体检发现谷丙转氨酶升高人群中检出TT病毒
作者：彭晓谋 高志良 陈雪娟 卢建溪 周元平 黄仰苏 姚集鲁
单位：中山医科大学附属第三医院传染科； 广州， 510630
关键词：肝炎，病毒性，人；病因学；丙氨酸转氨酶；血液；TT病毒
中山医科大学学报990119 摘 要 目的：了解新型肝炎病毒—TT病毒在中国的流行情况，探讨其核酸变异性。方法：收集19例健康体检发现谷丙转氨酶升高者的血清标本，采用PCR方法检测TT病毒的DNA。所得PCR产物再采用限制性片段长度多态性分析和DNA序列分析方法进行验证。最后将测序结果与GenBank中的一些分离株进行比较，分析它们的同源性。结果：19例转氨酶升高者中，2例PCR检测呈阳性反应，其产物经限制性片段长度多态性分析证实为特异性产物。DNA序列分析显示，2个阳性产物间的核酸同源性为98.7%，与Takahashi等分离株和Okamoto等分离株相比，同源性分别为98.7%和89.2%。两个TTV DNA片段中均存在精氨酸取代丝氨酸变异。结论：在中国广东人群中存在TT病毒感染，其核酸序列与Takahashi等在日本得到的分离株高度同源。因而，设计PCR引物时宜选择Takahashi等分离株为标准。精氨酸取代丝氨酸变异的意义需进一步研究。
中图号 R 512.6
TT Virus Were Detected in Persons with Elevated Alanine
Aminotransferase Found During Routine Medical Check Up
Peng Xiaomou Gao Zhiliang Chen Xuejuan Lu Jianxi Zhou Yuanping Huang Yangsu Yao Jilu
(Department of Viral Hepatitis Research, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)
Abstract Objective: To investigate the incidence of a new hepatitis virus (TT virus) infection in Guangdong, China, and analyze its nucleic acid variance. Methods: PCR was used in the detection of TTV DNA in 19 serum samples from elevated alanine aminotransferase persons in their routien medical check up. PCR products were confirmed by RFLP and DNA sequencing. Nucleotide sequence homology was analyzed by comparison with major isolates from GenBank. Results: TTV DNA was detected in 2 out of 19 cases by PCR. PCR products were verified to be specific. DNA sequencing showed that the homology rate of these 2 fragments was up to 98.7%. When compared with Takahashi's isolates and Okamoto's isolate, the homology rates were 98.7% and 89.2% respectively. A unique amino acid replacement of serine by arginine was found in both fragments. Conclusions: There were TTV infections in Chinese population . In China these viruses share high homology with Takahaski’s strains which might be good standards for primer designation. The significance of the unique replacement of amino acid remained to be studied.
Subject headings hepatitis, viral, human/etiology; alanine aminotransferase/blood; TT virus
HCV和戊型肝炎病毒(HEV)发现以来，大部分未定型肝炎的病因逐渐明确。但仍约有10%肝炎患者病因不明[1，2]。近来又发现了庚型肝炎病毒(HGV)，但HGV的致病不强，且仅在极少数原因不明肝炎中检出[3，4]。因而，仍然存在许多肝炎病毒血清标志全部阴性的肝炎患者，即所谓的非甲到庚型肝炎(Non A to G hepatitis, NA-G)。因此，寻找新型肝炎病毒是当前肝炎研究中的重要课题之一。近来日本学者采用差式文库的分子生物学方法从1例输血后NA-G肝炎患者血清中分离出500 bp的DNA片段。并根据患者的名称命名为TT病毒(TTV)[5]。这种病毒能引起谷丙转氨酶(ALT)的轻度升高。本研究收集健康体检发现ALT轻度升高者的血清标本，采用聚合酶链反应(PCR)方法检测TTV DNA，探讨这种新型肝炎病毒在中国广东的流行情况和分析其核酸水平的变异性。
1 材料与方法
1.1 病 例
660名健康体检者为广东省玻璃厂职工。常规空腹采静脉血，收集血清进行谷丙转氨酶(ALT)、HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc检测。共检出19例ALT异常患者(>1 166.9 nmol/S)。
1.2 方 法
1.2.1 PCR检测TTV DNA 血清中TTV DNA检测采用常规热变性法制备裂解上清，以5′-GCAGC AGCAT ATGGA TATGT-3′(TTV1，正义)和5′-TGACT GTGCT AAAGC CTCTA-3′(TTV2，反义)为外引物进行第1次扩增，产物为270 bp。第1次产物再以5′-CATAC ACATG AATGC CAGGC-3′(TTV 3，正义)和5′-GTACT TCTTG CTGGT GAAAT-3′(TTV 4，反义)为内引物进行第2次扩增，产物为197 bp。ρ=0.02琼脂糖凝胶电泳分析结果。
1.2.2 PCR产物的限制性片段长度多态性分析 197 bp的PCR产物中存在1个限制性内切酶KpnⅠ的位点。消化的片段分别为169 bp和28 bp。50 μL PCR产物凝胶过滤去除剩余引物，常规采用氯仿抽提和乙醇沉淀后，沉淀溶于9 μL双蒸水中，加1 μL 10×缓冲液，2 U Kpn I，于37 ℃消化1 h，ρ=0.02琼脂糖凝胶电泳分析结果。
1.2.3 PCR产物的DNA序列分析 TTV DNA阳性的142和667号标本的产物，经低融点琼脂糖凝胶纯化后，在达安基因诊断中心的全自动序列分析仪上进行DNA序列分析。
1.2.4 其他肝炎病毒血清标志检测 抗-HAV采用中山生物工程公司试剂进行检测，血清HBV标志和抗-HCV采用美国Abbott试剂进行检测，抗-HEV和抗-HGV采用新加坡Genelabs公司试剂进行检测。
2 结 果
2.1 血清中TTV DNA
巢式PCR检测单项ALT升高标本中TTV DNA的结果和RFLP分析结果分别见图1和图2。阳性产物的碱基数与设计相符。所有阳性PCR产物经限制性内切酶消化后所得DNA片段与期望大小一致。
图1 PCR检测血清中TTV DNA的产物分析
Fig.1 Product analysisi of TTV DNA detection
from serum by PCR
Lane 1 was 100 bp ladder from GIBco BRL, USA, lane 2, 4, 5, were positive, lane 3 was negative
图2 RFLP分析PCR产物
Fig.2 RFLP analysis of PCR products
Lane 1 was PCR product digested with Kpn I, lane 2 were undigested control, lane 3 was 100 bp ladder from GIBco BRL
2.2 PCR产物序列分析
142和667号标本DNA序列分析结果和与GenBank中主要序列比较结果见图3。DNA序列同源性分析结果见表1。
2.3 氨基酸序列的比较分析
相应氨基酸序列比较分析见图4。
2.4 其他肝炎病毒感染的情况
19例ALT升高者中，根据病毒性肝炎防治方案(1995年)，9例诊断为乙型病毒性肝炎，1例为甲型肝炎和1例为丙型肝炎，8例原因不明。2例TTV DNA阳性者均为HBsAg阳性。
图3 TTV DNA 142和667片段与GenBank中主要分离株DNA序列的比较分析
Fig.3 Comparison of DNA sequences of fragment 142 and 667 with major isolates from GenBank
图4 TTV DNA 142和667片段与GenBank中主要分离株氨基酸序列的比较分析
Fig.4 Comparison of amino acid sequences of fragment 142 and 667 with major isolates from GenBank
表1 142和667片段与GenBank中主要分离株的核苷
酸序列同源性分析
Table 1 Comparison of nucleotide sequence homology of
fragment 142 and 667 with major isolates from GenBank (%)
TTV142
TTV667
AB008394
AB011494
TTV142
TTV667
98.7
AB008394
89.2
89.2
AB011494
98.7
87.5
89.2
AB011493
98.7
97.5
89.2
100
3 讨 论
最近日本学者Nishizawa等采用差式文库方法从输血后Non-A to G肝炎患者的血清中分离出病毒克隆N 22，并证实其来源于DNA病毒的基因组，因而根据病人的姓名命名为TTV。根据TTV DNA序列设计引物进行PCR检查发现，5例输血后Non-A to G肝炎患者中，3例为阳性，且TTV DNA水平与血清转氨酶的水平相关。平均于输血后6～8周开始检出，持续约5～8周，其中1例6周开始检出，观察至21周时仍为阳性[5]。
本研究显示，在中国广东一工厂健康体检发现的19例ALT升高者中，有2例成功扩增出TTV DNA的片段。进一步分析显示从这2例扩增出来的DNA片段其序列高度同源，同源性达98.2%。目前GenBank中保存的TTV DNA序列中根据同源性不同主要有Takahashi等的AB 011494和AB 011493，以及Okamoto等的AB 008394两个主要类型，两者的同源性仅为89.2%。中国广东检出的TTV DNA片段与AB 011494和AB 011493高度同源，同源性为98.7%。而与AB 008394相比，同源性仅为89.2%。提示中国广东流行的TTV可能在基因型方法与Takahashi等的分离株相近。因而，在中国设计TTV的PCR引物时宜以Takahashi等分离株为标准。然而，仍存在2个碱基上的细微差别。其中，一个碱基变异导致密码子错义，出现精氨酸取代丝氨酸。这种差异的意义需进一步研究。
在健康体检人群中常可检出一些无症状ALT升高者，其中部分原因不明。本研究显示，HBV感染是健康体检人群中ALT升高的主要原因。2例TTV DNA阳性的ALT升高者均重叠HBV现症感染。因而，TTV的致病性可能较弱或需要其他因素协同致病。
广东省自然科学基金(970079)资助课题
参考文献
1 Shiffman M L, Luktic V A, Sanyal A J, et al. Hepatic lidocaine metabolism and liver histology in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Hepatol, 1994, 19(4):933
2 Czaja A J, Carpenter H A, Santrach P J, et al. The nature and prognosis of severe cryptogenic chronic active hepatitis. Gastroenterol, 1993, 104(6):1755
3 Karayiannis P, Brind A M, Pichering J, et al. Hepatitis G virus does not cause significant liver disease after liver transplantiation. J Viral Hepat, 1998, 5(1):35
4 Guilera M, Saiz J C, Lopez L F X, et al. Hepatitis G virus infection in chronic liver disease. Gut, 1998, 42(1):107
5 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophy Res Com, 1997, 241(1):92
(1998 - 06 - 19收稿 1998 - 09 - 15修回)