聚合酶链反应及微板杂交法对人乳头瘤病毒分型检测
作者：魏军 李国富 王波 吕怀盛
单位：(宁夏医学院附属医院中心实验室，银川 750004；)
关键词：人乳头瘤病毒；PCR；杂交；ELISA
宁夏医学院学报000205 摘要：目的：为适应临床人乳头瘤病毒分型检测，建立了通用引物扩增(GP-PCR)及微孔板杂交-ELISA检测法。方法：先进行GP-PCR，其中一条引物5’端标记有地高辛，探针标记有生物素，通过包被在微孔板上的亲和素预先固定；将扩增产物加入预先包被有HPV型特异寡核苷酸探针和HPV基因组混合探针的聚苯乙烯微孔板中，42℃杂交仅需20～30min；最后，用酶底物与所标记的酶进行显色反应，通过测定吸光度来判断结果。结果：本法HPV各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度比PCR-琼脂糖凝胶电泳检测高100倍，最佳杂交时间为20～30min，重复性好，CV为8.75%；60例子宫颈癌标本的总检出率为92.5%，20例正常宫颈石蜡标本本法测定均为阴性。结论：该法特异性强，灵敏度高，操作简单，无放射性和E.B.污染，杂交时间短，检测成本低，便于临床常规应用。
, 百拇医药
中图分类号：R446 文献标识码：A
文章编号：1005-8486(2000)02-0090-03
Detecting and Typing Human Papillomaviruses By PCR Enzyme-immunoassay
WEI Jun, LU Huai-sheng,WANG Bo, et al
(Center Laboratory of Ningxia Medical College,Affiliated Hospital,Yinchuan 750004)
Abstract: Objective: To develop a novel easy method of detecting and typing human papillomaviruses in clinical laboratory.Methods:This procedure involved two steps: first, general primer mediated PCR(GP-PCR) was applied successfully to detect a broad spectrum of HPV in specimens diagnosed pathologically as squamous cell carcinoma of the uterine cervix And second, in order to facilitate HPV typing, a colorimetric microplate base hybridization assay was developed. One of the primer 5' ends was labeled by digoxin and all probes were labeled by biotin. The microplate was previously covered with avidin which can bind a biotinylated HPV-probe, fix with the biotinylated HPV genomic probes mix and type specific probes respectively. Hybridization was completed in a short time and the hybridized signal was detected by ELISA-like assay. Results: This assay was a high specific, no cross-reaction was noted within all types of HPVs. The sensitivity was one hundred times higher than that of agrose-electrophic technigue. The time to hybrid was very short and it just needed 20 to 30 minutes only. The repetitiveness very well and the variability was 8.75%.Conclusion: The method seems to be of the potential for rapid, specific and sensitive HPVs examination of clinical specimens.
, 百拇医药
Key words: human papillomaviruses; GP-PCR;microplate;hybridization
目前已知，人乳头瘤病毒(HPV)与人类疾病，特别是恶性肿瘤及癌前病变密切相关[1]，其致病性与HPV型别有关。因此，HPV临床检测，特别是型别鉴定显得尤为重要，临床上有必要建立一种简便、快速、灵敏、特异的分型检测方法。
我们选用Manos等[2]设计的一对能与多型HPV退火的通用引物，自行设计了PCR-微孔板杂交-ELISA检测法，对100例子宫颈癌样本进行了HPV检测和分型，取得了良好的效果，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
HPV16型DNA由Siha细胞提取；HPV18型DNA由Hella细胞提取。dNTP和HRP标记的地高辛抗体为Boehringer Mannheim产品，Taq DNA聚合酶为Promega产品，亲和素为Sigma产品；酶标板为丹麦Nunc公司产品；DNA扩增仪为美国PE480型。临床样本共80例，40例病理诊断为低分化鳞癌的宫颈石蜡切片，20例为宫颈活检组织(病理均证实为宫颈低分化鳞癌，其中1例为重度非典型增生)，20例为正常宫颈石蜡切片。标本分别取自宁夏医学院附属医院、北京妇产医院和山东烟台毓璜顶医院。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 引物和寡核苷酸探针
引物是从HPV L1区中选择保守序列设计[2]，上游引物MY11为 5’GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3’，下游引物MY09为 5’CGTCCMARRGGAWACTGATC 3’，上游引物的5’端标记有地高辛，预期扩增片段为450bp；基因组混合探针(GP)序列选自HPV L1区中另一保守序列，可与MY11和MY09引物产生的多种HPV扩增产物杂交；基因组混合探针、16型特异(MY14)和18型特异探针 3’端均标记生物素，引物和探针均由美国Synbercen公司合成。
1.2.2 PCR模板制备
细胞株和临床标本按文献[3，4]制备，取上清5μl PCR。
, 百拇医药
1.2.3 扩增
循环参数如下：94℃，预变性5min；然后94℃，50s；55℃，50s;72℃，50s;循环30圈；最后72℃继续延伸5min。
1.2.4 杂交与显色
每孔加入100μl 杂合素(10μg/ml)，4℃过夜；PBS洗板3次；加入生物素标记的探针100μl(探针终浓度为33μmol/L)，室温作用1h，PBS洗板3次；每孔加入杂交液100μl(主要成分为含6mmol/L尿素的Tris-Hcl)，然后加入经热变性的产物10μl，42℃杂交20～30min，1×SSC洗板3次，加入酶标抗体100μl，37℃，30min，PBS洗板3次，加入TMB显色液100μl[3]室温8min，立即加入1mol/L的H2SO4 50μl终止反应，450nm下读取OD值。Cut-off值定为0.200，大于此值判断为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 杂交特异性实验
将HPV16和18标准DNA扩增产物分别与公用混合探针、16型及18型特异探针杂交，结果表明HPV16和18型产物均能与公用混合探针杂交，但HPV16型产物仅与16型特异探针杂交，而18型产物也仅与18型特异探针杂交，两产物间无交叉反应。
2.2 杂交灵敏度实验
将一宫颈癌标本，以1∶10系列稀释后进行扩增，然后同时用琼脂糖凝胶电泳和杂交分别检测，结果电泳法为10-2，而后者为10-4。
2.3 杂交时间的优化选择
在其它条件相同时，杂交时间分别为15、30、60和120min，结果杂交时间在20～30min时信噪比最高。
, 百拇医药
2.4 重复性实验
取同一份样本，重复测定20次，结果表明：CV为8.75%。
2.5 临床样本检测
利用新建立的方法对临床80例样本进行了检测，结果见附表。
附表 80例临床样本检测结果 分 组
例数
微孔板杂交阳性
符合率
%
GP+
16+
, 百拇医药
GP+
18+
GP+
宫颈活检
20
17
3
19
95
宫颈癌切片
40
29
7
, 百拇医药 36
90
正常宫颈切片
20
0
0
0
100
3 讨论
本法首先利用通用引物对各型别的HPV感染进行扩增，再经基因组混合探针和型特异探针同时对一管产物分别杂交，这样既可快速检出已知型别，同时基因组混合探针的使用，还可发现未知新型或未知序列的其它型别的感染，这样可提高样本中HPV感染的检出。
本研究的结果表明，PCR-微板杂交-ELISA检测法具有较好的特异性和稳定性，所需时间短，杂交灵敏度明显高于PCR-琼脂糖凝胶电泳检测，这与Marcel等[5]报道的双标记微孔板杂交法的灵敏度基本相符。
, 百拇医药
利用新建立的方法对临床80例样本检测结果表明，20例正常宫颈石蜡切片全部为阴性，与病理诊断的符合度为100%；40例病理诊断为宫颈低分化鳞癌的石蜡切片，经GP-PCR后，琼脂糖电泳和本法的检出符合率为100%，两法对HPV的检出率为90%，而活检标本检出率为95%，其中1例公用探针杂交为阳性，而型特异探针杂交为阴性，这可能系其它型别感染所致。
综上所述，PCR微孔板杂交技术是近几年出现的一种新的分子生物学检测法，可采用双探针双标记夹心杂交法，也可引物和探针双标记杂交。本法用于HPV感染检测，具有简便、快速、重复性好等优点，用于多型别的HPV检测有很高的灵敏度和特异性，临床应用前景广泛。
参考文献：
[1] Hausen H. Human Papillomaviruses and their possible role in squamous cell carcinomas[J].Current Topic Microbial Immunol, 1977,78:1
, http://www.100md.com
[2] Michael A.PCR Protocols: A guide to methods and application[M]. San Diego: Academic Press, 1990.365-36
[3] 王申五.基因诊断技术[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.103
[4] 林万朋.PCR技术操作和临床应用指南.北京：人民军医出版社，1995.35
[5] Marcel V, Adriaan JC. A non-radiation PCR enzyme-immunoassay enables a rapid identification of HPV 16 and 18 in cervical scrapes after GP5+/6+PCR[J].J Med Viral, 1996,49:223
收稿日期：1999-12-29, 百拇医药
单位：(宁夏医学院附属医院中心实验室，银川 750004；)
关键词：人乳头瘤病毒；PCR；杂交；ELISA
宁夏医学院学报000205 摘要：目的：为适应临床人乳头瘤病毒分型检测，建立了通用引物扩增(GP-PCR)及微孔板杂交-ELISA检测法。方法：先进行GP-PCR，其中一条引物5’端标记有地高辛，探针标记有生物素，通过包被在微孔板上的亲和素预先固定；将扩增产物加入预先包被有HPV型特异寡核苷酸探针和HPV基因组混合探针的聚苯乙烯微孔板中，42℃杂交仅需20～30min；最后，用酶底物与所标记的酶进行显色反应，通过测定吸光度来判断结果。结果：本法HPV各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度比PCR-琼脂糖凝胶电泳检测高100倍，最佳杂交时间为20～30min，重复性好，CV为8.75%；60例子宫颈癌标本的总检出率为92.5%，20例正常宫颈石蜡标本本法测定均为阴性。结论：该法特异性强，灵敏度高，操作简单，无放射性和E.B.污染，杂交时间短，检测成本低，便于临床常规应用。
, 百拇医药
中图分类号：R446 文献标识码：A
文章编号：1005-8486(2000)02-0090-03
Detecting and Typing Human Papillomaviruses By PCR Enzyme-immunoassay
WEI Jun, LU Huai-sheng,WANG Bo, et al
(Center Laboratory of Ningxia Medical College,Affiliated Hospital,Yinchuan 750004)
Abstract: Objective: To develop a novel easy method of detecting and typing human papillomaviruses in clinical laboratory.Methods:This procedure involved two steps: first, general primer mediated PCR(GP-PCR) was applied successfully to detect a broad spectrum of HPV in specimens diagnosed pathologically as squamous cell carcinoma of the uterine cervix And second, in order to facilitate HPV typing, a colorimetric microplate base hybridization assay was developed. One of the primer 5' ends was labeled by digoxin and all probes were labeled by biotin. The microplate was previously covered with avidin which can bind a biotinylated HPV-probe, fix with the biotinylated HPV genomic probes mix and type specific probes respectively. Hybridization was completed in a short time and the hybridized signal was detected by ELISA-like assay. Results: This assay was a high specific, no cross-reaction was noted within all types of HPVs. The sensitivity was one hundred times higher than that of agrose-electrophic technigue. The time to hybrid was very short and it just needed 20 to 30 minutes only. The repetitiveness very well and the variability was 8.75%.Conclusion: The method seems to be of the potential for rapid, specific and sensitive HPVs examination of clinical specimens.
, 百拇医药
Key words: human papillomaviruses; GP-PCR;microplate;hybridization
目前已知，人乳头瘤病毒(HPV)与人类疾病，特别是恶性肿瘤及癌前病变密切相关[1]，其致病性与HPV型别有关。因此，HPV临床检测，特别是型别鉴定显得尤为重要，临床上有必要建立一种简便、快速、灵敏、特异的分型检测方法。
我们选用Manos等[2]设计的一对能与多型HPV退火的通用引物，自行设计了PCR-微孔板杂交-ELISA检测法，对100例子宫颈癌样本进行了HPV检测和分型，取得了良好的效果，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
HPV16型DNA由Siha细胞提取；HPV18型DNA由Hella细胞提取。dNTP和HRP标记的地高辛抗体为Boehringer Mannheim产品，Taq DNA聚合酶为Promega产品，亲和素为Sigma产品；酶标板为丹麦Nunc公司产品；DNA扩增仪为美国PE480型。临床样本共80例，40例病理诊断为低分化鳞癌的宫颈石蜡切片，20例为宫颈活检组织(病理均证实为宫颈低分化鳞癌，其中1例为重度非典型增生)，20例为正常宫颈石蜡切片。标本分别取自宁夏医学院附属医院、北京妇产医院和山东烟台毓璜顶医院。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 引物和寡核苷酸探针
引物是从HPV L1区中选择保守序列设计[2]，上游引物MY11为 5’GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3’，下游引物MY09为 5’CGTCCMARRGGAWACTGATC 3’，上游引物的5’端标记有地高辛，预期扩增片段为450bp；基因组混合探针(GP)序列选自HPV L1区中另一保守序列，可与MY11和MY09引物产生的多种HPV扩增产物杂交；基因组混合探针、16型特异(MY14)和18型特异探针 3’端均标记生物素，引物和探针均由美国Synbercen公司合成。
1.2.2 PCR模板制备
细胞株和临床标本按文献[3，4]制备，取上清5μl PCR。
, 百拇医药
1.2.3 扩增
循环参数如下：94℃，预变性5min；然后94℃，50s；55℃，50s;72℃，50s;循环30圈；最后72℃继续延伸5min。
1.2.4 杂交与显色
每孔加入100μl 杂合素(10μg/ml)，4℃过夜；PBS洗板3次；加入生物素标记的探针100μl(探针终浓度为33μmol/L)，室温作用1h，PBS洗板3次；每孔加入杂交液100μl(主要成分为含6mmol/L尿素的Tris-Hcl)，然后加入经热变性的产物10μl，42℃杂交20～30min，1×SSC洗板3次，加入酶标抗体100μl，37℃，30min，PBS洗板3次，加入TMB显色液100μl[3]室温8min，立即加入1mol/L的H2SO4 50μl终止反应，450nm下读取OD值。Cut-off值定为0.200，大于此值判断为阳性。
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2 结果
2.1 杂交特异性实验
将HPV16和18标准DNA扩增产物分别与公用混合探针、16型及18型特异探针杂交，结果表明HPV16和18型产物均能与公用混合探针杂交，但HPV16型产物仅与16型特异探针杂交，而18型产物也仅与18型特异探针杂交，两产物间无交叉反应。
2.2 杂交灵敏度实验
将一宫颈癌标本，以1∶10系列稀释后进行扩增，然后同时用琼脂糖凝胶电泳和杂交分别检测，结果电泳法为10-2，而后者为10-4。
2.3 杂交时间的优化选择
在其它条件相同时，杂交时间分别为15、30、60和120min，结果杂交时间在20～30min时信噪比最高。
, 百拇医药
2.4 重复性实验
取同一份样本，重复测定20次，结果表明：CV为8.75%。
2.5 临床样本检测
利用新建立的方法对临床80例样本进行了检测，结果见附表。
附表 80例临床样本检测结果 分 组
例数
微孔板杂交阳性
符合率
%
GP+
16+
, 百拇医药
GP+
18+
GP+
宫颈活检
20
17
3
19
95
宫颈癌切片
40
29
7
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90
正常宫颈切片
20
0
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100
3 讨论
本法首先利用通用引物对各型别的HPV感染进行扩增，再经基因组混合探针和型特异探针同时对一管产物分别杂交，这样既可快速检出已知型别，同时基因组混合探针的使用，还可发现未知新型或未知序列的其它型别的感染，这样可提高样本中HPV感染的检出。
本研究的结果表明，PCR-微板杂交-ELISA检测法具有较好的特异性和稳定性，所需时间短，杂交灵敏度明显高于PCR-琼脂糖凝胶电泳检测，这与Marcel等[5]报道的双标记微孔板杂交法的灵敏度基本相符。
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利用新建立的方法对临床80例样本检测结果表明，20例正常宫颈石蜡切片全部为阴性，与病理诊断的符合度为100%；40例病理诊断为宫颈低分化鳞癌的石蜡切片，经GP-PCR后，琼脂糖电泳和本法的检出符合率为100%，两法对HPV的检出率为90%，而活检标本检出率为95%，其中1例公用探针杂交为阳性，而型特异探针杂交为阴性，这可能系其它型别感染所致。
综上所述，PCR微孔板杂交技术是近几年出现的一种新的分子生物学检测法，可采用双探针双标记夹心杂交法，也可引物和探针双标记杂交。本法用于HPV感染检测，具有简便、快速、重复性好等优点，用于多型别的HPV检测有很高的灵敏度和特异性，临床应用前景广泛。
参考文献：
[1] Hausen H. Human Papillomaviruses and their possible role in squamous cell carcinomas[J].Current Topic Microbial Immunol, 1977,78:1
, http://www.100md.com
[2] Michael A.PCR Protocols: A guide to methods and application[M]. San Diego: Academic Press, 1990.365-36
[3] 王申五.基因诊断技术[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.103
[4] 林万朋.PCR技术操作和临床应用指南.北京：人民军医出版社，1995.35
[5] Marcel V, Adriaan JC. A non-radiation PCR enzyme-immunoassay enables a rapid identification of HPV 16 and 18 in cervical scrapes after GP5+/6+PCR[J].J Med Viral, 1996,49:223
收稿日期：1999-12-29, 百拇医药