豚鼠和大鼠小肠内AChE和VIP阳性神经的分布关系研究——酶组织化学与免疫组织化学结合法观察*
作者：李林 胡道松 王红兵 茹立强
单位：李林、胡道松、茹立强：同济医科大学基础医学院神经生物学教研室，武汉 430030；王红兵：同济医科大学附属协和医院麻醉科，武汉 430022
关键词：乙酰胆碱酯酶；血管活性肠肽；肠神经系统；小肠
同济医科大学学报990507 摘要 采用免疫组织化学和酶组织化学方法研究发现：①豚鼠和大鼠小肠壁各层，粘膜下神经丛和肠肌丛内乙酰胆碱酯酶(AChE)阳性神经和血管活性肠肽免疫反应性(VIP-ir)神经都很丰富，后者在固有膜和粘膜下层的分布特别浓密。②AChE阳性神经以粗大纤维居多，VIP-ir神经多为膨体样神经末梢。③两种神经丛及节间束中富含AChE阳性神经元胞体；VIP-ir神经元胞体相对较少，但其胞体近端突起明显。④豚鼠小肠二种神经元成分均较大鼠者明显丰富，但它们均有相似梯度差别：回肠>空肠>十二指肠。⑤肠肌丛中同一神经元胞体偶见VIP-ir与AChE阳性反应。结果提示：胆碱能神经及VIP能神经及其递质可能分别或以共存形式相互调控肠道的功能活动，特别是肠动力。
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中图法分类号 Q556.1, R977.1, R322.85
A Comparitive Study on the Distribution of AChE-positive and
VIP-immunoreactive Nerves in Small Intestine of Guinea Pig and Rat:
A Combined Histochemical and Immunohistochemical Observation
Li Lin1, Hu Daosong1, Wang Hongbing2et al
1 Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
2 Department of Anaesthesiology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract A comparative study was performed on the distribution of AChE-positive and VIP-immunoreactive nerves in small intestine of guinea pig and rat by using combined histochemical and immunohistochemical methods. It was found that: ①Dense acetylcholinesterase (AChE)-positive and vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-immunoreactive (ir) nerves were located in each laminae, Meissner's submucosal plexus (MSP) and Auerbach's myenteric plexus (AMP) in small intestine of both guinea pig and rat, while in laminae propria and submucosa, the distribution of VIP-ir terminals were the most dense. ②AChE-positive nerves were mainly coarse fiber, while most of VIP-ir terminals showed predominantely with varicose. ③AChE-positive perikarya were rich in MSP, AMP and interganglionic bundles. In MSP and AMP, only a few of VIP-ir perikarya were found.VIP-ir neuron showed obvious processes. ④AChE-positive and VIP-ir perikarya and fibers in small intestine of guinea pig were more dense than those in rat,but there was a significant difference in the densities of their distribution in the three segments:ileum>jejunum>duodenum. ⑤The colocalization of AChE and VIP-ir was occasionally found in a perikaryon of AMP. The results suggested that the acetylcholinergic- and VIP-ergic nerves may regulate the function of intestine alone or cooperatively, especially in the motility of intestine.
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Key words acetylcholinesterase; vasoactive intestinal polypeptide; enteric nervous system
自70年代以来，人们用免疫组织化学等方法，发现人和动物肠神经系统(enteric nervous system，ENS)中存在众多的各种类型的非肾上腺素能非胆碱能(non-adrenergic，non-cholinergic，NANC)神经元[1]。因此，本实验在豚鼠和大鼠二种动物小肠中用免疫组织化学和酶组织化学法分别或用双染法，对胆碱能和血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)能神经在肠道中的分布进行比较神经解剖学研究。
1 材料和方法
1.1 实验动物与取材
, 百拇医药 采用同济医科大学实验动物学部提供的健康成年SD纯种大鼠180 g左右，豚鼠250 g左右，各6只，雌雄不限。动物以100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌注固定，先以温的生理盐水200 ml快速冲洗血液，随即以冷的含40 g/L多聚甲醛Millongs固定液(pH7.2～7.4)400 ml灌流，取十二指肠、空肠、回肠(定位，各1 cm长肠管)，后固定于同一固定液中约12 h，制作恒冷箱冰冻连续切片(片厚20μm)。大鼠小肠还制作粘膜下层和外纵肌全层撕片。应用酶组织化学及免疫组织化学法分别显示acetylcholinesterase(AChE)、VIP和AChE-VIP联合染色。
1.2 AChE组织化学染色
按改良的Karnovsky-Roots(1964)亚铁氰化铜直接显示法[2]，以碘化乙酰硫胆碱(Switzerland产品)为底物，四异丙基焦磷酰胺(iso-OMPA，England产品)作假性胆碱酯酶的抑制剂。肠切片或撕片标本在37 ℃下分别孵育2.5或3.0 h，最后常规脱水，透明，封片。
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1.3 免疫组织化学染色
按Sternberger(1970)非标记抗体过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP法)[3]，稍加改动，标本先后经甲醇-过氧化氢(37℃ 40 min)和2.5 g/L TritonX-100(37℃ 1 h)和30 g/L牛血清蛋白(37℃ 1 h)预处理，随后转入兔抗VIP抗体(Peninsula Lab Inc产品)(1∶7000)孵育(37℃ 70 h左右)，入羊抗兔IgG(1∶200)和PAP复合物(1∶400)(均由上海医科大学病理室提供)，各于37℃孵育1 h，然后标本在0.5 g/L 3-3'-二氨基联苯胺(DAB)-0.1 g/L H2O2-Tris HCl缓冲液(pH7.6)中显色(呈棕色产物)和常规脱水、透明、封片。
1.4 AChE-VIP联合染色
先做AChE显色(呈棕色产物)，后做PAP法显示VIP和用二盐酸联苯胺(呈蓝色产物)作显色剂。全部肠染色标本，在配有测微器的光镜下做比较观察，并做阳性神经元胞体和神经纤维密度计数(半定量)。
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2 结果
2.1 大鼠小肠
切片中小肠壁的四层基本组织结构清楚，其中以粘膜层和环肌层较醒目。外纵肌层或粘膜下层撕片标本中神经节(肠肌丛或粘膜下丛)及节间束的神经纤维网络结构清楚(图1)。 AChE阳性神经纤维和末梢(简称酶阳性神经)广泛分布于肠壁各层和肠肌丛内，肌层及节间束可见众多的酶活性强的粗大神经(干或束)，环肌层酶阳性神经最丰富，固有膜内酶阳性神经稍细小。肠肌丛中主要为带膨体的神经末梢。酶阳性神经的分布密度从十二指肠到回肠逐渐增高。撕片标本，粘膜下神经丛和肠肌丛(图2)酶活性甚强，结构醒目。粘膜下神经丛神经元胞体分布较少，而肠肌丛中有大量密集的酶阳性神经元胞体，有的丛多至几十个酶阳性神经元胞体(表1)。节间束中也有散在分布的酶阳性神经元胞体。细胞圆形或卵圆形，胞体(核周质)均质状着棕黄色或棕褐色，核不着色。酶阳性神经和这些神经元胞体突起在丛内和节(丛)间交织成网，有的胞突末端膨大与邻近的酶阴性或弱阳性细胞体呈终扣样接触(图3)。小肠各段肠肌丛神经元胞体的酶活性和分布密度(梯度)有明显差别，酶中-强度阳性神经元胞体占肠肌丛中神经元胞体总数的平均百分率分别为：回肠37.1%、空肠33.5%、十二指肠28.7%(P<0.05)。
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表1 大鼠和豚鼠小肠壁内神经丛AChE及VIP阳性神经元胞体的半定量比较
胞体数
十二指肠
空 肠
回 肠
粘膜下丛
肠肌丛
粘膜下丛
肠肌丛
粘膜下丛
肠肌丛
AChE
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大鼠
+
+
+
++
++
++++
豚鼠
+
++
++
++
++
+++
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VIP
大鼠
+
±
(++)
+
++
++
豚鼠
+
±
++
(++)
+++
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(+++)
++++，众多(15个以上/丛)；+++，较多(10～15个)/丛；++，中等量(6～10个/丛)；±(1～2个/丛)或偶见
图1 大鼠小肠肠肌丛(AMP)及节间束(↑)中VIP-ir神经纤维网络结构 ×200
图2 大鼠回肠肠肌丛AChE阳性神经元.×200
图3 大鼠回肠肠肌丛AChE强阳性神经元，其胞突与胸体呈终扣样接触(↑) ×400
VIP免疫反应(ir)神经在粘膜层(以固有膜为主)和环肌层和肠肌丛中分布较密集，纵肌层有中等量分布。粘膜下层血管旁也有VIP-ir神经。VIP-ir神经大多数为膨体样神经末梢，偶见细小神经干。VIP-ir神经的分布密度与酶阳性神经相比明显低，但在小肠各段中也有相似的梯度分布。撕片标本小肠粘膜下神经丛和肠肌丛内VIP-ir神经元胞体少，一个肠肌丛中最多可见6个VIP-ir细胞，一般为2～3个；粘膜下丛VIP-ir神经元胞体相对较多(图4)，神经元胞体(核周质)的免疫反应性较强。胞体多为圆形，其胞体突起多，也有的胞体由二端发出突起，有的可见长轴突行走于数个节(丛)之间，与邻近(阴性或阳性)的胞体呈终扣样联系(图5)。VIP-ir胞体在小肠各段肠肌丛中的分布密度及梯度也与AChE阳性神经相似。
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图4 大鼠回肠粘膜下神经丛VIP-ir神经元及其网络联系结构 ×200
图5 大鼠腔肠肠肌丛VIP-ir神经元，其胞突与胞体呈终扣样接触(↑) ×400
2.2 豚鼠小肠
与大鼠相比较，切片标本小肠壁的4层结构较醒目，粘膜下层结构也明显。豚鼠小肠内AChE阳性和VIP-ir二种神经元胞体和神经纤维的分布密度及着色强度(酶活性或免疫反应性)均明显高于大鼠小肠内者，但其形态学和在小肠各段中的分布梯度与大鼠者是相似的。在小肠壁内各层和肠肌丛中酶阳性神经和VIP-ir神经都很丰富，特别是VIP-ir神经在粘膜层(以固有膜为主)、粘膜下层和环肌层均有浓密分布(表2)。粘膜下神经丛、肠肌丛和节间束中存在大量AChE阳性神经元胞体及少量VIP-ir神经元胞体(表1)。
表2 豚鼠小肠壁内AChE和VIP阳性神经的分布
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阳性神经数(均值)/
25μm×25μm
十二指肠
空肠
回肠
粘膜层
环肌层
粘膜层
环肌层
粘膜层
环肌层
AChE
1.390
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1.560
1.450
1.650
1.560
1.740
VIP
0.670
0.370
0.780
0.450
0.850
0.540
2.3 肠肌丛中AChE与VIP共染神经元
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双染相邻切片显示豚鼠和大鼠的肠肌丛中均可见到个别的VIP-ir(蓝色)与AChE阳性反应(棕色)重叠分布于同一神经元胞体(图6)。有些神经纤维也出现2种阳性反应产物的重叠分布。表明在ENS神经元中存在AChE与VIP共存的可能性。
图6 豚鼠回肠肠肌丛(↑)AChE和VIP阳性神经元。
A：肠肌AChE阳性神经元.B：肠肌丛神经元内AChE与VIP共染 ×200
3 讨论
胃肠道已被公认具有外源性的和内在固有的外周自主神经的双重支配。本实验结果表明，AChE阳性神经和VIP能神经在豚鼠和大鼠小肠壁内具有外来的和内在的双重支配。后者为肠壁内小神经节和节内含有各种性质的神经元(包括感觉、运动和中间神经元)，被统称为肠神经系统(enteric nervous system，ENS)[4]，属于外周自主神经的一部分。肠肌丛是ENS最具形态特征的结构，丛内酶中-强度阳性神经节细胞大部分可能是胆碱能神经元。酶阳性和VIP-ir 2类神经元在二种动物小肠壁层内有密度和节段性梯度分布的差异，ENS不同类型神经元的这种分布特点，提示可能与各自的不同生理功能作用有关。
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3.1 胆碱能神经
肠壁内酶阳性神经分布十分广泛。传统认为，外来源于延髓迷走神经运动背核进入肠壁各层的神经纤维被称为副交感胆碱能节前纤维，这些纤维与肠壁内神经节细胞建立突触形态联系；肠壁内胆碱能神经元被称为副交感节后运动神经元，由其发出纤维(节后纤维)分布于肠壁内各层。现在认为，此种壁内神经节(丛)及其神经元为ENS的基本结构。ENS神经元的种类众多，在肠肌丛中有丰富的胆碱能神经元，还有肽能神经元，如：VIP能神经元等。其中胆碱能神经元在种族和个体发生过程中是最早出现的神经元，也是ENS内数目最多、类型最复杂的一种神经元(也有感觉、运动和中间神经元性质)[5,6]。ENS中胆碱能神经成分与肠腺分泌及肠管运动可能都有关。胆碱能神经元释放经典递质乙酰胆碱(ACh)，为胃肠动力兴奋性递质，具有刺激肠肌收缩和促进肠蠕动的作用。
3.2 VIP能神经
在胃肠道，VIP是一种胃肠激素，但主要是一种神经肽，存在于神经结构内。VIP被认为属于NANC抑制系统的一种神经递质，为肠道下行抑制性神经元的递质，具有强的扩血管、舒张平滑肌的作用和加强小肠的分泌活动，参加吸收过程，特别是抑制肠的紧张性，参与肠蠕动调制的重要成分之一〔另一种主要的NANC递质为一氧化氮(nitric oxide，NO)〕[7,8]。
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3.3 ACh能神经与VIP能神经的关系
肠壁内神经丛中VIP-ir神经元胞体数量明显少于酶阳性细胞，但二者神经纤维肠壁内的分布模式是相似的，仅有密度的差别，但都十分丰富，又都有内源性和外源性的双重支配。 酶阳性和VIP-ir二种神经的重叠分布在同一神经元中的共染，表明ACh与VIP有可能共存。唾液腺内已被公认有ACh与VIP这二种递质共存，协同促进腺体分泌[9]。但在胃酸分泌的调节中，VIP抑制壁细胞分泌胃酸，而ACh促胃酸分泌。此外，VIP-ir神经元在肠肌丛内与其他神经元之间均有“突触”样联系[10]，但二种神经元之间的形态联系及其功能尚需进一步探讨。
综上所述，酶阳性和VIP-ir二种肠神经是调整胃肠运动生理功能的重要神经成分，在扩张肠管所引起的蠕动波中，兴奋肠肌收缩的递质为ACh，抑制肠肌(舒张)的递质为VIP。二者可能还涉及肠动力异常的病理生理的肠神经机制[8,11]。
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*卫生部科学基金资助项目(No.96-1-139)
作者简介：李林，女，1957年生，讲师。现址：武汉市职工医学院组织学与胚胎学教研室，武汉 430016
参考文献
1 H
kfelt T，Schultzberg M，Lundberg J M et al. In：Said S M Eds. Vasoactive intestinal peptide. New York：Raven Press, 1982.65～90
2 茹立强. 胆碱酯酶的组织化学及超微定位. 见艾民康主编. 神经介质及有关酶类的组织化学. 北京：人民卫生出版社，1987.110～113
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3 Sternberger L A，Hardy P H Jr，Cuculis J J et al. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry.J Histochem Cytochem， 1970,18:315
4 Christensen J. The enteric nervous system.In：Kumar D, Wingate D Eds. Gastrointestinal Motility. 2nd ed. London： Churchili Livingstone， 1993.10～31
5 雷亚宁，胡道松，茹立强.大鼠肠神经系统乙酰胆碱酯酶和抗氟化物酸性磷酸酶双染法研究.解剖学杂志，1995,18(3):244
6 关新民，王才源，余 福等. 中枢ACh与针刺镇痛关系的研究.针刺研究，1991.16(2):129
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7 周吕主编. 胃肠生理学-基础与临床. 北京：科学出版社，1991.147～148
8 曹福元，胡道松，翁一珍等. 先天性巨结肠病结肠壁内NOS阳性神经和VIP能神经的异常改变. 中国组织化学与细胞化学杂志，1995,5(4):450
9 韩济生，关新民主编. 医用神经生物学. 武汉：武汉出版社，1996.158～161
10 Tsuto T，Obata-Tsuto H L, Iwai N et al. Fine Structure of neurons synthesizing vasoactive intestinal peptide in the human colon from patients with Hirschsprung's disease. Histochemistry，1989,93:1
11 林传友，杨晓进，茹立强等. 先天性巨结肠症结肠内肽能神经支配的紊乱. 中华小儿外科杂志，1991,12(6):341
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药
单位：李林、胡道松、茹立强：同济医科大学基础医学院神经生物学教研室，武汉 430030；王红兵：同济医科大学附属协和医院麻醉科，武汉 430022
关键词：乙酰胆碱酯酶；血管活性肠肽；肠神经系统；小肠
同济医科大学学报990507 摘要 采用免疫组织化学和酶组织化学方法研究发现：①豚鼠和大鼠小肠壁各层，粘膜下神经丛和肠肌丛内乙酰胆碱酯酶(AChE)阳性神经和血管活性肠肽免疫反应性(VIP-ir)神经都很丰富，后者在固有膜和粘膜下层的分布特别浓密。②AChE阳性神经以粗大纤维居多，VIP-ir神经多为膨体样神经末梢。③两种神经丛及节间束中富含AChE阳性神经元胞体；VIP-ir神经元胞体相对较少，但其胞体近端突起明显。④豚鼠小肠二种神经元成分均较大鼠者明显丰富，但它们均有相似梯度差别：回肠>空肠>十二指肠。⑤肠肌丛中同一神经元胞体偶见VIP-ir与AChE阳性反应。结果提示：胆碱能神经及VIP能神经及其递质可能分别或以共存形式相互调控肠道的功能活动，特别是肠动力。
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中图法分类号 Q556.1, R977.1, R322.85
A Comparitive Study on the Distribution of AChE-positive and
VIP-immunoreactive Nerves in Small Intestine of Guinea Pig and Rat:
A Combined Histochemical and Immunohistochemical Observation
Li Lin1, Hu Daosong1, Wang Hongbing2et al
1 Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
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2 Department of Anaesthesiology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract A comparative study was performed on the distribution of AChE-positive and VIP-immunoreactive nerves in small intestine of guinea pig and rat by using combined histochemical and immunohistochemical methods. It was found that: ①Dense acetylcholinesterase (AChE)-positive and vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-immunoreactive (ir) nerves were located in each laminae, Meissner's submucosal plexus (MSP) and Auerbach's myenteric plexus (AMP) in small intestine of both guinea pig and rat, while in laminae propria and submucosa, the distribution of VIP-ir terminals were the most dense. ②AChE-positive nerves were mainly coarse fiber, while most of VIP-ir terminals showed predominantely with varicose. ③AChE-positive perikarya were rich in MSP, AMP and interganglionic bundles. In MSP and AMP, only a few of VIP-ir perikarya were found.VIP-ir neuron showed obvious processes. ④AChE-positive and VIP-ir perikarya and fibers in small intestine of guinea pig were more dense than those in rat,but there was a significant difference in the densities of their distribution in the three segments:ileum>jejunum>duodenum. ⑤The colocalization of AChE and VIP-ir was occasionally found in a perikaryon of AMP. The results suggested that the acetylcholinergic- and VIP-ergic nerves may regulate the function of intestine alone or cooperatively, especially in the motility of intestine.
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Key words acetylcholinesterase; vasoactive intestinal polypeptide; enteric nervous system
自70年代以来，人们用免疫组织化学等方法，发现人和动物肠神经系统(enteric nervous system，ENS)中存在众多的各种类型的非肾上腺素能非胆碱能(non-adrenergic，non-cholinergic，NANC)神经元[1]。因此，本实验在豚鼠和大鼠二种动物小肠中用免疫组织化学和酶组织化学法分别或用双染法，对胆碱能和血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)能神经在肠道中的分布进行比较神经解剖学研究。
1 材料和方法
1.1 实验动物与取材
, 百拇医药 采用同济医科大学实验动物学部提供的健康成年SD纯种大鼠180 g左右，豚鼠250 g左右，各6只，雌雄不限。动物以100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌注固定，先以温的生理盐水200 ml快速冲洗血液，随即以冷的含40 g/L多聚甲醛Millongs固定液(pH7.2～7.4)400 ml灌流，取十二指肠、空肠、回肠(定位，各1 cm长肠管)，后固定于同一固定液中约12 h，制作恒冷箱冰冻连续切片(片厚20μm)。大鼠小肠还制作粘膜下层和外纵肌全层撕片。应用酶组织化学及免疫组织化学法分别显示acetylcholinesterase(AChE)、VIP和AChE-VIP联合染色。
1.2 AChE组织化学染色
按改良的Karnovsky-Roots(1964)亚铁氰化铜直接显示法[2]，以碘化乙酰硫胆碱(Switzerland产品)为底物，四异丙基焦磷酰胺(iso-OMPA，England产品)作假性胆碱酯酶的抑制剂。肠切片或撕片标本在37 ℃下分别孵育2.5或3.0 h，最后常规脱水，透明，封片。
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1.3 免疫组织化学染色
按Sternberger(1970)非标记抗体过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP法)[3]，稍加改动，标本先后经甲醇-过氧化氢(37℃ 40 min)和2.5 g/L TritonX-100(37℃ 1 h)和30 g/L牛血清蛋白(37℃ 1 h)预处理，随后转入兔抗VIP抗体(Peninsula Lab Inc产品)(1∶7000)孵育(37℃ 70 h左右)，入羊抗兔IgG(1∶200)和PAP复合物(1∶400)(均由上海医科大学病理室提供)，各于37℃孵育1 h，然后标本在0.5 g/L 3-3'-二氨基联苯胺(DAB)-0.1 g/L H2O2-Tris HCl缓冲液(pH7.6)中显色(呈棕色产物)和常规脱水、透明、封片。
1.4 AChE-VIP联合染色
先做AChE显色(呈棕色产物)，后做PAP法显示VIP和用二盐酸联苯胺(呈蓝色产物)作显色剂。全部肠染色标本，在配有测微器的光镜下做比较观察，并做阳性神经元胞体和神经纤维密度计数(半定量)。
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2 结果
2.1 大鼠小肠
切片中小肠壁的四层基本组织结构清楚，其中以粘膜层和环肌层较醒目。外纵肌层或粘膜下层撕片标本中神经节(肠肌丛或粘膜下丛)及节间束的神经纤维网络结构清楚(图1)。 AChE阳性神经纤维和末梢(简称酶阳性神经)广泛分布于肠壁各层和肠肌丛内，肌层及节间束可见众多的酶活性强的粗大神经(干或束)，环肌层酶阳性神经最丰富，固有膜内酶阳性神经稍细小。肠肌丛中主要为带膨体的神经末梢。酶阳性神经的分布密度从十二指肠到回肠逐渐增高。撕片标本，粘膜下神经丛和肠肌丛(图2)酶活性甚强，结构醒目。粘膜下神经丛神经元胞体分布较少，而肠肌丛中有大量密集的酶阳性神经元胞体，有的丛多至几十个酶阳性神经元胞体(表1)。节间束中也有散在分布的酶阳性神经元胞体。细胞圆形或卵圆形，胞体(核周质)均质状着棕黄色或棕褐色，核不着色。酶阳性神经和这些神经元胞体突起在丛内和节(丛)间交织成网，有的胞突末端膨大与邻近的酶阴性或弱阳性细胞体呈终扣样接触(图3)。小肠各段肠肌丛神经元胞体的酶活性和分布密度(梯度)有明显差别，酶中-强度阳性神经元胞体占肠肌丛中神经元胞体总数的平均百分率分别为：回肠37.1%、空肠33.5%、十二指肠28.7%(P<0.05)。
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表1 大鼠和豚鼠小肠壁内神经丛AChE及VIP阳性神经元胞体的半定量比较
胞体数
十二指肠
空 肠
回 肠
粘膜下丛
肠肌丛
粘膜下丛
肠肌丛
粘膜下丛
肠肌丛
AChE
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大鼠
+
+
+
++
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++++
豚鼠
+
++
++
++
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VIP
大鼠
+
±
(++)
+
++
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豚鼠
+
±
++
(++)
+++
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(+++)
++++，众多(15个以上/丛)；+++，较多(10～15个)/丛；++，中等量(6～10个/丛)；±(1～2个/丛)或偶见
图1 大鼠小肠肠肌丛(AMP)及节间束(↑)中VIP-ir神经纤维网络结构 ×200
图2 大鼠回肠肠肌丛AChE阳性神经元.×200
图3 大鼠回肠肠肌丛AChE强阳性神经元，其胞突与胸体呈终扣样接触(↑) ×400
VIP免疫反应(ir)神经在粘膜层(以固有膜为主)和环肌层和肠肌丛中分布较密集，纵肌层有中等量分布。粘膜下层血管旁也有VIP-ir神经。VIP-ir神经大多数为膨体样神经末梢，偶见细小神经干。VIP-ir神经的分布密度与酶阳性神经相比明显低，但在小肠各段中也有相似的梯度分布。撕片标本小肠粘膜下神经丛和肠肌丛内VIP-ir神经元胞体少，一个肠肌丛中最多可见6个VIP-ir细胞，一般为2～3个；粘膜下丛VIP-ir神经元胞体相对较多(图4)，神经元胞体(核周质)的免疫反应性较强。胞体多为圆形，其胞体突起多，也有的胞体由二端发出突起，有的可见长轴突行走于数个节(丛)之间，与邻近(阴性或阳性)的胞体呈终扣样联系(图5)。VIP-ir胞体在小肠各段肠肌丛中的分布密度及梯度也与AChE阳性神经相似。
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图4 大鼠回肠粘膜下神经丛VIP-ir神经元及其网络联系结构 ×200
图5 大鼠腔肠肠肌丛VIP-ir神经元，其胞突与胞体呈终扣样接触(↑) ×400
2.2 豚鼠小肠
与大鼠相比较，切片标本小肠壁的4层结构较醒目，粘膜下层结构也明显。豚鼠小肠内AChE阳性和VIP-ir二种神经元胞体和神经纤维的分布密度及着色强度(酶活性或免疫反应性)均明显高于大鼠小肠内者，但其形态学和在小肠各段中的分布梯度与大鼠者是相似的。在小肠壁内各层和肠肌丛中酶阳性神经和VIP-ir神经都很丰富，特别是VIP-ir神经在粘膜层(以固有膜为主)、粘膜下层和环肌层均有浓密分布(表2)。粘膜下神经丛、肠肌丛和节间束中存在大量AChE阳性神经元胞体及少量VIP-ir神经元胞体(表1)。
表2 豚鼠小肠壁内AChE和VIP阳性神经的分布
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阳性神经数(均值)/
25μm×25μm
十二指肠
空肠
回肠
粘膜层
环肌层
粘膜层
环肌层
粘膜层
环肌层
AChE
1.390
, http://www.100md.com
1.560
1.450
1.650
1.560
1.740
VIP
0.670
0.370
0.780
0.450
0.850
0.540
2.3 肠肌丛中AChE与VIP共染神经元
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双染相邻切片显示豚鼠和大鼠的肠肌丛中均可见到个别的VIP-ir(蓝色)与AChE阳性反应(棕色)重叠分布于同一神经元胞体(图6)。有些神经纤维也出现2种阳性反应产物的重叠分布。表明在ENS神经元中存在AChE与VIP共存的可能性。
图6 豚鼠回肠肠肌丛(↑)AChE和VIP阳性神经元。
A：肠肌AChE阳性神经元.B：肠肌丛神经元内AChE与VIP共染 ×200
3 讨论
胃肠道已被公认具有外源性的和内在固有的外周自主神经的双重支配。本实验结果表明，AChE阳性神经和VIP能神经在豚鼠和大鼠小肠壁内具有外来的和内在的双重支配。后者为肠壁内小神经节和节内含有各种性质的神经元(包括感觉、运动和中间神经元)，被统称为肠神经系统(enteric nervous system，ENS)[4]，属于外周自主神经的一部分。肠肌丛是ENS最具形态特征的结构，丛内酶中-强度阳性神经节细胞大部分可能是胆碱能神经元。酶阳性和VIP-ir 2类神经元在二种动物小肠壁层内有密度和节段性梯度分布的差异，ENS不同类型神经元的这种分布特点，提示可能与各自的不同生理功能作用有关。
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3.1 胆碱能神经
肠壁内酶阳性神经分布十分广泛。传统认为，外来源于延髓迷走神经运动背核进入肠壁各层的神经纤维被称为副交感胆碱能节前纤维，这些纤维与肠壁内神经节细胞建立突触形态联系；肠壁内胆碱能神经元被称为副交感节后运动神经元，由其发出纤维(节后纤维)分布于肠壁内各层。现在认为，此种壁内神经节(丛)及其神经元为ENS的基本结构。ENS神经元的种类众多，在肠肌丛中有丰富的胆碱能神经元，还有肽能神经元，如：VIP能神经元等。其中胆碱能神经元在种族和个体发生过程中是最早出现的神经元，也是ENS内数目最多、类型最复杂的一种神经元(也有感觉、运动和中间神经元性质)[5,6]。ENS中胆碱能神经成分与肠腺分泌及肠管运动可能都有关。胆碱能神经元释放经典递质乙酰胆碱(ACh)，为胃肠动力兴奋性递质，具有刺激肠肌收缩和促进肠蠕动的作用。
3.2 VIP能神经
在胃肠道，VIP是一种胃肠激素，但主要是一种神经肽，存在于神经结构内。VIP被认为属于NANC抑制系统的一种神经递质，为肠道下行抑制性神经元的递质，具有强的扩血管、舒张平滑肌的作用和加强小肠的分泌活动，参加吸收过程，特别是抑制肠的紧张性，参与肠蠕动调制的重要成分之一〔另一种主要的NANC递质为一氧化氮(nitric oxide，NO)〕[7,8]。
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3.3 ACh能神经与VIP能神经的关系
肠壁内神经丛中VIP-ir神经元胞体数量明显少于酶阳性细胞，但二者神经纤维肠壁内的分布模式是相似的，仅有密度的差别，但都十分丰富，又都有内源性和外源性的双重支配。 酶阳性和VIP-ir二种神经的重叠分布在同一神经元中的共染，表明ACh与VIP有可能共存。唾液腺内已被公认有ACh与VIP这二种递质共存，协同促进腺体分泌[9]。但在胃酸分泌的调节中，VIP抑制壁细胞分泌胃酸，而ACh促胃酸分泌。此外，VIP-ir神经元在肠肌丛内与其他神经元之间均有“突触”样联系[10]，但二种神经元之间的形态联系及其功能尚需进一步探讨。
综上所述，酶阳性和VIP-ir二种肠神经是调整胃肠运动生理功能的重要神经成分，在扩张肠管所引起的蠕动波中，兴奋肠肌收缩的递质为ACh，抑制肠肌(舒张)的递质为VIP。二者可能还涉及肠动力异常的病理生理的肠神经机制[8,11]。
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*卫生部科学基金资助项目(No.96-1-139)
作者简介：李林，女，1957年生，讲师。现址：武汉市职工医学院组织学与胚胎学教研室，武汉 430016
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10 Tsuto T，Obata-Tsuto H L, Iwai N et al. Fine Structure of neurons synthesizing vasoactive intestinal peptide in the human colon from patients with Hirschsprung's disease. Histochemistry，1989,93:1
11 林传友，杨晓进，茹立强等. 先天性巨结肠症结肠内肽能神经支配的紊乱. 中华小儿外科杂志，1991,12(6):341
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药