食管癌中P16蛋白和Rb蛋白的表达及其意义
作者：吴晓华 徐小虎 祝家镇 沈忠英
单位：吴晓华 祝家镇 中山医科大学法医系法医病理教研室； 广州， 510089 ；徐小虎 汕头大学医学院法医研究所；沈忠英 汕头大学医学院病理教研室； 汕头， 515031
关键词：食管肿瘤；视网膜母细胞瘤蛋白质；蛋白质P16
中山医科大学学报/990306
摘要 目的：探讨P16和Rb两种基因所表达的蛋白在食管癌形成中的作用。方法：采用免疫组化法对50例粤东地区食管癌进行检测。结果：在50例食管鳞癌标本中，10例表现P16蛋白阳性，38例表现为Rb蛋白阳性。在38例Rb蛋白阳性病例中，有31例P16蛋白阴性，另有5例呈现P16蛋白低表达。17例Ⅰ级食管鳞癌均表达Rb蛋白，28例Ⅱ级食管鳞癌中有19例Rb蛋白表达阳性，5例Ⅲ级食管鳞癌中有2例表达Rb蛋白。结论：P16蛋白在食管癌中的异常是一经常发生的事件，P16蛋白的表达与Rb蛋白的表达之间存在明显的负相关，P16蛋白的异常在不同地区之间可能存在差异；Rb蛋白的表达与食管癌的分化程度相关，即分化越好，Rb蛋白表达率越高。细胞周期调控的Rb路径异常，可能参与食管癌的形成。
, http://www.100md.com
中图号 R 735.1
The Expression of Protein of P16 and Rb in Esophageal Cancer
Wu Xiaohua1,2 Xu Xiaohu2 Zhu Jiazhen1 Shen Zhongying3
( 1 Department of Forensic Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089
2 Research Institute of Forensic Medicine, Shantou University Medical College, Shantou,3 Department to Pathology, Shantou University Medical College, Shantou, 515031)
, 百拇医药
Abstract Objective:To explore the role of protein of P16 and Rb genes in the carcinogenesis in human esophageal cancer. Method:50 cases of esophageal squamous cell carcinoma(ESC) from east Guangdong were selected and immunohistochemistry method was applied. Results: The results show that 10 of 50 express P16 and 38 of 50 express Rb. No expression of P16 could be found in 31 of 38 Rb positive cases.5 showed low expression of P16. 17 of 17 grade Ⅰ esophageal squanous-cell carcinoma expressed Rb. 19 of 28 grade Ⅱ ESC were Rb positive. 2 of 5 grade Ⅲ ESC showed Rb expression. Conclusions: Results suggest that abnormality of P16 in ESC is a common event. Inactivations of P16 and Rb are inversely correlated in ESC. Abnormality of P16 may various among different area. Rb expression could be related to the differentiation of ESC. Abnormality of P16 and Rb in the regulatory pathway of cell cycle may be involved in the carcinogenesis of ESC.
, 百拇医药
Subject headings esophageal neoplasms; protein P16; retinoblastoma protein
肿瘤的形成是一个非常复杂的生物学过程，许多人类肿瘤都以一种或多种细胞周期调控基因的异常为其部分特征，这些包括Rb、P53、P16和Cyclin D1。P16蛋白是周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinases 4,CDK4)和CDK6的特异抑制子，CDK4和CDK6参与Cyclin D1依赖性的Rb磷酸化[1]，有证据提示，P16是一个肿瘤抑制基因。首先，其基因定位于染色体9p21，该区域在多种人肿瘤中出现异常[2]。其次，P16在Rb保持野生型的肿瘤中常表现缺失、突变或高甲基化及转录静止，而且P16在这些细胞中以高水平异位表达(ectopic expression)时可导致G1期终止。第三，P16缺陷小鼠对一些致癌因素敏感，在人肿瘤中P16的种系突变与恶性黑色素瘤和胰腺癌的家族综合征相关[3]。Rb和其它Rb样蛋白(p130，p107)控制着由杂二聚体转录调节子(heterodimeric transcription regulator)介导的基因表达，总称为E2Fs，它们可反式激活那些基因产物对进入S期非常重要的基因，Rb蛋白以其去磷酸化形式与E2F复合体的亚群结合，并将其转变为抑制E2F靶基因表达的抑制子。Rb蛋白的磷酸化使这些E2Fs游离，使它们能反式激活同样的基因，这是一个最初由周期素依赖性激酶触发而后由Cyclin E-CDK2复合体改变的过程[4]。
, 百拇医药
食管癌(esophageal cancer)在我国是高发癌，其死亡率在肿瘤死亡中处于第二位，已有报道P16和Rb在食管癌中有改变，粤东地区作为食管癌高发区，有必要对P16和Rb在食管癌中的表达情况作一研究，以探讨它们在食管癌发生中的作用和意义。为此，我们从粤东地区选择了50例食管鳞状上皮癌进行P16蛋白和Rb蛋白的免疫组化观察。
1 材料与方法
1.1 标本来源
50例食管鳞状上皮癌标本选自汕头大学医学院病理教研室1996～1997年活检存档蜡块，病例来源均为粤东沿海地区(食管癌高发区)，其中Ⅰ级17例，Ⅱ级28例，Ⅲ级5例，有淋巴结转移者30例，无转移者20例，取10例正常食管粘膜作为对照。
1.2 试 剂
, 百拇医药 鼠抗人P16单克隆抗体(Ab-2，克隆号ZJ11)、Rb单克隆抗体(Ab-1，克隆号1F8)均购自美国NEOMARKERS公司，免疫组化试剂盒Ultravision Detection System Polyvalent(抗鼠和兔，HRP/DAB)购自美国LAB Vision Corporation。
1.3 免疫组化染色
按试剂盒提供的方法进行，用DAB显色，一抗的效价分别为P16 1∶100、Rb 1∶200。阴性对照用PBS替代，阳性对照采用中山医科大学病理教研室已知为P16、Rb阳性的骨肉瘤切片，阳性染色为棕褐色，阳性结果的判别采用双盲性，根据阳性细胞所占面积分为4个等级(-、+、+ +、+ + +)，“-”为无明显阳性反应细胞，“+”阳性细胞的面积小于25%，“+ +”阳性细胞的面积在25%～75%之间，“+ + +”阳性细胞的面积大于75%。
2 结果
, 百拇医药
2.1 P16蛋白在正常食管及食管鳞状上皮癌中的表达
正常食管粘膜上皮细胞中可见部分细胞表达P16蛋白，主要分布于基底层，棘细胞层亦可见P16蛋白少量的表达。在50例食管鳞状上皮癌中仅见10例为P16蛋白阳性，其中弱阳性(+)者(图2)为5例，中等～强阳性(+ +～+ + +)者5例，阳性部位主要位于胞核(图2)，亦可见胞浆者(图1)，P16蛋白阴性40例。
图1 食管鳞状上皮癌(Ⅱ级).p16阳性，可见癌巢中癌细胞胞浆着色，免疫组化柒鱼，100 ×
Fig. 1 Esophageal squamous cell carcinoma (gradeⅡ). P16 positive reactivity can be seen in the cytop1asm of tumor ceI1s。 1mmuno- histochemical staining. 1 00 ×
, 百拇医药
图2 食管鳞状上皮癌(Ⅱ级)，P16阳性，可见癌巢中癌细胞核呈弱阳性表达，免瘦组化染色，100×
Fig. 2 Esophageal squamous cell carcinoma (grade Ⅱ). P16 shows weak reactivity in the nuclus of tumor cel1s， 1mmunohistochemical staining. 100 ×
2.2 Rb蛋白在正常食管及食管鳞状上皮癌中的表达
Rb蛋白阳性部位位于胞核，为浅至深棕褐色颗粒。在正常食管鳞状上皮Rb蛋白的表达与P16蛋白类似，主要分布于基底细胞层和棘细胞层，表达水平亦较低。在食管鳞状上皮癌中，38例Rb蛋白阳性，其中弱阳性者(+)8例，中等～强阳性者(图4)30例，Rb蛋白阴性12例，某些病例癌巢中核强阳性细胞清晰可见，且阳性细胞主要靠近癌巢周边，癌巢中央细胞弱阳性或不着色(图3)。经与上述10例P16蛋白阳性病例进行比较，4例Rb蛋白弱阳性和3例Rb蛋白阴性者呈现P16蛋白的表达，另有3例呈中等～强Rb蛋白阳性者有P16蛋白表达。在38例Rb蛋白阳性病例中，有31例不表达P16蛋白。
, 百拇医药
图3 食营鳞状上皮癌(Ⅰ级)，癌巢中核强阳性细胞清晰可见， rett细胞主要靠近癌巢周边，癌巢中央细胞，弱阳性或不着色，R6免疫组化 柒色，100×
Fig. 3 Esophageal squamous cell carcinoma (grade I). EXtensive nuclear positive ceIls present in the nest clear1y. positive cells are mainly locate near the boundary of nest while ceIls in the center show weak reactivity. Rb immunohistochemical stalning. 100 ×
图4 食管鳞状上皮癌(Ⅱ级)，癌巢中大量Rb阳性细胞，阳性部位位于核内，免疫组化染鱼，100 ×
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Fig.4 Esophageal squamous cell carcinoma (grade Ⅱ). A large amount Of Rb positive ceIls can be seen in nestS。 The positive reactivity was located in nuclus. lmmunohistochemical staining. 1 00×
2.3 P16蛋白和Rb蛋白在不同级别和转移状态的食管癌中的表达
结果见表1及表2。
表1 P16、Rb蛋白在不同级别食管鳞状上皮癌中的表达
Table 1 Expression of P16 and Rb in different grade ofESC (50 cases) Grade
, 百拇医药
Cases
(n)
Positive cases
P16
Rb
Ⅰ
17
3
17
Ⅱ
28
7
19
, 百拇医药
Ⅲ
5
0
2
Total
50
10
38
表2 P16、Rb蛋白的表达与食管鳞状上皮癌转移的关系
Table 2 Relations between expression of P16 and Rb and meta-stasis of ESC (50 cases) State of metastasis
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Cases
(n)
Positive cases
P16
Rb
Metastasis
30
5
23
Unmetastasis
20
5
15
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Total
50
10
38
3 讨论
抑癌基因的失活或癌基因的扩增在肿瘤的形成和发生过程中起着重要作用。P16和Rb是两个肿瘤抑制基因，它们主要是作为细胞周期的调控基因来抑制细胞的增殖，其失活或突变常导致转录因子的活化，从而使得细胞增殖不可调控，以至最终形成肿瘤[5～7]。一般认为，正常细胞中存在着这一个负反馈网络，即磷酸化Rb蛋白增加时，可引起P16基因表达增强，增加的P16蛋白与Cyclin D蛋白竞争结合CDK4而抑制CDK4的激酶活性，使Rb蛋白磷酸化减少，从而阻断Cyclin D蛋白、Rb蛋白等介导的转录因子E2F的活化，也影响了众多其它癌基因的转录，最终抑制细胞增殖[4]。为了解P16蛋白和Rb蛋白在食管癌中的分布状态及探讨其可能的作用，本文选用粤东地区的食管鳞癌作为研究对象，其结果表明，P16蛋白仅在20%的病例中表达，且有一半(5例)为弱阳性，这提示P16可能存在失活或丢失，其在粤东地区的食管癌形成中有着重要意义，且是一经常发生的事件。同时我们注意到，这一结果与郑杰等[8]的研究存在差异，他们的结果表明仅有31.7%的病例中检测不到P16蛋白。这似乎可以认为P16蛋白在不同地区人群的食管癌中的表达亦不相同。进一步的比较研究有助于解决这一问题。Rb蛋白的表达不同学者有不同的看法，有的学者认为，Rb蛋白与P16蛋白的表达之间存在着一种负相关[9]，但近来有学者将P16转染至P16缺乏而Rb正常的细胞系中发现，P16可降低Rb的表达水平，因此，它们之间的关系可能不是一种单纯的负相关。本文观察到Rb蛋白的高表达率与P16蛋白的低表达率形成一个对照，这从侧面反映出尽管存在功能正常的Rb，但由于P16的缺失与失活，同样可以使细胞周期进入S期。
, 百拇医药
P16仅能抑制表达正常功能Rb的细胞的增殖意味着P16的丢失与Rb的丢失一样，可能促进细胞的恶性转化。近年的研究发现，P16在多种人类肿瘤中出现纯合缺失、无义错义突变或移码突变。目前P16作为一种肿瘤抑制基因已被研究者所认同。因此，从本文的结果来看，P16蛋白的低表达率正好说明其与食管癌形成的关系密切。众所周知，Rb和P16肿瘤抑制基因是在细胞周期调控的路径上起作用。以往的研究认为P16基因是由Rb的基因产物Rb蛋白转录性抑制。最近，Fang X等[10]用人卵巢癌细胞株研究发现，Rb蛋白及mRNA在缺乏P16的细胞株中比那些P16正常的细胞株中表达更高。进一步用野生型P16转染P16缺乏的细胞株可显著降低Rb蛋白及mRNA的表达。这些结果提示Rb的表达可被P16反调。从表1可知，Rb蛋白的表达与食管鳞癌的分化程度相关，即分化越好，Rb蛋白表达率越高。此外，在10例P16蛋白阳性的食管癌中，竟无1例出现在Ⅲ级食管鳞癌，这进一步说明了P16蛋白与食管癌的形成密切相关，而且是一较晚的分子事件。至于P16蛋白和Rb蛋白的表达与食管癌转移的关系，从本文的结果似乎看不出有明确的关系。
, 百拇医药
本研究仅就P16及Rb蛋白的表达情况进行了观察，P16蛋白的低表达率虽然从一定程度上说明了其与食管癌形成的关系，但对粤东地区这一食管癌高发区来说，P16基因是否存在缺失、突变，或P16基因正常而转录后调控及修饰是否存在问题?这都是值得探讨的问题，作者也将另外进行一些报道。再者，Rb蛋白虽然有高的表达率，但也存在表达功能异常的蛋白的问题，因为突变的Rb基因同样可表达出Rb蛋白，此外，Rb蛋白的磷酸化状态也是细胞周期调控路径中不可忽视的问题。细胞周期调节路径中其它蛋白如Cyclin D1和CDK4等在食管癌中的表达也是值得研究的问题。
参考文献
1.Serrano M, Hannon G J, Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specifc inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993,366:704
, 百拇医药
2.Kamb A, Gruis N A, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436
3.Medema R H, Herrera R E,Lam F, et al. Growth Suppression by p16ink4 requires functional retinoblastoma protein. Proc. Natl Acad Sci USA, 1995,92:6289
4.Sherr C J. Cancer cell cycle. Science, 1996,274:1672
5.Shiozwa T, Nikaido T, Shimizu M, et al. Immunohistochemical analysis of the expression of cdk4 and p16INK4 in human endometrioidtype endometrial carcinoma. Cancer, 1997,80(12):2250
, 百拇医药
6.Hirabayashi H, Fujii Y, Sakaguchi M, et al. p16INK4,pRB, p53 and cyclin D1 expression and hypermethylation of CDKN2 gene in thymoma and thymic carcinoma. Int J Cancer, 1997,73(5):639
7.Cohen J A and Geradts J. Loss of R B and MST1/CDKN2(p16) expression in human sarcomas. Hum Pathol 1977,28(8):893
8.Zheng J, Zhou C, and Xiao F. The expression of Rb, p16 and cyclin D1 in 41 esophageal cancers. Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih, 1996,25(6):336
, 百拇医药
9.Sakaguchi M, Fujii Y, Hirabayashi H, et al. Inversely correlated expression of p16 and Rb protein in non-small cell lung cancers: an immunohistochemical study. Int J Cancer, 1996,65(4):442
10.Fang X, Jin X, Xu H J, et al. Expression of p16 induces transcriptional downregulation of the R B gene. Oncogene, 1998,16(1):1
1999 - 01 - 20收稿
1999 - 04 - 10修回
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单位：吴晓华 祝家镇 中山医科大学法医系法医病理教研室； 广州， 510089 ；徐小虎 汕头大学医学院法医研究所；沈忠英 汕头大学医学院病理教研室； 汕头， 515031
关键词：食管肿瘤；视网膜母细胞瘤蛋白质；蛋白质P16
中山医科大学学报/990306
摘要 目的：探讨P16和Rb两种基因所表达的蛋白在食管癌形成中的作用。方法：采用免疫组化法对50例粤东地区食管癌进行检测。结果：在50例食管鳞癌标本中，10例表现P16蛋白阳性，38例表现为Rb蛋白阳性。在38例Rb蛋白阳性病例中，有31例P16蛋白阴性，另有5例呈现P16蛋白低表达。17例Ⅰ级食管鳞癌均表达Rb蛋白，28例Ⅱ级食管鳞癌中有19例Rb蛋白表达阳性，5例Ⅲ级食管鳞癌中有2例表达Rb蛋白。结论：P16蛋白在食管癌中的异常是一经常发生的事件，P16蛋白的表达与Rb蛋白的表达之间存在明显的负相关，P16蛋白的异常在不同地区之间可能存在差异；Rb蛋白的表达与食管癌的分化程度相关，即分化越好，Rb蛋白表达率越高。细胞周期调控的Rb路径异常，可能参与食管癌的形成。
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中图号 R 735.1
The Expression of Protein of P16 and Rb in Esophageal Cancer
Wu Xiaohua1,2 Xu Xiaohu2 Zhu Jiazhen1 Shen Zhongying3
( 1 Department of Forensic Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089
2 Research Institute of Forensic Medicine, Shantou University Medical College, Shantou,3 Department to Pathology, Shantou University Medical College, Shantou, 515031)
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Abstract Objective:To explore the role of protein of P16 and Rb genes in the carcinogenesis in human esophageal cancer. Method:50 cases of esophageal squamous cell carcinoma(ESC) from east Guangdong were selected and immunohistochemistry method was applied. Results: The results show that 10 of 50 express P16 and 38 of 50 express Rb. No expression of P16 could be found in 31 of 38 Rb positive cases.5 showed low expression of P16. 17 of 17 grade Ⅰ esophageal squanous-cell carcinoma expressed Rb. 19 of 28 grade Ⅱ ESC were Rb positive. 2 of 5 grade Ⅲ ESC showed Rb expression. Conclusions: Results suggest that abnormality of P16 in ESC is a common event. Inactivations of P16 and Rb are inversely correlated in ESC. Abnormality of P16 may various among different area. Rb expression could be related to the differentiation of ESC. Abnormality of P16 and Rb in the regulatory pathway of cell cycle may be involved in the carcinogenesis of ESC.
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Subject headings esophageal neoplasms; protein P16; retinoblastoma protein
肿瘤的形成是一个非常复杂的生物学过程，许多人类肿瘤都以一种或多种细胞周期调控基因的异常为其部分特征，这些包括Rb、P53、P16和Cyclin D1。P16蛋白是周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinases 4,CDK4)和CDK6的特异抑制子，CDK4和CDK6参与Cyclin D1依赖性的Rb磷酸化[1]，有证据提示，P16是一个肿瘤抑制基因。首先，其基因定位于染色体9p21，该区域在多种人肿瘤中出现异常[2]。其次，P16在Rb保持野生型的肿瘤中常表现缺失、突变或高甲基化及转录静止，而且P16在这些细胞中以高水平异位表达(ectopic expression)时可导致G1期终止。第三，P16缺陷小鼠对一些致癌因素敏感，在人肿瘤中P16的种系突变与恶性黑色素瘤和胰腺癌的家族综合征相关[3]。Rb和其它Rb样蛋白(p130，p107)控制着由杂二聚体转录调节子(heterodimeric transcription regulator)介导的基因表达，总称为E2Fs，它们可反式激活那些基因产物对进入S期非常重要的基因，Rb蛋白以其去磷酸化形式与E2F复合体的亚群结合，并将其转变为抑制E2F靶基因表达的抑制子。Rb蛋白的磷酸化使这些E2Fs游离，使它们能反式激活同样的基因，这是一个最初由周期素依赖性激酶触发而后由Cyclin E-CDK2复合体改变的过程[4]。
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食管癌(esophageal cancer)在我国是高发癌，其死亡率在肿瘤死亡中处于第二位，已有报道P16和Rb在食管癌中有改变，粤东地区作为食管癌高发区，有必要对P16和Rb在食管癌中的表达情况作一研究，以探讨它们在食管癌发生中的作用和意义。为此，我们从粤东地区选择了50例食管鳞状上皮癌进行P16蛋白和Rb蛋白的免疫组化观察。
1 材料与方法
1.1 标本来源
50例食管鳞状上皮癌标本选自汕头大学医学院病理教研室1996～1997年活检存档蜡块，病例来源均为粤东沿海地区(食管癌高发区)，其中Ⅰ级17例，Ⅱ级28例，Ⅲ级5例，有淋巴结转移者30例，无转移者20例，取10例正常食管粘膜作为对照。
1.2 试 剂
, 百拇医药 鼠抗人P16单克隆抗体(Ab-2，克隆号ZJ11)、Rb单克隆抗体(Ab-1，克隆号1F8)均购自美国NEOMARKERS公司，免疫组化试剂盒Ultravision Detection System Polyvalent(抗鼠和兔，HRP/DAB)购自美国LAB Vision Corporation。
1.3 免疫组化染色
按试剂盒提供的方法进行，用DAB显色，一抗的效价分别为P16 1∶100、Rb 1∶200。阴性对照用PBS替代，阳性对照采用中山医科大学病理教研室已知为P16、Rb阳性的骨肉瘤切片，阳性染色为棕褐色，阳性结果的判别采用双盲性，根据阳性细胞所占面积分为4个等级(-、+、+ +、+ + +)，“-”为无明显阳性反应细胞，“+”阳性细胞的面积小于25%，“+ +”阳性细胞的面积在25%～75%之间，“+ + +”阳性细胞的面积大于75%。
2 结果
, 百拇医药
2.1 P16蛋白在正常食管及食管鳞状上皮癌中的表达
正常食管粘膜上皮细胞中可见部分细胞表达P16蛋白，主要分布于基底层，棘细胞层亦可见P16蛋白少量的表达。在50例食管鳞状上皮癌中仅见10例为P16蛋白阳性，其中弱阳性(+)者(图2)为5例，中等～强阳性(+ +～+ + +)者5例，阳性部位主要位于胞核(图2)，亦可见胞浆者(图1)，P16蛋白阴性40例。
图1 食管鳞状上皮癌(Ⅱ级).p16阳性，可见癌巢中癌细胞胞浆着色，免疫组化柒鱼，100 ×
Fig. 1 Esophageal squamous cell carcinoma (gradeⅡ). P16 positive reactivity can be seen in the cytop1asm of tumor ceI1s。 1mmuno- histochemical staining. 1 00 ×
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图2 食管鳞状上皮癌(Ⅱ级)，P16阳性，可见癌巢中癌细胞核呈弱阳性表达，免瘦组化染色，100×
Fig. 2 Esophageal squamous cell carcinoma (grade Ⅱ). P16 shows weak reactivity in the nuclus of tumor cel1s， 1mmunohistochemical staining. 100 ×
2.2 Rb蛋白在正常食管及食管鳞状上皮癌中的表达
Rb蛋白阳性部位位于胞核，为浅至深棕褐色颗粒。在正常食管鳞状上皮Rb蛋白的表达与P16蛋白类似，主要分布于基底细胞层和棘细胞层，表达水平亦较低。在食管鳞状上皮癌中，38例Rb蛋白阳性，其中弱阳性者(+)8例，中等～强阳性者(图4)30例，Rb蛋白阴性12例，某些病例癌巢中核强阳性细胞清晰可见，且阳性细胞主要靠近癌巢周边，癌巢中央细胞弱阳性或不着色(图3)。经与上述10例P16蛋白阳性病例进行比较，4例Rb蛋白弱阳性和3例Rb蛋白阴性者呈现P16蛋白的表达，另有3例呈中等～强Rb蛋白阳性者有P16蛋白表达。在38例Rb蛋白阳性病例中，有31例不表达P16蛋白。
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图3 食营鳞状上皮癌(Ⅰ级)，癌巢中核强阳性细胞清晰可见， rett细胞主要靠近癌巢周边，癌巢中央细胞，弱阳性或不着色，R6免疫组化 柒色，100×
Fig. 3 Esophageal squamous cell carcinoma (grade I). EXtensive nuclear positive ceIls present in the nest clear1y. positive cells are mainly locate near the boundary of nest while ceIls in the center show weak reactivity. Rb immunohistochemical stalning. 100 ×
图4 食管鳞状上皮癌(Ⅱ级)，癌巢中大量Rb阳性细胞，阳性部位位于核内，免疫组化染鱼，100 ×
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Fig.4 Esophageal squamous cell carcinoma (grade Ⅱ). A large amount Of Rb positive ceIls can be seen in nestS。 The positive reactivity was located in nuclus. lmmunohistochemical staining. 1 00×
2.3 P16蛋白和Rb蛋白在不同级别和转移状态的食管癌中的表达
结果见表1及表2。
表1 P16、Rb蛋白在不同级别食管鳞状上皮癌中的表达
Table 1 Expression of P16 and Rb in different grade ofESC (50 cases) Grade
, 百拇医药
Cases
(n)
Positive cases
P16
Rb
Ⅰ
17
3
17
Ⅱ
28
7
19
, 百拇医药
Ⅲ
5
0
2
Total
50
10
38
表2 P16、Rb蛋白的表达与食管鳞状上皮癌转移的关系
Table 2 Relations between expression of P16 and Rb and meta-stasis of ESC (50 cases) State of metastasis
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Cases
(n)
Positive cases
P16
Rb
Metastasis
30
5
23
Unmetastasis
20
5
15
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Total
50
10
38
3 讨论
抑癌基因的失活或癌基因的扩增在肿瘤的形成和发生过程中起着重要作用。P16和Rb是两个肿瘤抑制基因，它们主要是作为细胞周期的调控基因来抑制细胞的增殖，其失活或突变常导致转录因子的活化，从而使得细胞增殖不可调控，以至最终形成肿瘤[5～7]。一般认为，正常细胞中存在着这一个负反馈网络，即磷酸化Rb蛋白增加时，可引起P16基因表达增强，增加的P16蛋白与Cyclin D蛋白竞争结合CDK4而抑制CDK4的激酶活性，使Rb蛋白磷酸化减少，从而阻断Cyclin D蛋白、Rb蛋白等介导的转录因子E2F的活化，也影响了众多其它癌基因的转录，最终抑制细胞增殖[4]。为了解P16蛋白和Rb蛋白在食管癌中的分布状态及探讨其可能的作用，本文选用粤东地区的食管鳞癌作为研究对象，其结果表明，P16蛋白仅在20%的病例中表达，且有一半(5例)为弱阳性，这提示P16可能存在失活或丢失，其在粤东地区的食管癌形成中有着重要意义，且是一经常发生的事件。同时我们注意到，这一结果与郑杰等[8]的研究存在差异，他们的结果表明仅有31.7%的病例中检测不到P16蛋白。这似乎可以认为P16蛋白在不同地区人群的食管癌中的表达亦不相同。进一步的比较研究有助于解决这一问题。Rb蛋白的表达不同学者有不同的看法，有的学者认为，Rb蛋白与P16蛋白的表达之间存在着一种负相关[9]，但近来有学者将P16转染至P16缺乏而Rb正常的细胞系中发现，P16可降低Rb的表达水平，因此，它们之间的关系可能不是一种单纯的负相关。本文观察到Rb蛋白的高表达率与P16蛋白的低表达率形成一个对照，这从侧面反映出尽管存在功能正常的Rb，但由于P16的缺失与失活，同样可以使细胞周期进入S期。
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P16仅能抑制表达正常功能Rb的细胞的增殖意味着P16的丢失与Rb的丢失一样，可能促进细胞的恶性转化。近年的研究发现，P16在多种人类肿瘤中出现纯合缺失、无义错义突变或移码突变。目前P16作为一种肿瘤抑制基因已被研究者所认同。因此，从本文的结果来看，P16蛋白的低表达率正好说明其与食管癌形成的关系密切。众所周知，Rb和P16肿瘤抑制基因是在细胞周期调控的路径上起作用。以往的研究认为P16基因是由Rb的基因产物Rb蛋白转录性抑制。最近，Fang X等[10]用人卵巢癌细胞株研究发现，Rb蛋白及mRNA在缺乏P16的细胞株中比那些P16正常的细胞株中表达更高。进一步用野生型P16转染P16缺乏的细胞株可显著降低Rb蛋白及mRNA的表达。这些结果提示Rb的表达可被P16反调。从表1可知，Rb蛋白的表达与食管鳞癌的分化程度相关，即分化越好，Rb蛋白表达率越高。此外，在10例P16蛋白阳性的食管癌中，竟无1例出现在Ⅲ级食管鳞癌，这进一步说明了P16蛋白与食管癌的形成密切相关，而且是一较晚的分子事件。至于P16蛋白和Rb蛋白的表达与食管癌转移的关系，从本文的结果似乎看不出有明确的关系。
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本研究仅就P16及Rb蛋白的表达情况进行了观察，P16蛋白的低表达率虽然从一定程度上说明了其与食管癌形成的关系，但对粤东地区这一食管癌高发区来说，P16基因是否存在缺失、突变，或P16基因正常而转录后调控及修饰是否存在问题?这都是值得探讨的问题，作者也将另外进行一些报道。再者，Rb蛋白虽然有高的表达率，但也存在表达功能异常的蛋白的问题，因为突变的Rb基因同样可表达出Rb蛋白，此外，Rb蛋白的磷酸化状态也是细胞周期调控路径中不可忽视的问题。细胞周期调节路径中其它蛋白如Cyclin D1和CDK4等在食管癌中的表达也是值得研究的问题。
参考文献
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9.Sakaguchi M, Fujii Y, Hirabayashi H, et al. Inversely correlated expression of p16 and Rb protein in non-small cell lung cancers: an immunohistochemical study. Int J Cancer, 1996,65(4):442
10.Fang X, Jin X, Xu H J, et al. Expression of p16 induces transcriptional downregulation of the R B gene. Oncogene, 1998,16(1):1
1999 - 01 - 20收稿
1999 - 04 - 10修回
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