实验性肝硬化大鼠的肝细胞凋亡及其影响因素的研究
作者：栗华 马宏安 邓健 冷双英 刘殿武 刘树贤
单位：马宏安(河北省石家庄市桥东公安分局法医室);邓健(河北医科大学公共卫生学院);冷双英(河北医科大学公共卫生学院);刘殿武(河北医科大学公共卫生学院);刘树贤(河北医科大学公共卫生学院)
关键词：细胞凋亡；肝硬化，实验性；大鼠
山西医科大学学报000104 摘要： 实验分为两个阶段：A.采用复合因素(CCl4，胆固醇，乙醇)制备大鼠肝硬化模型。B.用自组中药方剂进行治疗，观察肝硬化恢复情况和肝细胞凋亡的变化。结果显示：①用复合因素制备大鼠肝硬化模型的周期为 50 d。肝硬化大鼠 ALT 明显升高，为(135.33±59.77)mol/(s.L)；A/G 比值倒置为 0.60±0.12。HE 染色镜下可见肝组织正常结构消失，形成大小不等的假小叶，增生和变性坏死的肝细胞并存，并可见散在的核固缩、浓染、体积变小的凋亡细胞。流式细胞术分析可见有 AP 峰出现，其细胞凋亡率为 12.30%。 C-myc 基因表达量明显高于对照组，而 bcl-2 基因表达量则低于对照组。② 肝硬化的大鼠模型用中药治疗 20 d 后，体重增加，ALT、A/G 比值接近正常。病理检查，肝硬化时的假小叶逐渐消失，变性坏死的细胞减少。DNA 电泳显示仍有“Ladder”带纹，流式细胞术分析，凋亡率、C-myc 基因表达量均低于同期的肝硬化非治疗对照，而 bcl-2 基因则高于对照。
, 百拇医药
中图分类号： R575.2 R392.12 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0008-03
Hepatocyte apoptosis and effective factors in the rat with experimental liver cirrhosis
Li Hua, Ma Hongan, Deng Jian， et al
(Hebei Academy of Medical Sciences, Shijiazhuang 050021)
Abstract： The studies consisted of two stags: developing a model of rat liver cirrhosis with complex factors (CCl4，cholesterol, alcohol) and observing the changes of the rat hepatocyte apoptosis in treated and untreated with traditional Chinese medicine. The results showed that:① The models were developed by the complex factors for 50 days, and their ALT raised to a higher level, (135.33±59.77) mol/(s.L). A/G ratio became inverted (0.60±0.12). By observation of liver tissue stained by HE under microscope, normal structure of liver tissue disappeared, false liver lobes formed and there were some degenerate and necrotic hepatocytes, in a liver lobe apoptosis characterized by dark blue and shrink of the nucleus were found. The results of flow cytometry showed that AP peak appeared in the DNA histogram,apoptotic rate was 12.30%, the expressivity of C-myc was apparently higher than the normal control,but the expressivity of bcl-2 was lower than it.② After treated with traditional Chinese medicine for 20 days, the rat weight increased, and ALT and A/G ratio in liver cirrhosis were close to normal control. Pathological examination showed that liver cirrhosis false lobe gradually disappeared,degeneration and necrosis of hepatocytes decreased. The ladder strips were also visible on the eletrophoresis. The results of flow cytometry suggest that the apoptotic rate and expressivity of C-myc are all lower than the control of liver cirrhosis in the meantime, but the expressivity of bcl-2 is higher than the control of liver cirrhosis.
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Key words: apoptosis; liver cirrhosis, experiment; rats
为了解肝细胞凋亡在肝硬化中的作用，本实验研究利用大鼠肝硬化模型，研究了肝硬化与凋亡的关系，以及中药治疗肝硬化后对凋亡的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 动物：健康雄性 SD 大鼠，体重 180～230 g，河北医科大学实验动物中心提供。药品与试剂：蛋白酶 K(PK，Merck 公司)、核糖核酸酶(RNaseA,Sigma 公司)和NP-40(Sigma 公司)。其他试剂均为国产分析纯。仪器： 流式细胞仪(flow cytometry, FCM)FACS-420 美国、全自动生化分析仪(COBASMIRA PLUS，Switzerland)。
1.2 肝硬化模型的制备 将体重 180～230 g 雄性 SD 大鼠称重后，随机分成 2 组。即正常对照组和实验组。在实验室喂养一周后，开始实验，对照组共 7 只，皮下注射植物油，剂量、次数同实验组，蒸馏水灌胃。实验组共 60 只，采用复合因素制肝硬化模型[1]，第一天皮下注射 CCl4 (40%植物油溶液)，0.5 ml/100 g 体重，以后每隔 4 d 注射 CCl4 0.3 ml/100 g 体重，共 14 次，第 50 d 停止。饲料：前两周为 80% 玉米面，20 % 猪油，以后为单纯玉米面混以 0.5% 胆固醇。饮料：30%～50%乙醇溶液灌胃。
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1.3 中药治疗大鼠肝硬化 将形成肝硬化的 17 只大鼠称重后随机分为 3 组，即肝硬化组 6 只，模型制成后随即处死；肝硬化治疗组 6 只，用自制中药治疗 20 d (一疗程)，剂量：饱和糖浆溶液，1 ml/100 g 体重，早晚各一次灌胃给药；治疗对照组 5 只，常规饲养，早晚各一次灌胃给蒸馏水，20 d 后与治疗组一并处死。
1.4 肝硬化的诊断标准及各指标的检测
1.4.1 肝硬化的诊断的标准[2，3] 肝脏功能减退及肝功能异常，肝脏质地变硬，肝组织病理检查镜下可见正常肝小叶结构被破坏，由广泛增生的纤维组织将原来 1 的肝小叶分割包绕成大小不等、圆形或椭圆形的肝细胞团，即假小叶。
1.4.2 动物取完血后，颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏，称肝脏绝对湿重，以 g 表示。
1.4.3 生化指标测定 检测血清中 ALT (丙氨酸转氨酶)、TP(总蛋白)、Alb(白蛋白)，全部样品均用全自动生化分析仪测定。
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1.4.4 肝脏组织病理学检查 取部分肝脏切成约 0.3 cm×1.5 cm 大小的小块，固定于 Bouin 液中，常规石蜡包埋，HE 染色。
1.4.5 DNA 片段琼脂糖凝胶电泳 称取 0.5 g 肝脏，制成 100 g/L 的肝细胞悬液。按 1994 年 Hermann 等方法抽提 DNA[4]。用 TE 溶解 DNA (50 μl/L×104 细胞)后，10 g/L 琼脂糖凝胶检测 DNA 断裂情况。
1.4.6 流式细胞仪(FCM)分析 取部分肝脏组织固定于 700 ml/L 预冷乙醇溶液，研磨成单细胞，50 mg/L RNA 酶 37 ℃ 消化 1 h，65 mg/L 碘化丙啶(PI) 4 ℃染色 1 h，测量数据输入 HP 300 Consort 30 计算机，应用 Single histogram statistics 软件进行资料处理。检测凋亡细胞百分率，DNA 含量等。并计算增殖指数 PI。
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1.4.7 用 FCM 采用间接免疫荧光染色法测定 bcl-2，C-myc 基因表达量、标记率。
1.5 统计学处理 采用单因素方差分析，实验结果以
±s表示。统计分析用 poms 软件进行处理。显著性差异以 P<0.05 为准。
2 结果
2.1 一般情况 实验组从实验开始，动物皮毛杂乱无光泽，活动及饮食欲减少，体重减轻。对照组在整个实验其间，毛色光润，体重增加，无异常表现。
肝硬化模型制成后，即实验第 53 d，对照组 7 只体重全部增加，由原来的 228.29 g 增至 281.29 g，平均增重 53.00 g 增加了23.22%；实验组存活的 17 只体重全部减轻，由原来的平均体重 219.18 g，降至 169.00 g，平均减重 50.18 g，减少了 22.89%。
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治疗组开始治疗后，摄食增加，体重增加，毛色逐渐光润，活动趋于正常。肝硬化对照组与治疗情况类似。治疗前两组体重相比，无显著性差异，P>0.05，消除了由于分组不均造成两组增重不同的可能。
经 20 d 治疗后，肝硬化治疗组体重由原来肝硬化时的 187.00 g 增至 260.33 g，平均增加 73.33 g，增加了 39.21%；治疗对照组由原来肝硬化时的 165.40 g 增至 248.00 g，平均增重 82.60 g，增加了 49.94%。说明此中药不能使肝硬化鼠体重增加。
2.2 肝功能指数 与正常对照组相比，肝硬化组 ALT 异常，为(135.33±59.77) mol/(s.L) P<0.01；A/G 比值明显倒置(表1)。
表1 不同组别大鼠血清生化指标的测定结果 (±s) 组别
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例数
A/G
ALT(mol/s.L)
对照
7
1.00±0.09
41.1±12.05
肝硬化组
6
0.72±0.12**
135.33±59.77**
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肝硬化治疗组
6
0.91±0.04*
40.83±13.56*
肝硬化对照组
5
0.85±0.09*
77.80±11.92*
*与对照组相比 P<0.05； **与对照组相比 P<0.01
2.3 肝脏大体观察 肉眼可见，正常对照组肝脏质地光滑柔软，颜色暗红，分为六叶，正常大小；肝硬化组肝脏边缘变钝，有的小叶萎缩，个别的小叶与腹腔其他脏器粘连，肝脏质地变硬，颜色变浅，重量减轻，体积变小，表面可见细颗粒状结节，呈半球形隆起于肝表面，肝被膜增厚，结节呈黄褐色(肝细胞脂肪变)。中药治疗后的肝脏，质地稍软，颜色变深，体积大于肝硬化组，近于正常，表面无颗粒状结节；而治疗对照组比治疗组体积略小，质地稍硬，颜色较浅，表面亦无颗粒关结节。
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四组肝脏相对重量比较，肝硬化组最大，为(4.07±0.39)g/kg 体重，肝硬化对照组其次，为(3.47±0.24)g/kg 体重，与正常对照组相比 P<0.01。
2.4 肝脏病理观察 正常对照组肝小叶正常。肝硬化组，形成明显肝硬化假小叶，即正常肝小叶结构被破坏，由广泛增生的纤维组织将原来的肝小叶分割包绕成大小不等、圆形或椭圆形的肝细胞团，假小叶内肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性、坏死明显，有脂肪粒，散在少数凋亡细胞，即核固缩、浓染，无炎症细胞浸润；治疗后，原来肝硬化假小叶消失，有肝细胞再生，已有正常肝索形成。治疗对照组，无明显正常肝索形成，但有肝细胞再生。
2.5 DNA 片断琼脂糖凝胶电泳结果 肝硬化组 DNA 降解不明显，肝硬化治疗组及治疗对照组可见清晰的“Ladder”，第一条带约为180 bp ，依次倍增。而对照组不显“Ladder”状带纹。
2.6 流式细胞术分析 FCM 的细胞分布直方图显示，肝硬化组、肝硬化治疗组和治疗对照组均出现低于 2 C 峰的 AP 峰，而正常对照组则未出现 AP 峰。其细胞凋亡率正常对照组最低，仅为 2.23%，肝硬化 12.30%，肝硬化治疗组 20.10%(P<0.01)。DNA 相对含量治疗和治疗对照组低于前两组。
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肝硬化治疗组治疗对照组各时期细胞百分数都下降，说明凋亡发生时各时期细胞数都减少。治疗组 PI 指数最高(见表2)。
表2 不同组别大鼠肝细胞不同时期百分率和PI指数(%) 组别
例数
G0/G1期
S期
G2/M期
PI
对照
3
63.87±1.85
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14.30±2.23
14.43±1.66
31.02±2.15
肝硬化组
3
55.47±7.01*
13.60±2.80
14.53±2.02
33.77±6.42
肝硬化治疗组
3
50.53±2.25*
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11.87±0.92
13.60±1.15
35.50±1.52
肝硬化对照组
3
53.73±5.05*
11.13±0.81
10.30±4.27
28.26±6.77
*与对照组相比 P<0.05
2.7 C-myc基因、bcl-2基因表达量与凋亡的关系 C-myc基因表达量在凋亡率最高的治疗对照组最高，正常对照组最低，说明随凋亡率增加，C-myc基因增加，而 bcl-2 基因表达量则随凋亡率增加而减少(见表3)。
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表3 不同组别大鼠肝细胞bcl-2和C-myc基因表达量和标记率(%) 组别
bcl-2
C-myc
表达量
标记率
表达量
标记率
对照
61.00
12.70
3.57
17.00
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肝硬化组
65.00
12.40
4.20
20.10
肝硬化治疗组
59.00
17.30
4.44
14.20
肝硬化对照组
54.00
17.20
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4.56
33.20
3 讨论
营养不良可造成肝硬化，主要有两种方式：一是给予高脂肪、低蛋白质、低胆碱饮食，使肝脏发生脂肪变性，逐渐形成肝硬化，二是食物缺乏某些营养因素，如胱氨酸、蛋氨酸、维生素 E 等，引起肝细胞坏死，进而发展为肝硬化。因而常用低蛋白质、高脂肪饲养动物，加上乙醇和四氯化碳复合因素促进肝硬化的发展。单纯玉米粉仅含 0.09 g/g 蛋白质，只能满足鼠正常蛋白质需要量之一半，且此蛋白质中缺乏色氨酸与蛋氨酸，这些氨基酸属趋脂物质，缺乏会导致肝脂肪变，以至纤维化，加入乙醇和胆固醇增加机体对胆碱需要量，从而加速脂肪肝的发展。脂肪变性的肝细胞对 CCl4 损伤作用敏感，故肝细胞大量坏死，网状支架塌陷，纤维增生，发展为肝硬化[1]。
肝硬化模型制成后 ALT 增加，A/G 比值倒置。镜下可见明显肝硬化假小叶，假小叶内肝索排列紊乱，肝细胞变性、坏死明显，有脂肪粒。肝脏实际重量肝硬化组最小，但其相对重量却最大。这是由于肝硬化后，肝脏质地变硬，纤维大量增生，而动物体重减轻所致。
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服用中药 20 d (一个疗程)后，治疗组 ALT 降到正常，而治疗对照组 ALT 虽有下降但仍不正常。用药后，治疗组 A/G 比值接近正常对照组，而治疗对照组的比值虽有好转，但仍不如治疗组。说明中药服用 20 d 能明显改善肝硬化大鼠肝功能。但中药对肝硬化后大鼠体重无增加作用。
肝硬化后可增加肝细胞凋亡，肝硬化模型制成后 20 d 凋亡率最高，DNA 片断凝胶电泳呈现典型“Ladder”带纹，FCM 检测可见明显的凋亡峰∶AP 峰。经中药治疗 20 d 后，大鼠肝功能恢复正常，凋亡率较治疗对照组降低。说明此中药方剂可使细胞增殖活跃，以恢复细胞数量和功能。正常肝脏的细胞凋亡参与调节肝细胞数量，维持肝脏正常体积[5]。肝硬化后，肝细胞凋亡较正常组增加，可能是肝硬化后启动了某些机制，通过细胞主动死亡来阻止病变的进一步发生发展[6]。
细胞凋亡时，细胞内 DNA 发生降解，使 G1 期细胞数减少。在凋亡率高的组，G1期细胞数明显减少，因而 S 期和 M 期细胞数也相应的减少。
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曾有报道 bcl-2 在各种正常细胞的活化和发育过程中表达，而在成熟的或走向凋亡的细胞中不表达或低表达。而且 bcl-2 基因的过高表达可防止或明显降低各种刺激如射线、自由基、化疗药物等引起的细胞凋亡[7，8]。因而认为 bcl-2 是抑制细胞凋亡的基因。本实验结果与报道一致。bcl-2 基因表达量在凋亡率最高的肝硬化对照组最低，在正常对照组最高，说明随调亡率增加，bcl-2基因表达量减少。C-myc 基因可介导细胞的生长和增殖。它又可促进和抑制细胞凋亡[9]。本研究发现，C-myc基因表达量随凋亡率增加而增加，说明 C-myc 基因可诱导肝硬化后的肝细胞凋亡。
作者简介： 栗华，女，1965年7月生，硕士，助理研究员
栗华(河北省医科院实验所 石家庄 050021)
参考文献：
, 百拇医药
[1] 韩德五.肝硬化动物模型的研究[J].山西医药杂志，1979，4 (1)： 1～4.
[2] 陈国桢.内科学[M].北京：人民卫生出版社，1984. 367.
[3] 武忠弼.病理学[M].北京：人民卫生出版社，1989. 315.
[4] Hermann M, Loren HM, Voll R, et al. A rapid and simple method for isolation of apoptosis DNA fragments[J]. Nucleic Acid Res. 1994， 22: 5506～5507.
[5] 王新生. 肝细胞研究进展[J].国外医学流行病学传染病学分册， 1997， 24 (1)： 27～32.
, 百拇医药 [6] Savagek, DhillonAP, Schmilovitz WH, et al. Detection of HCV-RNA in paraffin-embedded liver biopsies from patients with autoimmune hepatitis[J]. Hepatol, 1995， 22 (1): 27～34.
[7] Gillardon F, Wickert H, Zimmermann M. Up-regulation of bax and down-regulation of bcl-2 is associated with kainate-induced apoptosis in mouse brain[J]. Neurosci Lett, 1995,192 (2): 85～88.
[8] Sumner AT, de la Torre J, Stuppia L, et al. The distribution of genes on chromosomes: a cytological approach[J]. J Mol Evol, 1993, 37 (2): 117～122.
[9] Gold R, Schmied M, Rothe G, et al. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue sections[J]. J Histochem Cytochem, 1993, 41 (7): 1023～1030.
[收稿日期： 1999-08-26], 百拇医药
单位：马宏安(河北省石家庄市桥东公安分局法医室);邓健(河北医科大学公共卫生学院);冷双英(河北医科大学公共卫生学院);刘殿武(河北医科大学公共卫生学院);刘树贤(河北医科大学公共卫生学院)
关键词：细胞凋亡；肝硬化，实验性；大鼠
山西医科大学学报000104 摘要： 实验分为两个阶段：A.采用复合因素(CCl4，胆固醇，乙醇)制备大鼠肝硬化模型。B.用自组中药方剂进行治疗，观察肝硬化恢复情况和肝细胞凋亡的变化。结果显示：①用复合因素制备大鼠肝硬化模型的周期为 50 d。肝硬化大鼠 ALT 明显升高，为(135.33±59.77)mol/(s.L)；A/G 比值倒置为 0.60±0.12。HE 染色镜下可见肝组织正常结构消失，形成大小不等的假小叶，增生和变性坏死的肝细胞并存，并可见散在的核固缩、浓染、体积变小的凋亡细胞。流式细胞术分析可见有 AP 峰出现，其细胞凋亡率为 12.30%。 C-myc 基因表达量明显高于对照组，而 bcl-2 基因表达量则低于对照组。② 肝硬化的大鼠模型用中药治疗 20 d 后，体重增加，ALT、A/G 比值接近正常。病理检查，肝硬化时的假小叶逐渐消失，变性坏死的细胞减少。DNA 电泳显示仍有“Ladder”带纹，流式细胞术分析，凋亡率、C-myc 基因表达量均低于同期的肝硬化非治疗对照，而 bcl-2 基因则高于对照。
, 百拇医药
中图分类号： R575.2 R392.12 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0008-03
Hepatocyte apoptosis and effective factors in the rat with experimental liver cirrhosis
Li Hua, Ma Hongan, Deng Jian， et al
(Hebei Academy of Medical Sciences, Shijiazhuang 050021)
Abstract： The studies consisted of two stags: developing a model of rat liver cirrhosis with complex factors (CCl4，cholesterol, alcohol) and observing the changes of the rat hepatocyte apoptosis in treated and untreated with traditional Chinese medicine. The results showed that:① The models were developed by the complex factors for 50 days, and their ALT raised to a higher level, (135.33±59.77) mol/(s.L). A/G ratio became inverted (0.60±0.12). By observation of liver tissue stained by HE under microscope, normal structure of liver tissue disappeared, false liver lobes formed and there were some degenerate and necrotic hepatocytes, in a liver lobe apoptosis characterized by dark blue and shrink of the nucleus were found. The results of flow cytometry showed that AP peak appeared in the DNA histogram,apoptotic rate was 12.30%, the expressivity of C-myc was apparently higher than the normal control,but the expressivity of bcl-2 was lower than it.② After treated with traditional Chinese medicine for 20 days, the rat weight increased, and ALT and A/G ratio in liver cirrhosis were close to normal control. Pathological examination showed that liver cirrhosis false lobe gradually disappeared,degeneration and necrosis of hepatocytes decreased. The ladder strips were also visible on the eletrophoresis. The results of flow cytometry suggest that the apoptotic rate and expressivity of C-myc are all lower than the control of liver cirrhosis in the meantime, but the expressivity of bcl-2 is higher than the control of liver cirrhosis.
, 百拇医药
Key words: apoptosis; liver cirrhosis, experiment; rats
为了解肝细胞凋亡在肝硬化中的作用，本实验研究利用大鼠肝硬化模型，研究了肝硬化与凋亡的关系，以及中药治疗肝硬化后对凋亡的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 动物：健康雄性 SD 大鼠，体重 180～230 g，河北医科大学实验动物中心提供。药品与试剂：蛋白酶 K(PK，Merck 公司)、核糖核酸酶(RNaseA,Sigma 公司)和NP-40(Sigma 公司)。其他试剂均为国产分析纯。仪器： 流式细胞仪(flow cytometry, FCM)FACS-420 美国、全自动生化分析仪(COBASMIRA PLUS，Switzerland)。
1.2 肝硬化模型的制备 将体重 180～230 g 雄性 SD 大鼠称重后，随机分成 2 组。即正常对照组和实验组。在实验室喂养一周后，开始实验，对照组共 7 只，皮下注射植物油，剂量、次数同实验组，蒸馏水灌胃。实验组共 60 只，采用复合因素制肝硬化模型[1]，第一天皮下注射 CCl4 (40%植物油溶液)，0.5 ml/100 g 体重，以后每隔 4 d 注射 CCl4 0.3 ml/100 g 体重，共 14 次，第 50 d 停止。饲料：前两周为 80% 玉米面，20 % 猪油，以后为单纯玉米面混以 0.5% 胆固醇。饮料：30%～50%乙醇溶液灌胃。
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1.3 中药治疗大鼠肝硬化 将形成肝硬化的 17 只大鼠称重后随机分为 3 组，即肝硬化组 6 只，模型制成后随即处死；肝硬化治疗组 6 只，用自制中药治疗 20 d (一疗程)，剂量：饱和糖浆溶液，1 ml/100 g 体重，早晚各一次灌胃给药；治疗对照组 5 只，常规饲养，早晚各一次灌胃给蒸馏水，20 d 后与治疗组一并处死。
1.4 肝硬化的诊断标准及各指标的检测
1.4.1 肝硬化的诊断的标准[2，3] 肝脏功能减退及肝功能异常，肝脏质地变硬，肝组织病理检查镜下可见正常肝小叶结构被破坏，由广泛增生的纤维组织将原来 1 的肝小叶分割包绕成大小不等、圆形或椭圆形的肝细胞团，即假小叶。
1.4.2 动物取完血后，颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏，称肝脏绝对湿重，以 g 表示。
1.4.3 生化指标测定 检测血清中 ALT (丙氨酸转氨酶)、TP(总蛋白)、Alb(白蛋白)，全部样品均用全自动生化分析仪测定。
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1.4.4 肝脏组织病理学检查 取部分肝脏切成约 0.3 cm×1.5 cm 大小的小块，固定于 Bouin 液中，常规石蜡包埋，HE 染色。
1.4.5 DNA 片段琼脂糖凝胶电泳 称取 0.5 g 肝脏，制成 100 g/L 的肝细胞悬液。按 1994 年 Hermann 等方法抽提 DNA[4]。用 TE 溶解 DNA (50 μl/L×104 细胞)后，10 g/L 琼脂糖凝胶检测 DNA 断裂情况。
1.4.6 流式细胞仪(FCM)分析 取部分肝脏组织固定于 700 ml/L 预冷乙醇溶液，研磨成单细胞，50 mg/L RNA 酶 37 ℃ 消化 1 h，65 mg/L 碘化丙啶(PI) 4 ℃染色 1 h，测量数据输入 HP 300 Consort 30 计算机，应用 Single histogram statistics 软件进行资料处理。检测凋亡细胞百分率，DNA 含量等。并计算增殖指数 PI。
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1.4.7 用 FCM 采用间接免疫荧光染色法测定 bcl-2，C-myc 基因表达量、标记率。
1.5 统计学处理 采用单因素方差分析，实验结果以
±s表示。统计分析用 poms 软件进行处理。显著性差异以 P<0.05 为准。2 结果
2.1 一般情况 实验组从实验开始，动物皮毛杂乱无光泽，活动及饮食欲减少，体重减轻。对照组在整个实验其间，毛色光润，体重增加，无异常表现。
肝硬化模型制成后，即实验第 53 d，对照组 7 只体重全部增加，由原来的 228.29 g 增至 281.29 g，平均增重 53.00 g 增加了23.22%；实验组存活的 17 只体重全部减轻，由原来的平均体重 219.18 g，降至 169.00 g，平均减重 50.18 g，减少了 22.89%。
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治疗组开始治疗后，摄食增加，体重增加，毛色逐渐光润，活动趋于正常。肝硬化对照组与治疗情况类似。治疗前两组体重相比，无显著性差异，P>0.05，消除了由于分组不均造成两组增重不同的可能。
经 20 d 治疗后，肝硬化治疗组体重由原来肝硬化时的 187.00 g 增至 260.33 g，平均增加 73.33 g，增加了 39.21%；治疗对照组由原来肝硬化时的 165.40 g 增至 248.00 g，平均增重 82.60 g，增加了 49.94%。说明此中药不能使肝硬化鼠体重增加。
2.2 肝功能指数 与正常对照组相比，肝硬化组 ALT 异常，为(135.33±59.77) mol/(s.L) P<0.01；A/G 比值明显倒置(表1)。
表1 不同组别大鼠血清生化指标的测定结果 (
±s) 组别, 百拇医药
例数
A/G
ALT(mol/s.L)
对照
7
1.00±0.09
41.1±12.05
肝硬化组
6
0.72±0.12**
135.33±59.77**
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肝硬化治疗组
6
0.91±0.04*
40.83±13.56*
肝硬化对照组
5
0.85±0.09*
77.80±11.92*
*与对照组相比 P<0.05； **与对照组相比 P<0.01
2.3 肝脏大体观察 肉眼可见，正常对照组肝脏质地光滑柔软，颜色暗红，分为六叶，正常大小；肝硬化组肝脏边缘变钝，有的小叶萎缩，个别的小叶与腹腔其他脏器粘连，肝脏质地变硬，颜色变浅，重量减轻，体积变小，表面可见细颗粒状结节，呈半球形隆起于肝表面，肝被膜增厚，结节呈黄褐色(肝细胞脂肪变)。中药治疗后的肝脏，质地稍软，颜色变深，体积大于肝硬化组，近于正常，表面无颗粒状结节；而治疗对照组比治疗组体积略小，质地稍硬，颜色较浅，表面亦无颗粒关结节。
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四组肝脏相对重量比较，肝硬化组最大，为(4.07±0.39)g/kg 体重，肝硬化对照组其次，为(3.47±0.24)g/kg 体重，与正常对照组相比 P<0.01。
2.4 肝脏病理观察 正常对照组肝小叶正常。肝硬化组，形成明显肝硬化假小叶，即正常肝小叶结构被破坏，由广泛增生的纤维组织将原来的肝小叶分割包绕成大小不等、圆形或椭圆形的肝细胞团，假小叶内肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性、坏死明显，有脂肪粒，散在少数凋亡细胞，即核固缩、浓染，无炎症细胞浸润；治疗后，原来肝硬化假小叶消失，有肝细胞再生，已有正常肝索形成。治疗对照组，无明显正常肝索形成，但有肝细胞再生。
2.5 DNA 片断琼脂糖凝胶电泳结果 肝硬化组 DNA 降解不明显，肝硬化治疗组及治疗对照组可见清晰的“Ladder”，第一条带约为180 bp ，依次倍增。而对照组不显“Ladder”状带纹。
2.6 流式细胞术分析 FCM 的细胞分布直方图显示，肝硬化组、肝硬化治疗组和治疗对照组均出现低于 2 C 峰的 AP 峰，而正常对照组则未出现 AP 峰。其细胞凋亡率正常对照组最低，仅为 2.23%，肝硬化 12.30%，肝硬化治疗组 20.10%(P<0.01)。DNA 相对含量治疗和治疗对照组低于前两组。
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肝硬化治疗组治疗对照组各时期细胞百分数都下降，说明凋亡发生时各时期细胞数都减少。治疗组 PI 指数最高(见表2)。
表2 不同组别大鼠肝细胞不同时期百分率和PI指数(%) 组别
例数
G0/G1期
S期
G2/M期
PI
对照
3
63.87±1.85
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14.30±2.23
14.43±1.66
31.02±2.15
肝硬化组
3
55.47±7.01*
13.60±2.80
14.53±2.02
33.77±6.42
肝硬化治疗组
3
50.53±2.25*
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11.87±0.92
13.60±1.15
35.50±1.52
肝硬化对照组
3
53.73±5.05*
11.13±0.81
10.30±4.27
28.26±6.77
*与对照组相比 P<0.05
2.7 C-myc基因、bcl-2基因表达量与凋亡的关系 C-myc基因表达量在凋亡率最高的治疗对照组最高，正常对照组最低，说明随凋亡率增加，C-myc基因增加，而 bcl-2 基因表达量则随凋亡率增加而减少(见表3)。
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表3 不同组别大鼠肝细胞bcl-2和C-myc基因表达量和标记率(%) 组别
bcl-2
C-myc
表达量
标记率
表达量
标记率
对照
61.00
12.70
3.57
17.00
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肝硬化组
65.00
12.40
4.20
20.10
肝硬化治疗组
59.00
17.30
4.44
14.20
肝硬化对照组
54.00
17.20
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4.56
33.20
3 讨论
营养不良可造成肝硬化，主要有两种方式：一是给予高脂肪、低蛋白质、低胆碱饮食，使肝脏发生脂肪变性，逐渐形成肝硬化，二是食物缺乏某些营养因素，如胱氨酸、蛋氨酸、维生素 E 等，引起肝细胞坏死，进而发展为肝硬化。因而常用低蛋白质、高脂肪饲养动物，加上乙醇和四氯化碳复合因素促进肝硬化的发展。单纯玉米粉仅含 0.09 g/g 蛋白质，只能满足鼠正常蛋白质需要量之一半，且此蛋白质中缺乏色氨酸与蛋氨酸，这些氨基酸属趋脂物质，缺乏会导致肝脂肪变，以至纤维化，加入乙醇和胆固醇增加机体对胆碱需要量，从而加速脂肪肝的发展。脂肪变性的肝细胞对 CCl4 损伤作用敏感，故肝细胞大量坏死，网状支架塌陷，纤维增生，发展为肝硬化[1]。
肝硬化模型制成后 ALT 增加，A/G 比值倒置。镜下可见明显肝硬化假小叶，假小叶内肝索排列紊乱，肝细胞变性、坏死明显，有脂肪粒。肝脏实际重量肝硬化组最小，但其相对重量却最大。这是由于肝硬化后，肝脏质地变硬，纤维大量增生，而动物体重减轻所致。
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服用中药 20 d (一个疗程)后，治疗组 ALT 降到正常，而治疗对照组 ALT 虽有下降但仍不正常。用药后，治疗组 A/G 比值接近正常对照组，而治疗对照组的比值虽有好转，但仍不如治疗组。说明中药服用 20 d 能明显改善肝硬化大鼠肝功能。但中药对肝硬化后大鼠体重无增加作用。
肝硬化后可增加肝细胞凋亡，肝硬化模型制成后 20 d 凋亡率最高，DNA 片断凝胶电泳呈现典型“Ladder”带纹，FCM 检测可见明显的凋亡峰∶AP 峰。经中药治疗 20 d 后，大鼠肝功能恢复正常，凋亡率较治疗对照组降低。说明此中药方剂可使细胞增殖活跃，以恢复细胞数量和功能。正常肝脏的细胞凋亡参与调节肝细胞数量，维持肝脏正常体积[5]。肝硬化后，肝细胞凋亡较正常组增加，可能是肝硬化后启动了某些机制，通过细胞主动死亡来阻止病变的进一步发生发展[6]。
细胞凋亡时，细胞内 DNA 发生降解，使 G1 期细胞数减少。在凋亡率高的组，G1期细胞数明显减少，因而 S 期和 M 期细胞数也相应的减少。
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曾有报道 bcl-2 在各种正常细胞的活化和发育过程中表达，而在成熟的或走向凋亡的细胞中不表达或低表达。而且 bcl-2 基因的过高表达可防止或明显降低各种刺激如射线、自由基、化疗药物等引起的细胞凋亡[7，8]。因而认为 bcl-2 是抑制细胞凋亡的基因。本实验结果与报道一致。bcl-2 基因表达量在凋亡率最高的肝硬化对照组最低，在正常对照组最高，说明随调亡率增加，bcl-2基因表达量减少。C-myc 基因可介导细胞的生长和增殖。它又可促进和抑制细胞凋亡[9]。本研究发现，C-myc基因表达量随凋亡率增加而增加，说明 C-myc 基因可诱导肝硬化后的肝细胞凋亡。
作者简介： 栗华，女，1965年7月生，硕士，助理研究员
栗华(河北省医科院实验所 石家庄 050021)
参考文献：
, 百拇医药
[1] 韩德五.肝硬化动物模型的研究[J].山西医药杂志，1979，4 (1)： 1～4.
[2] 陈国桢.内科学[M].北京：人民卫生出版社，1984. 367.
[3] 武忠弼.病理学[M].北京：人民卫生出版社，1989. 315.
[4] Hermann M, Loren HM, Voll R, et al. A rapid and simple method for isolation of apoptosis DNA fragments[J]. Nucleic Acid Res. 1994， 22: 5506～5507.
[5] 王新生. 肝细胞研究进展[J].国外医学流行病学传染病学分册， 1997， 24 (1)： 27～32.
, 百拇医药 [6] Savagek, DhillonAP, Schmilovitz WH, et al. Detection of HCV-RNA in paraffin-embedded liver biopsies from patients with autoimmune hepatitis[J]. Hepatol, 1995， 22 (1): 27～34.
[7] Gillardon F, Wickert H, Zimmermann M. Up-regulation of bax and down-regulation of bcl-2 is associated with kainate-induced apoptosis in mouse brain[J]. Neurosci Lett, 1995,192 (2): 85～88.
[8] Sumner AT, de la Torre J, Stuppia L, et al. The distribution of genes on chromosomes: a cytological approach[J]. J Mol Evol, 1993, 37 (2): 117～122.
[9] Gold R, Schmied M, Rothe G, et al. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue sections[J]. J Histochem Cytochem, 1993, 41 (7): 1023～1030.
[收稿日期： 1999-08-26], 百拇医药