氨基糖苷类抗生素的体内分析方法
作者：尔艳 孙长山
单位：沈阳药科大学药学系，沈阳 110015
关键词：氨基糖苷类抗生素；体内分析；庆大霉素
沈阳药科大学学报000424
摘 要 综述了氨基糖苷类抗生素的体内分析方法.主要有：生物学分析法；薄层色谱法；高效液相色谱法；差示脉冲极谱及各种免疫法，如酶免疫法，荧光偏振免疫法，胶乳凝集抑制速率比浊法等. 其中高效液相色谱法和免疫法应用较多.
分类号 R914.4
Determination of Aminoglycoside Antibiotics in the Biological Fluid
, http://www.100md.com Er Yan，Sun Changshan
(Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract The determination of aminoglycoside antibiotics in the biological fluid has been reviewed.The methods mainly included bioassay,thin-layer chromatography,high-performance liquid chromatography(HPLC) and a variety of immunoassay(IA),for example,enzyme immunoassay,fluorescence polarization immunoassay,quenching fluorescence immunoassay,chemiluminescent immunoassay，etc.,in which HPLC and IA were used more often.
, 百拇医药
Key words aminoglycoside antibioties;determination in the biological fluid;gentamicin
氨基糖苷类抗生素是一类应用广泛，需进行治疗药物监测的广谱抗菌药物，主要包括庆大霉素(GM)、链霉素(SM)、卡那霉素(KM)、巴龙霉素(PM)、新霉素(NM)等.此类抗生素的基本结构都是氨基环醇和氨基糖缩合而成的苷，含氨基或其它碱性基团. 它们是浓度依赖性抗生素，即药物的杀菌速度及程度取决于药物浓度，浓度越高，杀菌作用越强，故建立快速、灵敏、准确的分析方法是非常必要的.其体内分析方法国内外报道都较多，尤其是GM.
1 体内过程
氨基糖苷类抗生素口服难吸收.如GM，口服吸收只有2%左右，对于全身性感染须注射给药，肌注后，30～90 min达血浓峰值.此类药在体内各部位的分布和消除速率不同，且受年龄和肾功能的影响.GM在血清中结合较少，而与肝、肾、肺等部位结合较多.一般肾功能正常者清除半衰期约2～4 h，而慢性肾障碍者增至40～120 h.它们在体内破坏少，大部分以原形从尿中排出.治疗浓度范围较窄，个体差异大，一般为6～20 μmol/L，超过20～30 μmol/L血清浓度时可引起耳中毒及肾损伤，所以此类药物需进行临床监测，确保用药安全有效.
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2 分析方法
氨基糖苷类抗生素的临床监测常采用血样，检查肾毒性时常采用尿样. 采用胸膜渗出液和脑脊液测定结果虽比血清灵敏度高，但显然取样不便. 对于新生儿和在需放置时间较长方能测定的情况下则采用滤纸干血斑点，方法简述如下〔1〕.50 μL 全血或血清滴于定量滤纸,干燥后在含Na2HPO4的超滤试管中保温洗脱1 h，洗脱物离心后即得检测样品.国内采用5%三氯醋酸除蛋白也能达到同样效果.纸上干血可室温保存7～8 d，纸上的血清回收率达90%以上.滤纸干血斑点中血红蛋白含量每24 g/L会对所测药物浓度产生2 mg/L的误差，所以除蛋白很重要.
此类抗生素的体内分析方法主要有生物学测定法，薄层色谱法，高效液相色谱法，免疫法和差示脉冲极谱法，下面对此5种方法逐一介绍.
2.1 生物学测定法
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过去国内临床测定氨基糖苷类药物血浓多用微生物法(MA).
2.1.1 单剂量法
又称标准曲线法. 此法应用含菌琼脂培养基辅平皿，在平皿上放若干不锈钢管，钢管中加一定浓度的抗生素，37℃培育14～16 h后，钢管周围产生抑菌圈，其直径与抗生素浓度成正比，所以抗生素标准浓度的对数与其相应抑菌圈直径作图，可得标准曲线.应用此标准曲线，可算出血清中待测抗生素浓度〔2〕.此方法简单，但费时.
2.1.2 比色微生物分析法
应用枯草芽苞杆菌的培养基，百里酚酞为比色显示剂.含抗生素的血样在培养基上培养后，观察其颜色. 若为海军蓝，则表示血药浓度超过了治疗范围，淡蓝色表示在治疗范围内，白色说明浓度很低〔3〕.此法方便易行，用肉眼即可估计出血药浓度.
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2.1.3 生物发光系统
从一种真核或原核生物中引出能促进生物发光的外源性基因，将其注入本身不发光或很难发光的宿主微生物体内，通过检测宿主基因表现出的发光度来分析抗生素的生物样品〔4〕.
微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响因素复杂，需考虑操作环境是否适宜，且较耗时，不能满足临床上急危重病人需快速检测血药浓度的要求，所以已逐渐被淘汰.
2.2 高效液相色谱法(HPLC)
各种测定此类药物浓度的HPLC的主要区别是所用衍生化试剂不同以及是柱前还是柱后衍生.常用衍生试剂有邻苯二醛(OPA)、茚三酮等.由于氨基糖苷类药物在水中易溶，在非极性有机溶剂中不溶或微溶，因此色谱分离前不能用有机溶剂提取药物.通常是用蛋白质沉淀剂除去蛋白，或将体液通过CM-Sephadex柱或硅胶柱.
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2.2.1 柱前衍生
李好枝等〔5〕用柱前衍生HPLC法检测了尿液中GM含量.二氯甲烷除尿中干扰物，用OPA衍生水相中GM，醋酸乙酯提取.提取物经色谱柱分离，荧光检测.回收率96.2%，检测限10 μmol/L，日内变异系数小于5%；张强等〔6〕在前人基础上用乙腈沉淀血清中干扰物，以茴香胺为内标物，OPA衍生，紫外检测，硫酸庆大霉素出现C1、C1a、C23个峰；国外有用托普霉素作测定血浆和尿液中GM的内标物，荧光检测，检测限可达0.6 μmol/L〔7〕.
以上各HPLC均以OPA柱前衍生，衍生物再进入反相色谱柱.各法的样品预处理和检测方法有异.紫外衍生重现性不如荧光衍生，测紫外吸收时，要尽量使衍生物浓度高，如采取改善流动相、pH值及加内标物等手段提高灵敏度.紫外和荧光检测中样品预处理都很重要.
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2.2.2 柱后衍生
此法将样品在色谱柱上分离后再加衍生试剂，因而对柱的损害比柱前衍生小.柱后衍生的装置比柱前衍生稍复杂，多一个泵以及T形管和反应管，流动相中常加入己烷二磺酸钠、庚烷、辛烷磺酸钠等反离子.
Hiroaki Kubo等〔8〕用3.5%高氯酸除血清中蛋白质后检测SM含量，流动相中含茚三酮作荧光衍生试剂，碱性条件下柱后衍生化，从样品处理到检测完毕不足15 min，检测限1.7 μmol/L血清，回收率(100.0±0.3)%.类似的，可先将稀释后的生物样品在磁性合金C18柱上分离，采用合适内标物，OPA柱后衍生化.
HPLC由于测定迅速准确,流动相选择范围广,灵敏度高(10-12 g/mL以上)，所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法，在国内外都很受重视.
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2.3 薄层色谱法(TLC)
TLC虽然操作简便，分析结果直观，但应用范围不广，报道很少.
先将血样酸化，以潮霉素B作强化剂，结合于共聚物键合硅胶柱上，用二乙胺-甲醇洗脱，洗脱液用TLC分析，展开液为丙酮-乙醇-氨水.潮霉素B带于酸性下荧光衍生化，紫外灯下可见.根据Rf值不同可分离各种氨基糖苷类抗生素，新霉素(NM)与GM的检测限为50 ng，这是一种半微量分析法，已应用于分离分析动物体液中抗生素〔9〕.
2.4 免疫分析法(IA)
IA是近年来发展很快的一种体内分析方法.它将分析方法与免疫反应原理结合,进行超微量分析,具有灵敏度高(10-9～10-12 g)、特异性强、用样少、适用范围广、操作简便等优点，已有试剂盒广泛应用于临床.反应原理如下：
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标记抗原抗体复合物.
药物作为半抗原进行竞争结合.根据对抗原标记方法不同，IA可分为放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)、荧光偏振免疫法(FPIA)等.RIA有放射性污染，后处理困难，需同位素示踪室和计数仪器，费用较高，所以目前已很少应用.
2.4.1 酶免疫法(EIA)
均相酶免疫法是EIA的一种.SyVa公司的酶放大免疫测定技术(EMIF)可用于测氨基糖苷类的体内浓度，其测定值非常接近靶位浓度，适于临床应用，但重现性不如FPIA.
2.4.2 荧光偏振免疫法(FPIA)
抗原用荧光标记，激发光经偏振板后产生的偏振激发光照射到免疫反应装置上可产生偏振荧光. 标记抗原运动散乱，而形成的标记抗原抗体复合物运动有序. 所以偏振荧光的强度与未标记抗原量成比例.应用此原理，美国Abbot公司生产了TDx试剂盒，测试计算全自动化，灵敏度高.
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Pyder.D〔10〕等将血样稀释5倍后用TDx测SM含量，检测限8.6 μmol/L，结果准确.TDx系统重现性很好，连续测定GM，托普霉素等药物含量6年，每月测一次，线性无偏差，且同一标准曲线可连续使用19周.FPIA与MA、EMIT比较，三者相关性强，FPIA的测定结果在临床浓度范围内偏高5%～10%，高浓度时结果较好.一般有新分析方法出现时常与FPIA先作一比较，这方面的文献很多.
对FPIA的研究不仅在提高灵敏度上，还在影响因素、血样要求等方面.因为血清中荧光物大于8.0 μg/mL即可产生足够荧光背景干扰TDx对GM的测定，所以荧光物浓度高时应稀释.滤纸干血斑点也可作检测样品应用于TDx.
总之，FPIA兼具荧光分析的灵敏度和均相免疫法专一快速的特点，测定结果重现性好，试剂稳定，操作方便，所以应用广泛，国外已普及.
2.4.3 胶乳凝集抑制速率比浊法及其它浊度免疫法
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采用胶乳凝集分析技术(LA)的比浊法基本原理是(以GM为例):将GM单价半抗原寄生到蔗糖的聚合物上形成多价半抗原，胶乳颗粒上吸附单克隆抗体作共价偶合，生成均匀混浊液.血清中GM与试剂中多价半抗原竞争单克隆抗体的结合点，破坏交织偶合，溶液变清.GM含量越高，浊度越低，600 nm处用RA-1 000全自动生化分析仪测定，平均回收率97.2%，变异系数小于1.83%.此法只需3 μL血清，且白蛋白、胆红素均不对结果产生干扰〔11〕.此法与EIA和FPIA相关性好，测得的GM药动学参数无显著性差异.
初速光度免疫法是于未稀释的血清中加入过量抗分析物的抗体，产生免疫沉淀反应，在一定时间内测液体浊度增长率，与标准曲线对照，即可得抗生素含量〔12〕.Bron A.M等用浊度法分析了0.3%GM局部用药时人泪液中GM含量〔13〕.
此类方法样品预处理简单，用样量少，精密度高，专属性强，回收率高.
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2.4.4 淬灭荧光免疫法(QFIA)
一定量的荧光素标记药物与其特异性抗体结合后，荧光发生部分淬灭，有待测药物存在时产生竞争结合，标记药物的荧光淬灭程度下降，所以待测药浓正比于荧光强度.此法可测定微量血清中(2 μL)GM浓度，与TDx测定结果的相关系数0.975 5〔14〕.这是国内较好的免疫分析技术，操作简便，取样量少，灵敏度高.但易受荧光污染和溶血影响，操作时应注意控制实验条件.
2.4.5 化学发光免疫法(CLIA)
某些化合物，如鲁米诺及其衍生物、吖啶酯等能吸收化学能而跃迁到不稳定的激发态，它们恢复到基态时，以发光形式释放能量，光强与发光物浓度成正比. 因此可用这类化合物标记抗原和抗体，免疫反应后测形成复合物的化学发光强度，以计算待测药物浓度.
20世纪80年代末国内已有此法报道，90年代CLIA不断改进.刘安平〔15〕等以微晶纤维素─GM偶联物为固相抗原，兔抗庆大霉素为一抗，HRP-驴抗兔为标记二抗，对羟基联苯为发光增强剂.检出限3.3～11.4 ng/tube，回收率(88.2±4.5)%；杨秀岑〔16〕等通过亲和素将固相抗体上的生物素及HRP生物素连结，灵敏度提高，回收率103%；CLIA也可测缀合物.
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CLIA特异性强，灵敏度高达10-15～1018 mol，个别达10-21 mol，但耗时，固相抗原离心或洗涤时可能有损失.
2.4.6 其它免疫法
多层薄层免疫法(opus)曲线稳定性优于LA和EMIT，三者相关性好〔17〕.此法重现性好，可信度高.
结合固相荧光免疫法以聚苯乙烯微球为载体，连结抗体─荧光标记GM配位体，与液体样品混合后不须分离两相即可测定〔18〕.
颗粒浓度荧光免疫法所用固相为0.8 μm聚苯乙烯与GM抗体以非共价键形成的珠状颗粒，以标记荧光的GM为示踪物.此法与TDx检测相关性好〔19〕.还有非荧光标记的类似方法.
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综上所述，所有的免疫法基本原理类似，它的诸多优点使其适于大力推广于临床.
2.5 差示脉冲极谱法(DPP)
此法测体液很困难，即使1%血清或尿液都会影响抗生素产生的信号，因此预处理要求严格.浓度1.0～20 μmol/L的GM在缓冲液中用DPP测，pH5～10时，DPP峰范围0.6～0.1V；pH>11时产生另一峰在-1.5V处.DPP峰高与脉冲程度呈线性关系，并与GM浓度有关〔20〕.
3 前景
以上5种分析方法中HPLC与IA最为常用.国内从20世纪70年代后期开始较多使用HPLC，80年代对衍生技术研究较多并逐渐开始对IA进行深入研究，90年代此类药物的分析发展迅速.解放军南京军区总医院已成功仿制了GM试剂盒，与Abbot公司TDx测定结果无显著性差异，相关性好.由于各种条件限制，国内试剂盒的应用尚未普及，对氨基糖苷类药物体内分析方法的研究仍落后于国外，但我们相信：立足本国实际，改进旧方法和创立新方法都有广阔的前景.
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参考文献
1，Fujimoto Takashi,Yoshiko Tsuda,Ruchi Tawa,et al.FPIA of GM or netilmicin in blood spotted on filter paper.Clin Chem,1989,35(5):867～869
2，王尔健,张婴元,刘裕昆，等.庆大霉素血药浓度监测. 中华内科杂志，1992,31:421～423
3，Wakamatsu-Hattori Hiromi.Colorimetric bioassay for measuring aminoglycoside antibitics in blood spots on filter paper.Nippon Kagaku Ryoho Gakkai Zasshi,1995,43(11):1041～1049
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4，Wolleycher Simon.Detection or identification of microbes by introduction and expression of an exogeuous gene encoding an enzyme for a bioluminescent system.China，Faming Zhuanli Shenqing Cong Kai Shuoming shu CN, 85,109,047
5，李好枝,于治国,陈健，等.HPLC测定尿中庆大霉素含量.沈阳药学院学报,1988,5(4):282～286
6，张强,廖工铁,寿旦，等.用HPLC测定兔血清中硫酸庆大霉素含量.中国医院药学杂志，1995,15(4):147～149
7，Cabanes A, Cajal Y, Haro I，et al.GM determination in biologicol fluids by HPLC,using tobramycin as internal standard.J Liq Chromatogr,1991,14(10):1989～2010
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8，Hiroaki kubo, Haozhi Li, Yoshie Kobayashi,et al.Fluorometric determination of SM in serum by HPLC using the mobile phase containing fluorogenic reagent. Anal Biochem,1987,162:219～223
9，Medina MB,Unruh JJ.Solid-phase clean-up and TLC of veterinary aminoglycosides.J Chromatogr B:Biomed Appl,1995,663(1):127～135
10，Pyder D,Wasin H.Assay of SM trough concentration by FPIA.J Antimicrob Chemother,1994,33(5):1067～1072
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11，张世培,严寿恩,田嵩，等.胶乳凝集抑制速率比浊法测定血清中GM浓度.中国医院药学杂志，1994,14(8):363～364
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13，Bron A,Laker M.GM,norfloxacin and lysozyme in human tears:in vivo and in vitro study.Acta Ophthalmol,1992,70(6):750～758
14，蔡卫民,陈杰,陈刚，等.淬灭荧光免疫法测定微量血清中GM浓度.中国医院药学杂志,1991,11(11):485～486
15，邓安平,杨秀岑,杨永明，等.用增强化学发光免疫分析法测血清中GM含量.华西医大学报，1993,24(1):101～103
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16，杨秀岑,伍莉萍,邓安平，等.生物素标记增强化学发光法测血清中GM含量.华西医大学报，1995,26(2):234～236
17，Holt HA.An evaluation of three new IA for determination of serum GM concentrations.J Antimicrob Chemother,1994,34(5):747～751
18，Ngo N,That T.Integrated solid-phase fluorescence&127;IA.US patent,US4977077,1990-12-11
19，Varma-Nelson Pratibha,John E Nelson,Steven M Belknap.Particle concentration flurescence IA of GM.Ther Drug Uonit,1991,13(3):260～262
20，Flemming J.Determination of GM by differential-pulse polarography.Die Pharmazie,1989,44(4):270～271
收稿日期:1999-11-15
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单位：沈阳药科大学药学系，沈阳 110015
关键词：氨基糖苷类抗生素；体内分析；庆大霉素
沈阳药科大学学报000424
摘 要 综述了氨基糖苷类抗生素的体内分析方法.主要有：生物学分析法；薄层色谱法；高效液相色谱法；差示脉冲极谱及各种免疫法，如酶免疫法，荧光偏振免疫法，胶乳凝集抑制速率比浊法等. 其中高效液相色谱法和免疫法应用较多.
分类号 R914.4
Determination of Aminoglycoside Antibiotics in the Biological Fluid
, http://www.100md.com Er Yan，Sun Changshan
(Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract The determination of aminoglycoside antibiotics in the biological fluid has been reviewed.The methods mainly included bioassay,thin-layer chromatography,high-performance liquid chromatography(HPLC) and a variety of immunoassay(IA),for example,enzyme immunoassay,fluorescence polarization immunoassay,quenching fluorescence immunoassay,chemiluminescent immunoassay，etc.,in which HPLC and IA were used more often.
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Key words aminoglycoside antibioties;determination in the biological fluid;gentamicin
氨基糖苷类抗生素是一类应用广泛，需进行治疗药物监测的广谱抗菌药物，主要包括庆大霉素(GM)、链霉素(SM)、卡那霉素(KM)、巴龙霉素(PM)、新霉素(NM)等.此类抗生素的基本结构都是氨基环醇和氨基糖缩合而成的苷，含氨基或其它碱性基团. 它们是浓度依赖性抗生素，即药物的杀菌速度及程度取决于药物浓度，浓度越高，杀菌作用越强，故建立快速、灵敏、准确的分析方法是非常必要的.其体内分析方法国内外报道都较多，尤其是GM.
1 体内过程
氨基糖苷类抗生素口服难吸收.如GM，口服吸收只有2%左右，对于全身性感染须注射给药，肌注后，30～90 min达血浓峰值.此类药在体内各部位的分布和消除速率不同，且受年龄和肾功能的影响.GM在血清中结合较少，而与肝、肾、肺等部位结合较多.一般肾功能正常者清除半衰期约2～4 h，而慢性肾障碍者增至40～120 h.它们在体内破坏少，大部分以原形从尿中排出.治疗浓度范围较窄，个体差异大，一般为6～20 μmol/L，超过20～30 μmol/L血清浓度时可引起耳中毒及肾损伤，所以此类药物需进行临床监测，确保用药安全有效.
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2 分析方法
氨基糖苷类抗生素的临床监测常采用血样，检查肾毒性时常采用尿样. 采用胸膜渗出液和脑脊液测定结果虽比血清灵敏度高，但显然取样不便. 对于新生儿和在需放置时间较长方能测定的情况下则采用滤纸干血斑点，方法简述如下〔1〕.50 μL 全血或血清滴于定量滤纸,干燥后在含Na2HPO4的超滤试管中保温洗脱1 h，洗脱物离心后即得检测样品.国内采用5%三氯醋酸除蛋白也能达到同样效果.纸上干血可室温保存7～8 d，纸上的血清回收率达90%以上.滤纸干血斑点中血红蛋白含量每24 g/L会对所测药物浓度产生2 mg/L的误差，所以除蛋白很重要.
此类抗生素的体内分析方法主要有生物学测定法，薄层色谱法，高效液相色谱法，免疫法和差示脉冲极谱法，下面对此5种方法逐一介绍.
2.1 生物学测定法
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过去国内临床测定氨基糖苷类药物血浓多用微生物法(MA).
2.1.1 单剂量法
又称标准曲线法. 此法应用含菌琼脂培养基辅平皿，在平皿上放若干不锈钢管，钢管中加一定浓度的抗生素，37℃培育14～16 h后，钢管周围产生抑菌圈，其直径与抗生素浓度成正比，所以抗生素标准浓度的对数与其相应抑菌圈直径作图，可得标准曲线.应用此标准曲线，可算出血清中待测抗生素浓度〔2〕.此方法简单，但费时.
2.1.2 比色微生物分析法
应用枯草芽苞杆菌的培养基，百里酚酞为比色显示剂.含抗生素的血样在培养基上培养后，观察其颜色. 若为海军蓝，则表示血药浓度超过了治疗范围，淡蓝色表示在治疗范围内，白色说明浓度很低〔3〕.此法方便易行，用肉眼即可估计出血药浓度.
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2.1.3 生物发光系统
从一种真核或原核生物中引出能促进生物发光的外源性基因，将其注入本身不发光或很难发光的宿主微生物体内，通过检测宿主基因表现出的发光度来分析抗生素的生物样品〔4〕.
微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响因素复杂，需考虑操作环境是否适宜，且较耗时，不能满足临床上急危重病人需快速检测血药浓度的要求，所以已逐渐被淘汰.
2.2 高效液相色谱法(HPLC)
各种测定此类药物浓度的HPLC的主要区别是所用衍生化试剂不同以及是柱前还是柱后衍生.常用衍生试剂有邻苯二醛(OPA)、茚三酮等.由于氨基糖苷类药物在水中易溶，在非极性有机溶剂中不溶或微溶，因此色谱分离前不能用有机溶剂提取药物.通常是用蛋白质沉淀剂除去蛋白，或将体液通过CM-Sephadex柱或硅胶柱.
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2.2.1 柱前衍生
李好枝等〔5〕用柱前衍生HPLC法检测了尿液中GM含量.二氯甲烷除尿中干扰物，用OPA衍生水相中GM，醋酸乙酯提取.提取物经色谱柱分离，荧光检测.回收率96.2%，检测限10 μmol/L，日内变异系数小于5%；张强等〔6〕在前人基础上用乙腈沉淀血清中干扰物，以茴香胺为内标物，OPA衍生，紫外检测，硫酸庆大霉素出现C1、C1a、C23个峰；国外有用托普霉素作测定血浆和尿液中GM的内标物，荧光检测，检测限可达0.6 μmol/L〔7〕.
以上各HPLC均以OPA柱前衍生，衍生物再进入反相色谱柱.各法的样品预处理和检测方法有异.紫外衍生重现性不如荧光衍生，测紫外吸收时，要尽量使衍生物浓度高，如采取改善流动相、pH值及加内标物等手段提高灵敏度.紫外和荧光检测中样品预处理都很重要.
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2.2.2 柱后衍生
此法将样品在色谱柱上分离后再加衍生试剂，因而对柱的损害比柱前衍生小.柱后衍生的装置比柱前衍生稍复杂，多一个泵以及T形管和反应管，流动相中常加入己烷二磺酸钠、庚烷、辛烷磺酸钠等反离子.
Hiroaki Kubo等〔8〕用3.5%高氯酸除血清中蛋白质后检测SM含量，流动相中含茚三酮作荧光衍生试剂，碱性条件下柱后衍生化，从样品处理到检测完毕不足15 min，检测限1.7 μmol/L血清，回收率(100.0±0.3)%.类似的，可先将稀释后的生物样品在磁性合金C18柱上分离，采用合适内标物，OPA柱后衍生化.
HPLC由于测定迅速准确,流动相选择范围广,灵敏度高(10-12 g/mL以上)，所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法，在国内外都很受重视.
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2.3 薄层色谱法(TLC)
TLC虽然操作简便，分析结果直观，但应用范围不广，报道很少.
先将血样酸化，以潮霉素B作强化剂，结合于共聚物键合硅胶柱上，用二乙胺-甲醇洗脱，洗脱液用TLC分析，展开液为丙酮-乙醇-氨水.潮霉素B带于酸性下荧光衍生化，紫外灯下可见.根据Rf值不同可分离各种氨基糖苷类抗生素，新霉素(NM)与GM的检测限为50 ng，这是一种半微量分析法，已应用于分离分析动物体液中抗生素〔9〕.
2.4 免疫分析法(IA)
IA是近年来发展很快的一种体内分析方法.它将分析方法与免疫反应原理结合,进行超微量分析,具有灵敏度高(10-9～10-12 g)、特异性强、用样少、适用范围广、操作简便等优点，已有试剂盒广泛应用于临床.反应原理如下：
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标记抗原抗体复合物.
药物作为半抗原进行竞争结合.根据对抗原标记方法不同，IA可分为放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)、荧光偏振免疫法(FPIA)等.RIA有放射性污染，后处理困难，需同位素示踪室和计数仪器，费用较高，所以目前已很少应用.
2.4.1 酶免疫法(EIA)
均相酶免疫法是EIA的一种.SyVa公司的酶放大免疫测定技术(EMIF)可用于测氨基糖苷类的体内浓度，其测定值非常接近靶位浓度，适于临床应用，但重现性不如FPIA.
2.4.2 荧光偏振免疫法(FPIA)
抗原用荧光标记，激发光经偏振板后产生的偏振激发光照射到免疫反应装置上可产生偏振荧光. 标记抗原运动散乱，而形成的标记抗原抗体复合物运动有序. 所以偏振荧光的强度与未标记抗原量成比例.应用此原理，美国Abbot公司生产了TDx试剂盒，测试计算全自动化，灵敏度高.
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Pyder.D〔10〕等将血样稀释5倍后用TDx测SM含量，检测限8.6 μmol/L，结果准确.TDx系统重现性很好，连续测定GM，托普霉素等药物含量6年，每月测一次，线性无偏差，且同一标准曲线可连续使用19周.FPIA与MA、EMIT比较，三者相关性强，FPIA的测定结果在临床浓度范围内偏高5%～10%，高浓度时结果较好.一般有新分析方法出现时常与FPIA先作一比较，这方面的文献很多.
对FPIA的研究不仅在提高灵敏度上，还在影响因素、血样要求等方面.因为血清中荧光物大于8.0 μg/mL即可产生足够荧光背景干扰TDx对GM的测定，所以荧光物浓度高时应稀释.滤纸干血斑点也可作检测样品应用于TDx.
总之，FPIA兼具荧光分析的灵敏度和均相免疫法专一快速的特点，测定结果重现性好，试剂稳定，操作方便，所以应用广泛，国外已普及.
2.4.3 胶乳凝集抑制速率比浊法及其它浊度免疫法
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采用胶乳凝集分析技术(LA)的比浊法基本原理是(以GM为例):将GM单价半抗原寄生到蔗糖的聚合物上形成多价半抗原，胶乳颗粒上吸附单克隆抗体作共价偶合，生成均匀混浊液.血清中GM与试剂中多价半抗原竞争单克隆抗体的结合点，破坏交织偶合，溶液变清.GM含量越高，浊度越低，600 nm处用RA-1 000全自动生化分析仪测定，平均回收率97.2%，变异系数小于1.83%.此法只需3 μL血清，且白蛋白、胆红素均不对结果产生干扰〔11〕.此法与EIA和FPIA相关性好，测得的GM药动学参数无显著性差异.
初速光度免疫法是于未稀释的血清中加入过量抗分析物的抗体，产生免疫沉淀反应，在一定时间内测液体浊度增长率，与标准曲线对照，即可得抗生素含量〔12〕.Bron A.M等用浊度法分析了0.3%GM局部用药时人泪液中GM含量〔13〕.
此类方法样品预处理简单，用样量少，精密度高，专属性强，回收率高.
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2.4.4 淬灭荧光免疫法(QFIA)
一定量的荧光素标记药物与其特异性抗体结合后，荧光发生部分淬灭，有待测药物存在时产生竞争结合，标记药物的荧光淬灭程度下降，所以待测药浓正比于荧光强度.此法可测定微量血清中(2 μL)GM浓度，与TDx测定结果的相关系数0.975 5〔14〕.这是国内较好的免疫分析技术，操作简便，取样量少，灵敏度高.但易受荧光污染和溶血影响，操作时应注意控制实验条件.
2.4.5 化学发光免疫法(CLIA)
某些化合物，如鲁米诺及其衍生物、吖啶酯等能吸收化学能而跃迁到不稳定的激发态，它们恢复到基态时，以发光形式释放能量，光强与发光物浓度成正比. 因此可用这类化合物标记抗原和抗体，免疫反应后测形成复合物的化学发光强度，以计算待测药物浓度.
20世纪80年代末国内已有此法报道，90年代CLIA不断改进.刘安平〔15〕等以微晶纤维素─GM偶联物为固相抗原，兔抗庆大霉素为一抗，HRP-驴抗兔为标记二抗，对羟基联苯为发光增强剂.检出限3.3～11.4 ng/tube，回收率(88.2±4.5)%；杨秀岑〔16〕等通过亲和素将固相抗体上的生物素及HRP生物素连结，灵敏度提高，回收率103%；CLIA也可测缀合物.
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CLIA特异性强，灵敏度高达10-15～1018 mol，个别达10-21 mol，但耗时，固相抗原离心或洗涤时可能有损失.
2.4.6 其它免疫法
多层薄层免疫法(opus)曲线稳定性优于LA和EMIT，三者相关性好〔17〕.此法重现性好，可信度高.
结合固相荧光免疫法以聚苯乙烯微球为载体，连结抗体─荧光标记GM配位体，与液体样品混合后不须分离两相即可测定〔18〕.
颗粒浓度荧光免疫法所用固相为0.8 μm聚苯乙烯与GM抗体以非共价键形成的珠状颗粒，以标记荧光的GM为示踪物.此法与TDx检测相关性好〔19〕.还有非荧光标记的类似方法.
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综上所述，所有的免疫法基本原理类似，它的诸多优点使其适于大力推广于临床.
2.5 差示脉冲极谱法(DPP)
此法测体液很困难，即使1%血清或尿液都会影响抗生素产生的信号，因此预处理要求严格.浓度1.0～20 μmol/L的GM在缓冲液中用DPP测，pH5～10时，DPP峰范围0.6～0.1V；pH>11时产生另一峰在-1.5V处.DPP峰高与脉冲程度呈线性关系，并与GM浓度有关〔20〕.
3 前景
以上5种分析方法中HPLC与IA最为常用.国内从20世纪70年代后期开始较多使用HPLC，80年代对衍生技术研究较多并逐渐开始对IA进行深入研究，90年代此类药物的分析发展迅速.解放军南京军区总医院已成功仿制了GM试剂盒，与Abbot公司TDx测定结果无显著性差异，相关性好.由于各种条件限制，国内试剂盒的应用尚未普及，对氨基糖苷类药物体内分析方法的研究仍落后于国外，但我们相信：立足本国实际，改进旧方法和创立新方法都有广阔的前景.
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收稿日期:1999-11-15
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