三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的初步研究＊
作者：张日 朱子玲 仇红霞 夏学鸣
单位：张日 朱子玲 仇红霞 夏学鸣：苏州医学院附属一院，江苏省血液研究所，苏州，215006
关键词：三氧化二砷；K562细胞；凋亡
苏州医学院学报991107 摘要 目的：探讨三氧化二砷(As2O3)治疗慢性粒细胞性白血病(CML)的机制。方法：以CML细胞系 K562 为模型，通过细胞增殖、活力检测、形态学观察、肿瘤集落形成的琼脂糖凝胶电泳等检验。结果：经≥2.5μmol/L As2O3处理的K562细胞可出现增殖受抑和凋亡的形态学改变及DNA片段化。结论：As2O3能有效地诱导K562细胞凋亡。
, 百拇医药
中图法分类 R979.19
Apoptosis of K562 Cell Line Induced by Arsenic Trioxide
Zhang Ri,Zhu Ziling，Qiu Hong Xia,et al
(Jiangsu Institute of Hematology, The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou, 215006)
Abstract To explore the mechanisms of arsenic trioxide(As2O3) in treatment of chronic myelocytic leukemia(CML), K562 cell line was used as an in vitro model. The effect of As2O3 on K562 cells was observed by cell proliferation, cell viability, cell morphology,tumor colony formation and agarose gel electrophoresis assay. The results showed that As2O3 at a concentration greats or equal 2.5μmol/L could inhibit the cell proliferation and induce the apoptotic morphology and DNA fragmentation of K562 Cells. These results suggest that As2O3 can induce the apoptosis of K562 cells efficiently.
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Key words arsenic trioxide; K562 cell; apoptosis
近年，国内首先报道[1]利用三氧化二砷(Arsenic Trioxide, As2O3)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)复发，完全缓解率很高。研究[2]证明， As2O3 的作用机制主要与诱导APL细胞系NB4凋亡有关，从而引起了国内外同行的极大兴趣。然而，关于As2O3 对慢性粒细胞白血病(CML)细胞生长影响的报道尚不多见，为了探索扩大As2O3治疗谱的可能性，我们从促凋亡角度，观察了 As2O3对CML细胞系K562增殖的影响。
1 材料与方法
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1.1 主要试剂：两种 As2O3分别购自Sigma公司和哈尔滨医科大学；胎牛血清(FCS)和 RPMI1640 及 IMDM 培养基购自Gibco/BRL公司，蛋白酶、RNA酶购自Promega公司。
1.2 细胞增殖功能检测及形态学观察：人类CML细胞系K562为本所保存，生长于含10%FCS的RPMI1640培养基中，每周传代2次；收集对数生长期细胞，更换培养液并加入不同浓度及来源的 As2O3，按1×105/ml细胞数，在37℃、5%CO2条件下培养，每天采集细胞进行0.2%台盼兰染色，阳性细胞判为坏死细胞，然后根据活细胞数目按下列公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组细胞数-实验细胞数)/对照组细胞数×100%。为了避免细胞密度过高对增殖的抑制效应，每天根据细胞数加入新鲜培养基及相应浓度的 As2O3，以维持细胞数目≤5×105/ml。在计数细胞的同时，取500个细胞在离心涂片机上，按 500r/min 离心 5min, 待片干后，行Wright 染色观察细胞形态。
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1.3 肿瘤集落形成检测：将K562细胞按1×104/ml与 同浓度的 As2O3及含终浓度为20%FCS和1.1%甲基纤维素的IMDM培养基充分混匀，浇注于直径35mm的塑料培养皿中，每皿1ml，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养 7d，倒置显微镜下计数≥40个细胞组成的集落数。为求结果精确，每实验点均同时设立3皿，求均数作为结果。
1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳分析：收集1×107未经或经As2O3处理的K562细胞，用4℃保存的1×PBS洗 2 次，离心后加入2ml细胞裂解液，细胞裂解液由50mmol/L Tris—HCl(pH=8.0)，20mmol/L EDTA,2% SDS和0.01%蛋白酶K组成，与裂解液混匀的细胞在37℃水浴 18h， 加入0.8ml饱和NaCl溶液后，冰浴 5min，然后经3000r/min离心 1h，取上清液按20mg/L浓度加入RNA酶，37°C 15min 培养后，用2倍体积的无水乙醇-20°C过夜沉淀，最后将所获的DNA在1.25%琼脂糖凝胶中电泳 1h 左右，紫外灯下观察照相。
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2 结果
2.1 As2O3对K562细胞增殖及形态学的影响：我们发现，与阴性对照组相比，经2.5μmol/L As2O3处理 48h 的K562细胞，其增殖抑制率达到50%以上，从形态学角度观察，此时的细胞即开始逐渐表现为体积变小，细胞核固缩，染色质浓聚成块并分布于核膜周边，胞浆出现空泡和细胞膜皱缩、凹陷等典型的凋亡形态学改变。同时发现，这种增殖抑制现象具有剂量与时间依赖性，即随着As2O3浓度的增高与培养时间的延长，抑制率也相应增大，在5μmol/L As2O3处理 4d 后，其增殖抑制率可达91%(见附图)；我们未观察到两种As2O3对K562细胞的增殖抑制有明显差异。
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附图 As2O3对K562细胞增殖的影响
2.2 As2O3对肿瘤集落形成的影响：与不加As2O3的阴性对照组比较，K562细胞经半固体培养 7d 后形成的肿瘤集落数目随着所加的As2O3的浓度增高而减少。当培养体系中所加的As2O3浓度分别为0.5，1，2.5，5μmol/L时，其对应的集落形成抑制率则为14.6%，37.2%，67.2%和99.1%。
2.3 DNA凝胶电泳改变：实验前，我们检测了用于该实验的细胞台盼兰拒染率均在90%以上。电泳结果可见，K562细胞经≥2.5μmol/L的As2O3培养36～48h，其DNA电泳凝胶上可见清晰的梯状条带，其第一条带的DNA大小约为200bp,依次倍增，说明在核小体连接处的DNA能被As2O3随机切断，形成寡聚核小体；而未经As2O3处理的K562细胞则无上述改变。当所用As2O3浓度为1μmol/L或虽为2.5μmol/L，但培养时间仅24h，亦未显示梯状DNA条带。
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3 讨论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，与细胞坏死不同，它是一种主动的、基因导向的细胞自杀机制，并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为了更好地适应生存环境而主动采取的一种有序的细胞死亡过程。作为源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，CML白血病细胞主要是由于Ph染色体异常，导致在CML发病过程中起关键作用的bcr/abl融合基因的形成。近来的研究证实，存在于K562细胞中的bcr/abl融合基因，可编码一种分子量为210kd的bcr/abl融合蛋白(P210)，该蛋白具有明显增高的酪氨酸激酶(PTK)活性，通过信号传导活化胞内Ras，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和Jak-STAT(信号传导物与转录激活物)等多种信号途径，使细胞过度增殖，同时也造成CML白血病细胞对多种化疗药物产生耐药；此外，bcr/abl融合蛋白能通过细胞生存基因Bcl-xL而非Bcl-2的过表达，以及阻断细胞色素C从线粒体的释放，从而使细胞内能诱导凋亡的半胱氨酸蛋白酶家族成员-3(Caspase-3)不能活化，导致凋亡受抑，从而形成白血病细胞在体内大量累积[3～5]。
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上世纪初，国外有人用1%亚砷酸钾(Fowler液)治疗CML，国内也早有用含砷中药如雄黄、砒霜治疗CML获效的报道。孙鸿德等[1]介绍含As2O3的癌灵Ⅰ号对APL有显著疗效。陈竺等[2]则证明了As2O3对APL的作用机制与促凋亡有关。我们经多次重复实验证明，K562细胞经≥2.5μmol/L的As2O3处理 48h，即可表现出显著的增殖抑制效应，此时的细胞尽管尚保存完整的膜结构，但形态学上已开始出现程序性细胞死亡的特征性改变，这种改变随着培养时间的延长而更为明显。体外肿瘤集落形成检测亦显示，As2O3可抑制K562细胞形成集落，抑制率与As2O3之间有剂量依赖性。染色体基因组的片段化是细胞凋亡最重要的特征之一，琼脂糖凝胶电泳是DNA片段化的常规技术，我们经DNA电泳证明，K562细胞经≥2.5μmol/L的As2O3处理36～48h，可获得典型的DNA阶梯状条带，结果提示，As2O3抑制K562细胞生长与其促凋亡有关。最近，肖冬梅等[6]报道，As2O3能使K562细胞内的bcr/abl蛋白PTK活性降低，蛋白酪氨酸磷酸化减少，根据他们的结果，结合我们的工作，我们推测As2O3诱导K562细胞凋亡的生化与分子机制，可能在于As2O3能与细胞内含巯基蛋白尤其是bcr/abl蛋白结合，进而降低了蛋白PTK活性与酪氨酸磷酸化水平，使之一方面阻断了bcr/abl蛋白的信号传导，另一方面也促进了细胞色素C的释放，使Caspase-3得以活化，进而激活了DNA片段化因子，最终使K562细胞进入凋亡状态[4～6]。
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陈竺等[2]发现，APL的NB4细胞经1μmol/L As2O3处理 24h 即可出现凋亡现象，而我们的结果表明，诱导K562细胞所需的As2O3不仅浓度要高于前者，而且时间相对延长，这是否与不同细胞系生物学特性有别及促凋亡途径和分子机制不同有关，有待进一步研究。
* 苏州医学院附属一院青年骨干基金资助课题
参考文献
1 孙鸿德，等.癌灵Ⅰ号结合中医辨证治疗急性早幼粒白血病32例.中国中西医结合杂志，1992，12∶170
2 Chen GQ,et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR α/PML proteins. Blood,1996, 88∶1052
, http://www.100md.com
3 Cortez D,et al. The Bcr-Abl tyrosine kinase inhibits apoptosis by activating a RAS-dependent signaling pathway. Oncogene,1996,13∶2589
4 Tauchi T, et al. Bcr/Abl signal transduction.Int J Hematol,1995,61∶105
5 Amarante-Mendes GP,et al.Bcr-Abl exerts its antiapoptotic effect against diverse apoptotic stimuli through blockage of mitochondrial release of cytochrome C and activation of caspase-3.Blood,1998,91∶1700
6 肖冬梅,等.As2O3诱导 K562细胞凋亡过程中酪氨酸蛋白激酶活性的变化.中华血液学杂志，1998，5∶234
(1999年7月8日收稿), 百拇医药
单位：张日 朱子玲 仇红霞 夏学鸣：苏州医学院附属一院，江苏省血液研究所，苏州，215006
关键词：三氧化二砷；K562细胞；凋亡
苏州医学院学报991107 摘要 目的：探讨三氧化二砷(As2O3)治疗慢性粒细胞性白血病(CML)的机制。方法：以CML细胞系 K562 为模型，通过细胞增殖、活力检测、形态学观察、肿瘤集落形成的琼脂糖凝胶电泳等检验。结果：经≥2.5μmol/L As2O3处理的K562细胞可出现增殖受抑和凋亡的形态学改变及DNA片段化。结论：As2O3能有效地诱导K562细胞凋亡。
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中图法分类 R979.19
Apoptosis of K562 Cell Line Induced by Arsenic Trioxide
Zhang Ri,Zhu Ziling，Qiu Hong Xia,et al
(Jiangsu Institute of Hematology, The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou, 215006)
Abstract To explore the mechanisms of arsenic trioxide(As2O3) in treatment of chronic myelocytic leukemia(CML), K562 cell line was used as an in vitro model. The effect of As2O3 on K562 cells was observed by cell proliferation, cell viability, cell morphology,tumor colony formation and agarose gel electrophoresis assay. The results showed that As2O3 at a concentration greats or equal 2.5μmol/L could inhibit the cell proliferation and induce the apoptotic morphology and DNA fragmentation of K562 Cells. These results suggest that As2O3 can induce the apoptosis of K562 cells efficiently.
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Key words arsenic trioxide; K562 cell; apoptosis
近年，国内首先报道[1]利用三氧化二砷(Arsenic Trioxide, As2O3)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)复发，完全缓解率很高。研究[2]证明， As2O3 的作用机制主要与诱导APL细胞系NB4凋亡有关，从而引起了国内外同行的极大兴趣。然而，关于As2O3 对慢性粒细胞白血病(CML)细胞生长影响的报道尚不多见，为了探索扩大As2O3治疗谱的可能性，我们从促凋亡角度，观察了 As2O3对CML细胞系K562增殖的影响。
1 材料与方法
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1.1 主要试剂：两种 As2O3分别购自Sigma公司和哈尔滨医科大学；胎牛血清(FCS)和 RPMI1640 及 IMDM 培养基购自Gibco/BRL公司，蛋白酶、RNA酶购自Promega公司。
1.2 细胞增殖功能检测及形态学观察：人类CML细胞系K562为本所保存，生长于含10%FCS的RPMI1640培养基中，每周传代2次；收集对数生长期细胞，更换培养液并加入不同浓度及来源的 As2O3，按1×105/ml细胞数，在37℃、5%CO2条件下培养，每天采集细胞进行0.2%台盼兰染色，阳性细胞判为坏死细胞，然后根据活细胞数目按下列公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组细胞数-实验细胞数)/对照组细胞数×100%。为了避免细胞密度过高对增殖的抑制效应，每天根据细胞数加入新鲜培养基及相应浓度的 As2O3，以维持细胞数目≤5×105/ml。在计数细胞的同时，取500个细胞在离心涂片机上，按 500r/min 离心 5min, 待片干后，行Wright 染色观察细胞形态。
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1.3 肿瘤集落形成检测：将K562细胞按1×104/ml与 同浓度的 As2O3及含终浓度为20%FCS和1.1%甲基纤维素的IMDM培养基充分混匀，浇注于直径35mm的塑料培养皿中，每皿1ml，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养 7d，倒置显微镜下计数≥40个细胞组成的集落数。为求结果精确，每实验点均同时设立3皿，求均数作为结果。
1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳分析：收集1×107未经或经As2O3处理的K562细胞，用4℃保存的1×PBS洗 2 次，离心后加入2ml细胞裂解液，细胞裂解液由50mmol/L Tris—HCl(pH=8.0)，20mmol/L EDTA,2% SDS和0.01%蛋白酶K组成，与裂解液混匀的细胞在37℃水浴 18h， 加入0.8ml饱和NaCl溶液后，冰浴 5min，然后经3000r/min离心 1h，取上清液按20mg/L浓度加入RNA酶，37°C 15min 培养后，用2倍体积的无水乙醇-20°C过夜沉淀，最后将所获的DNA在1.25%琼脂糖凝胶中电泳 1h 左右，紫外灯下观察照相。
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2 结果
2.1 As2O3对K562细胞增殖及形态学的影响：我们发现，与阴性对照组相比，经2.5μmol/L As2O3处理 48h 的K562细胞，其增殖抑制率达到50%以上，从形态学角度观察，此时的细胞即开始逐渐表现为体积变小，细胞核固缩，染色质浓聚成块并分布于核膜周边，胞浆出现空泡和细胞膜皱缩、凹陷等典型的凋亡形态学改变。同时发现，这种增殖抑制现象具有剂量与时间依赖性，即随着As2O3浓度的增高与培养时间的延长，抑制率也相应增大，在5μmol/L As2O3处理 4d 后，其增殖抑制率可达91%(见附图)；我们未观察到两种As2O3对K562细胞的增殖抑制有明显差异。
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附图 As2O3对K562细胞增殖的影响
2.2 As2O3对肿瘤集落形成的影响：与不加As2O3的阴性对照组比较，K562细胞经半固体培养 7d 后形成的肿瘤集落数目随着所加的As2O3的浓度增高而减少。当培养体系中所加的As2O3浓度分别为0.5，1，2.5，5μmol/L时，其对应的集落形成抑制率则为14.6%，37.2%，67.2%和99.1%。
2.3 DNA凝胶电泳改变：实验前，我们检测了用于该实验的细胞台盼兰拒染率均在90%以上。电泳结果可见，K562细胞经≥2.5μmol/L的As2O3培养36～48h，其DNA电泳凝胶上可见清晰的梯状条带，其第一条带的DNA大小约为200bp,依次倍增，说明在核小体连接处的DNA能被As2O3随机切断，形成寡聚核小体；而未经As2O3处理的K562细胞则无上述改变。当所用As2O3浓度为1μmol/L或虽为2.5μmol/L，但培养时间仅24h，亦未显示梯状DNA条带。
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3 讨论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，与细胞坏死不同，它是一种主动的、基因导向的细胞自杀机制，并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为了更好地适应生存环境而主动采取的一种有序的细胞死亡过程。作为源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，CML白血病细胞主要是由于Ph染色体异常，导致在CML发病过程中起关键作用的bcr/abl融合基因的形成。近来的研究证实，存在于K562细胞中的bcr/abl融合基因，可编码一种分子量为210kd的bcr/abl融合蛋白(P210)，该蛋白具有明显增高的酪氨酸激酶(PTK)活性，通过信号传导活化胞内Ras，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和Jak-STAT(信号传导物与转录激活物)等多种信号途径，使细胞过度增殖，同时也造成CML白血病细胞对多种化疗药物产生耐药；此外，bcr/abl融合蛋白能通过细胞生存基因Bcl-xL而非Bcl-2的过表达，以及阻断细胞色素C从线粒体的释放，从而使细胞内能诱导凋亡的半胱氨酸蛋白酶家族成员-3(Caspase-3)不能活化，导致凋亡受抑，从而形成白血病细胞在体内大量累积[3～5]。
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上世纪初，国外有人用1%亚砷酸钾(Fowler液)治疗CML，国内也早有用含砷中药如雄黄、砒霜治疗CML获效的报道。孙鸿德等[1]介绍含As2O3的癌灵Ⅰ号对APL有显著疗效。陈竺等[2]则证明了As2O3对APL的作用机制与促凋亡有关。我们经多次重复实验证明，K562细胞经≥2.5μmol/L的As2O3处理 48h，即可表现出显著的增殖抑制效应，此时的细胞尽管尚保存完整的膜结构，但形态学上已开始出现程序性细胞死亡的特征性改变，这种改变随着培养时间的延长而更为明显。体外肿瘤集落形成检测亦显示，As2O3可抑制K562细胞形成集落，抑制率与As2O3之间有剂量依赖性。染色体基因组的片段化是细胞凋亡最重要的特征之一，琼脂糖凝胶电泳是DNA片段化的常规技术，我们经DNA电泳证明，K562细胞经≥2.5μmol/L的As2O3处理36～48h，可获得典型的DNA阶梯状条带，结果提示，As2O3抑制K562细胞生长与其促凋亡有关。最近，肖冬梅等[6]报道，As2O3能使K562细胞内的bcr/abl蛋白PTK活性降低，蛋白酪氨酸磷酸化减少，根据他们的结果，结合我们的工作，我们推测As2O3诱导K562细胞凋亡的生化与分子机制，可能在于As2O3能与细胞内含巯基蛋白尤其是bcr/abl蛋白结合，进而降低了蛋白PTK活性与酪氨酸磷酸化水平，使之一方面阻断了bcr/abl蛋白的信号传导，另一方面也促进了细胞色素C的释放，使Caspase-3得以活化，进而激活了DNA片段化因子，最终使K562细胞进入凋亡状态[4～6]。
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陈竺等[2]发现，APL的NB4细胞经1μmol/L As2O3处理 24h 即可出现凋亡现象，而我们的结果表明，诱导K562细胞所需的As2O3不仅浓度要高于前者，而且时间相对延长，这是否与不同细胞系生物学特性有别及促凋亡途径和分子机制不同有关，有待进一步研究。
* 苏州医学院附属一院青年骨干基金资助课题
参考文献
1 孙鸿德，等.癌灵Ⅰ号结合中医辨证治疗急性早幼粒白血病32例.中国中西医结合杂志，1992，12∶170
2 Chen GQ,et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR α/PML proteins. Blood,1996, 88∶1052
, http://www.100md.com
3 Cortez D,et al. The Bcr-Abl tyrosine kinase inhibits apoptosis by activating a RAS-dependent signaling pathway. Oncogene,1996,13∶2589
4 Tauchi T, et al. Bcr/Abl signal transduction.Int J Hematol,1995,61∶105
5 Amarante-Mendes GP,et al.Bcr-Abl exerts its antiapoptotic effect against diverse apoptotic stimuli through blockage of mitochondrial release of cytochrome C and activation of caspase-3.Blood,1998,91∶1700
6 肖冬梅,等.As2O3诱导 K562细胞凋亡过程中酪氨酸蛋白激酶活性的变化.中华血液学杂志，1998，5∶234
(1999年7月8日收稿), 百拇医药