粒酶活性分析。结果：①所有组织均表达不同水平的hTR,hTR阳性率随着喉癌的临床分期逐渐增加，但无统计学差异。②39例(78%)的喉癌组织表达端粒酶活性，声带息肉仅1例(8.3%)表达，不同分化的喉癌组织端粒酶活性有差异。结论：端粒酶活化是喉癌发生的早期事件，检测端粒酶活性可判定临床喉部肿瘤的良恶性。但hTR与端粒酶表达不一致，不能作为预测端粒酶活性的指标。
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Telomerase activity and expression of its RNA
component in laryngeal cancer
DU Bao-dong WANG Ping ZHANG Feng-lan
(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,First Teaching Hospital
of Bethune University of Medical Sciences,Changchun 1300210)
LIU Gang
(Life Sciences College of Jilin University)
, 百拇医药
Abstract Objective:Expression of telomerase activity and telomerase RNA component have been reported in various human cancers.In the article,we ascertained whether telomerase activity and hTR changes are charateristic of laryngeal cancer.Method:Telomerase activity were examined by telomeric repeat amplification protocol(Trap) and hTR examined by in situ hybridization,in tissue samples from 50 laryngeal cancer,12 laryngeal polyps,14 precarcinous,9 normal laryngeal tissue.Result:①All tissue expressed various levels of hTR.Positive rate of hTR increased with the clinical stage,but no significant correlation was observed,as well as lymph node metastasis.②The telomerase activity were detected in samples 39 of the 50 laryngeal cancer(78%).However,in 12 cases of begin lesions only 8.3%(1/12).Telomerase activity was found to have a relationship with the grade of tumor differentiation.Poorly differentiated laryngeal cancer expressed high level telomerase activity.Conclusion:Telomerase activity were an early event of laryngeal cancer.It suggests that detection of telomerase activity could be a good diagnostic marker for distinguish cancer from normal cell.
, 百拇医药
Key words Telomerase activity Laryngeal neoplasms Telomeric repeat amplification protocol
端粒酶(telomerase)是一种核糖核蛋白酶，是由RNA和蛋白质组成的复合物。除生殖细胞和少数造血细胞外，其余体细胞端粒酶均处于失活状态。最近的研究表明，在细胞永生化过程中端粒酶的激活是一个非常重要的步骤，在肿瘤细胞中端粒酶活性增高。有关端粒酶RNA组分(hTR)及酶活性与喉癌的发生、发展及预后的关系尚不清楚，为此我们作了如下研究。
1 资料与方法
1.1 临床资料
1997～1998年的喉癌住院患者50例，其中男39例，女11例；年龄35～76岁。声门上型20例，声门型10例，声门下型20例。肿瘤的临床分期按UICC TNM分期方案(1987)：T1期9例，T2期15例，T3期19例，T4期7例。病理分级为Ⅰ级喉癌10例，Ⅱ级25例，Ⅲ级15例，其中有淋巴结转移者26例。另选35例作对照，其中癌前病变14例(包括声带白斑、不典型增生)，声带息肉12例，正常喉粘膜9例。以上病例均行病理切片。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 hTR原位杂交：切片脱蜡至水，PBS洗1次，室温下0.1 mol/L HCl处理30 min，移入2×SSC溶液中，65℃ 20 min后用乙醇脱水，滴加20 μl杂交液(DiG-hTR探针)放入湿盒中37℃ 24 h。将切片放入2×SSC(50%甲酰胺)中。用Buffer洗2次，马血清封闭20 min。加入Anti-Dig-AP 1 h。在暗处用NBT/BCIP显色30 min，观察结果。
1.2.2 TRAP法检测端粒酶活性〔1〕：取50 mg肿瘤冰冻组织，剪碎，加入冰冻洗涤液(10 mmol/L HEPES，1.5mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT)1 ml，4℃ 3 500 r/min离心10 min，弃上清，加入50 μl预冷裂解液(CHAPS)，冰浴30 min，4℃ 14 000 r/min离心10 min，取上清置-70℃保存。取10 μl提取液，加入20 u RNasesA作用30 min，作为对照。分别取2 μl样本和对照提取液，加入2.5μl 10×PCR Buffer，1 μl 4 mmol/L dNTP，0.5 μl TS引物(5′-AATCCGTCGAGCA-
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GAGTT-3′)，2 u Taq酶，0.2 μl α-32P-dCTP(3.7×1011 uBq/μl，1.11×1014Bq/mmol)。并使总反应体系达到25 μl。20℃延伸30 min，90℃ 1.5 min，之后加入0.5 μl CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCT-
TACCCTAA-3′)。94℃ 45 s、50℃ 45 s、72℃1.5 min，31 cycles。取PCR产物10 μl于15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影。
2 结果
2.1 喉癌、癌旁组织、声带息肉及癌前病变组织hTR的表达
结果发现喉癌、癌旁组织、声带息肉及癌前病变组织均表达hTR。细胞胞浆均染成紫蓝色，少数细胞核着色，经图像分析仪处理，根据灰度值确定hTR含量(表1)。喉良性病变及不同分化的喉癌组织hTR表达无明显差异(P>0.05)。
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表1 喉癌组织及非喉癌组织hTR的表达
±s 组织类型
例数
表达强度(灰度值)
正常喉粘膜
9
173.6±75.4
声带息肉
12
170.0±68.2
癌前病变
14
, 百拇医药
165.5±62.6
喉癌
Ⅰ级
10
168.7±77.3
Ⅱ级
25
164.2±60.3
Ⅲ级
15
168.8±67.8
2.2 hTR表达与喉癌临床分期及淋巴结转移
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将灰度值小于180的hTR表达定为阳性。50例喉癌患者，Ⅰ～Ⅳ期的hTR阳性率分别为77.78%、80.80%、84.21%和85.71%。hTR阳性率随临床分期逐渐增加，但无统计学意义(P>0.05)。有淋巴结转移的26例中，hTR阳性表达21例；无淋巴结转移的24例中，阳性表达20例。两者无明显差异。
2.3 端粒酶活性与喉癌组织分化
采用Trap法检测喉癌及相关组织的端粒酶活性(图1)，结果发现39例(78%)喉癌组织表达端粒酶活性，而声带息肉仅1例(8.3%)表达。正常喉粘膜为阴性。不同分化的癌组织，端粒酶活性有明显差异(P<0.01)，见表2。但端粒酶活性与喉癌临床分期、淋巴结转移无明显相关。
表2 不同分化的喉癌组织的端粒酶活性 病理分级
例数
, 百拇医药
端粒酶活性
阳性率
/%
+
-
Ⅰ
10
6
4
60.0
Ⅱ
25
19
6
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76.01)
Ⅲ
15
14
1
93.31)
组间比较，1)P<0.01
图1 喉癌组织端粒酶检测结果
1～8，13，15～17为喉癌组织，9～11，14为声带息肉，12为正常喉粘膜
3 讨论
, 百拇医药
迄今研究发现，人体肿瘤端粒酶活性平均阳性率为84.8%，癌旁组织及正常组织端粒酶活性仅为4.2%〔2〕。Haugen等〔3〕采用Trap法检测了24例甲状腺癌，发现60%的甲状腺浸润癌端粒酶活性是阳性，而非浸润性癌仅25%表达。临床上也发现端粒酶活性与手术患者的预后有关。Hiyaman等〔4〕通过对胃癌患者的研究发现，端粒酶阳性者肿瘤病灶较阴性者大，淋巴结转移率高。在对乳腺癌、神经母细胞瘤的研究中也得到了类似的结果。本文采用Trap法对喉癌及喉良性病变组织进行了端粒酶活性分析，结果表明，端粒酶活性在喉癌中的阳性率为78%，其中有端粒酶活性的高分化喉癌为60%，而声带息肉为8.3%，两者有明显差异。可见端粒酶活性与喉癌的发生密切相关，是喉癌发生的早期事件。进一步分析发现，端粒酶的阳性率与肿瘤的分化有关，低分化喉癌的端粒酶的阳性率达93.3%，明显高于高分化喉癌，表明恶性程度高的肿瘤有较强的端粒酶活性。但也有证据表明，端粒酶活性与子宫肿瘤的病理分级及浸润无关〔5〕。可见不同的肿瘤中端粒酶活性状态存在着差异。通过对喉癌的临床分期、淋巴结转移与端粒酶活性分析，发现虽然端粒酶活性阳性率随临床分期呈增高的趋势，但无统计学意义。淋巴结转移阴性与阳性的肿瘤，端粒酶活性无明显差别。说明端粒酶只是在组织恶性变过程中起关键作用，端粒酶活化使恶变的喉癌细胞能够无限制地分裂繁殖下去，而在喉癌细胞向基质浸润和淋巴结转移的过程中无明显作用。
, 百拇医药
本文采用原位杂交和Trap法同时检测hTR和端粒酶活性。发现喉癌病理分级、癌前病变、声带息肉、正常喉粘膜，其hTR表达灰度值无明显差别，hTR表达与细胞分化无明显相关。可见细胞中端粒酶RNA普遍存在，无端粒酶活性的细胞仍可检测到hTR，说明端粒酶的活化是细胞永生化的关键步骤。虽然肿瘤的hTR阳性程度略高于正常组织及良性病变，但hTR水平与端粒酶活性并不平行，故hTR水平不是很好预测端粒酶活性的指标，也不能作为喉癌早期诊断的标准。由于78%的喉癌组织呈端粒酶阳性，而在正常组织和良性病变中则为阴性或表达较低，因而提示可利用端粒酶活性对肿瘤进行良恶性的鉴别。同时采用端粒酶活性抑制剂进行喉癌的治疗，这些问题有待进一步研究。
参考文献
1，Kim N W,Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific assoliation of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266:2011～2015
, 百拇医药
2，Counter C M,Hirte H W,Bacchecti S,et al.Telomerase activity in human ovarian carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:2900～2904
3，Haugen B R,Nawaz S,Markham N,et al.Telomerase activity in begin and malignant thyroid tumors.Thyroid,1997,7:337～342
4，Hiyaman E,Yokoyama T,Tat N,et al.Telomerase activity ingastrie cancer.Cancer Res,1995,55:3258～3263
5，Brien T P,Kallakury B V,Lowry C V,et al.Telomerase activity in begin endometrivm and endometrial carcinoma.Cancer Res,1997,57:2760～2764
(收稿 1999-01-27 修回 2000-04-14), 百拇医药
单位：杜宝东(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；王苹(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)；刘钢(吉林大学生命科学院)；张凤兰(白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科 长春，130021)
关键词：端粒酶活性；喉肿瘤；端粒酶重复扩增法
临床耳鼻咽喉科杂志000902 摘要 目的：进一步了解端粒酶活性和端粒酶RNA组分(hTR)与喉癌发生、发展的关系，并建立喉癌的早期诊断标准。方法：采用端粒酶重复扩增法和原位杂交法对正常组织、声带息肉、癌前病变和喉癌进行hTR和端粒酶活性分析。结果：①所有组织均表达不同水平的hTR,hTR阳性率随着喉癌的临床分期逐渐增加，但无统计学差异。②39例(78%)的喉癌组织表达端粒酶活性，声带息肉仅1例(8.3%)表达，不同分化的喉癌组织端粒酶活性有差异。结论：端粒酶活化是喉癌发生的早期事件，检测端粒酶活性可判定临床喉部肿瘤的良恶性。但hTR与端粒酶表达不一致，不能作为预测端粒酶活性的指标。
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Telomerase activity and expression of its RNA
component in laryngeal cancer
DU Bao-dong WANG Ping ZHANG Feng-lan
(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,First Teaching Hospital
of Bethune University of Medical Sciences,Changchun 1300210)
LIU Gang
(Life Sciences College of Jilin University)
, 百拇医药
Abstract Objective:Expression of telomerase activity and telomerase RNA component have been reported in various human cancers.In the article,we ascertained whether telomerase activity and hTR changes are charateristic of laryngeal cancer.Method:Telomerase activity were examined by telomeric repeat amplification protocol(Trap) and hTR examined by in situ hybridization,in tissue samples from 50 laryngeal cancer,12 laryngeal polyps,14 precarcinous,9 normal laryngeal tissue.Result:①All tissue expressed various levels of hTR.Positive rate of hTR increased with the clinical stage,but no significant correlation was observed,as well as lymph node metastasis.②The telomerase activity were detected in samples 39 of the 50 laryngeal cancer(78%).However,in 12 cases of begin lesions only 8.3%(1/12).Telomerase activity was found to have a relationship with the grade of tumor differentiation.Poorly differentiated laryngeal cancer expressed high level telomerase activity.Conclusion:Telomerase activity were an early event of laryngeal cancer.It suggests that detection of telomerase activity could be a good diagnostic marker for distinguish cancer from normal cell.
, 百拇医药
Key words Telomerase activity Laryngeal neoplasms Telomeric repeat amplification protocol
端粒酶(telomerase)是一种核糖核蛋白酶，是由RNA和蛋白质组成的复合物。除生殖细胞和少数造血细胞外，其余体细胞端粒酶均处于失活状态。最近的研究表明，在细胞永生化过程中端粒酶的激活是一个非常重要的步骤，在肿瘤细胞中端粒酶活性增高。有关端粒酶RNA组分(hTR)及酶活性与喉癌的发生、发展及预后的关系尚不清楚，为此我们作了如下研究。
1 资料与方法
1.1 临床资料
1997～1998年的喉癌住院患者50例，其中男39例，女11例；年龄35～76岁。声门上型20例，声门型10例，声门下型20例。肿瘤的临床分期按UICC TNM分期方案(1987)：T1期9例，T2期15例，T3期19例，T4期7例。病理分级为Ⅰ级喉癌10例，Ⅱ级25例，Ⅲ级15例，其中有淋巴结转移者26例。另选35例作对照，其中癌前病变14例(包括声带白斑、不典型增生)，声带息肉12例，正常喉粘膜9例。以上病例均行病理切片。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 hTR原位杂交：切片脱蜡至水，PBS洗1次，室温下0.1 mol/L HCl处理30 min，移入2×SSC溶液中，65℃ 20 min后用乙醇脱水，滴加20 μl杂交液(DiG-hTR探针)放入湿盒中37℃ 24 h。将切片放入2×SSC(50%甲酰胺)中。用Buffer洗2次，马血清封闭20 min。加入Anti-Dig-AP 1 h。在暗处用NBT/BCIP显色30 min，观察结果。
1.2.2 TRAP法检测端粒酶活性〔1〕：取50 mg肿瘤冰冻组织，剪碎，加入冰冻洗涤液(10 mmol/L HEPES，1.5mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT)1 ml，4℃ 3 500 r/min离心10 min，弃上清，加入50 μl预冷裂解液(CHAPS)，冰浴30 min，4℃ 14 000 r/min离心10 min，取上清置-70℃保存。取10 μl提取液，加入20 u RNasesA作用30 min，作为对照。分别取2 μl样本和对照提取液，加入2.5μl 10×PCR Buffer，1 μl 4 mmol/L dNTP，0.5 μl TS引物(5′-AATCCGTCGAGCA-
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GAGTT-3′)，2 u Taq酶，0.2 μl α-32P-dCTP(3.7×1011 uBq/μl，1.11×1014Bq/mmol)。并使总反应体系达到25 μl。20℃延伸30 min，90℃ 1.5 min，之后加入0.5 μl CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCT-
TACCCTAA-3′)。94℃ 45 s、50℃ 45 s、72℃1.5 min，31 cycles。取PCR产物10 μl于15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影。
2 结果
2.1 喉癌、癌旁组织、声带息肉及癌前病变组织hTR的表达
结果发现喉癌、癌旁组织、声带息肉及癌前病变组织均表达hTR。细胞胞浆均染成紫蓝色，少数细胞核着色，经图像分析仪处理，根据灰度值确定hTR含量(表1)。喉良性病变及不同分化的喉癌组织hTR表达无明显差异(P>0.05)。
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表1 喉癌组织及非喉癌组织hTR的表达
±s 组织类型例数
表达强度(灰度值)
正常喉粘膜
9
173.6±75.4
声带息肉
12
170.0±68.2
癌前病变
14
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165.5±62.6
喉癌
Ⅰ级
10
168.7±77.3
Ⅱ级
25
164.2±60.3
Ⅲ级
15
168.8±67.8
2.2 hTR表达与喉癌临床分期及淋巴结转移
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将灰度值小于180的hTR表达定为阳性。50例喉癌患者，Ⅰ～Ⅳ期的hTR阳性率分别为77.78%、80.80%、84.21%和85.71%。hTR阳性率随临床分期逐渐增加，但无统计学意义(P>0.05)。有淋巴结转移的26例中，hTR阳性表达21例；无淋巴结转移的24例中，阳性表达20例。两者无明显差异。
2.3 端粒酶活性与喉癌组织分化
采用Trap法检测喉癌及相关组织的端粒酶活性(图1)，结果发现39例(78%)喉癌组织表达端粒酶活性，而声带息肉仅1例(8.3%)表达。正常喉粘膜为阴性。不同分化的癌组织，端粒酶活性有明显差异(P<0.01)，见表2。但端粒酶活性与喉癌临床分期、淋巴结转移无明显相关。
表2 不同分化的喉癌组织的端粒酶活性 病理分级
例数
, 百拇医药
端粒酶活性
阳性率
/%
+
-
Ⅰ
10
6
4
60.0
Ⅱ
25
19
6
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76.01)
Ⅲ
15
14
1
93.31)
组间比较，1)P<0.01
图1 喉癌组织端粒酶检测结果
1～8，13，15～17为喉癌组织，9～11，14为声带息肉，12为正常喉粘膜
3 讨论
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迄今研究发现，人体肿瘤端粒酶活性平均阳性率为84.8%，癌旁组织及正常组织端粒酶活性仅为4.2%〔2〕。Haugen等〔3〕采用Trap法检测了24例甲状腺癌，发现60%的甲状腺浸润癌端粒酶活性是阳性，而非浸润性癌仅25%表达。临床上也发现端粒酶活性与手术患者的预后有关。Hiyaman等〔4〕通过对胃癌患者的研究发现，端粒酶阳性者肿瘤病灶较阴性者大，淋巴结转移率高。在对乳腺癌、神经母细胞瘤的研究中也得到了类似的结果。本文采用Trap法对喉癌及喉良性病变组织进行了端粒酶活性分析，结果表明，端粒酶活性在喉癌中的阳性率为78%，其中有端粒酶活性的高分化喉癌为60%，而声带息肉为8.3%，两者有明显差异。可见端粒酶活性与喉癌的发生密切相关，是喉癌发生的早期事件。进一步分析发现，端粒酶的阳性率与肿瘤的分化有关，低分化喉癌的端粒酶的阳性率达93.3%，明显高于高分化喉癌，表明恶性程度高的肿瘤有较强的端粒酶活性。但也有证据表明，端粒酶活性与子宫肿瘤的病理分级及浸润无关〔5〕。可见不同的肿瘤中端粒酶活性状态存在着差异。通过对喉癌的临床分期、淋巴结转移与端粒酶活性分析，发现虽然端粒酶活性阳性率随临床分期呈增高的趋势，但无统计学意义。淋巴结转移阴性与阳性的肿瘤，端粒酶活性无明显差别。说明端粒酶只是在组织恶性变过程中起关键作用，端粒酶活化使恶变的喉癌细胞能够无限制地分裂繁殖下去，而在喉癌细胞向基质浸润和淋巴结转移的过程中无明显作用。
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本文采用原位杂交和Trap法同时检测hTR和端粒酶活性。发现喉癌病理分级、癌前病变、声带息肉、正常喉粘膜，其hTR表达灰度值无明显差别，hTR表达与细胞分化无明显相关。可见细胞中端粒酶RNA普遍存在，无端粒酶活性的细胞仍可检测到hTR，说明端粒酶的活化是细胞永生化的关键步骤。虽然肿瘤的hTR阳性程度略高于正常组织及良性病变，但hTR水平与端粒酶活性并不平行，故hTR水平不是很好预测端粒酶活性的指标，也不能作为喉癌早期诊断的标准。由于78%的喉癌组织呈端粒酶阳性，而在正常组织和良性病变中则为阴性或表达较低，因而提示可利用端粒酶活性对肿瘤进行良恶性的鉴别。同时采用端粒酶活性抑制剂进行喉癌的治疗，这些问题有待进一步研究。
参考文献
1，Kim N W,Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific assoliation of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266:2011～2015
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2，Counter C M,Hirte H W,Bacchecti S,et al.Telomerase activity in human ovarian carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:2900～2904
3，Haugen B R,Nawaz S,Markham N,et al.Telomerase activity in begin and malignant thyroid tumors.Thyroid,1997,7:337～342
4，Hiyaman E,Yokoyama T,Tat N,et al.Telomerase activity ingastrie cancer.Cancer Res,1995,55:3258～3263
5，Brien T P,Kallakury B V,Lowry C V,et al.Telomerase activity in begin endometrivm and endometrial carcinoma.Cancer Res,1997,57:2760～2764
(收稿 1999-01-27 修回 2000-04-14), 百拇医药