人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定
作者：王传恩 阮奕文 姚志彬 谢瑶 郭辉玉
单位：王传恩 阮奕文 姚志彬 谢瑶 中山医科大学 脑研究室 ；郭辉玉 微生物学教研室； 广州， 510089
关键词：神经生长因子；生物合成；遗传载体；重组，遗传；基因疗法；痴呆，老年性；治疗
中山医科大学学报/990302
摘 要 目的：构建携带人神经生长因子(hNGF)基因的真核细胞表达载体，为应用NGF进行老年性痴呆(AD)等疾病基因治疗打基础。 方法：应用基因重组技术将hNGF cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，用限制性内切酶酶切分析重组质粒pLNGFSN中hNGF基因的插入方向，用PCR、斑点杂交和Southern杂交对重组质粒pLNGFSN作进一步鉴定。结果：hNGF cDNA已正确地克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，而构建成重组逆转录病毒载体pLNGFSN。结论：真核细胞表达载体pLNGFSN的成功构建，为进一步开展NGF基因治疗AD等中枢神经系统疾病奠定了基础。
, 百拇医药
中图号 R 394.3
Construction and Identification of Eukaryotic Cell Expression
Vector Carrying Human Nerve Growth Factor Gene
Wang Chuan′en1 Ruan Yiwen1 Yao Zhibin1 Xie Yao1 Guo Huiyu2
( 1 Department of Brain Research 2 Department of Microbiology, Sun Yat-sen University of
Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
, 百拇医药
Abstract Objective:To construct eukaryotic cell expression vector carrying human nerve growth factor complementary DNA (hNGF cDNA) for gene therapy. Methods:Through genetic recombination technique, hNGF cDNA was inserted into polylinker site of retroviral vector pLXSN. The recombinant plasmid pLNGFSN was verified with restriction analysis, PCR, Dot blot hybridization and Southern blot hybridization. Results: hNGF cDNA was cloned correctly into retroviral vector pLXSN. Recombinant retroviral vector pLNGFSN was constructed. Conclusion:The eukaryotic cell expression vector pLNGFSN was constructed successfully for gene therapy of Alzheimer′s and other central nervous system diseases.
, 百拇医药
Subject headings nerve growth factor/biothesis; genetic vectors; recombination, genetic; gene therapy; dementia, senile/therapy
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经系统最为重要的生物活性分子之一，是目前防治老年性痴呆症(Alzheimer′s disease, AD)等多种神经退变性疾病的最有前途的一种神经营养因子[1，2]。但NGF属生物大分子，不能直接通过血脑屏障，其应用受到了限制。人们曾用脑室埋管或脑室内植入缓释囊等方法以解决给药途径问题，但都有一些无法克服的缺陷。用基因治疗方法来解决NGF治疗AD等疾病的给药途径问题是目前最有希望的方案[3]。其主要策略是利用基因重组和转移技术使神经细胞或非神经细胞获得NGF合成分泌能力，通过内生NGF保护变性的神经元并改善其学习记忆能力。作者拟用分子生物学及细胞生物学技术将人NGF(hNGF)基因转移到神经前体细胞或非神经细胞中，然后用于移植治疗实验性AD，为AD基因治疗这一新思路进行尝试。本文报告第一部分工作，即人NGF基因真核细胞表达载体的构建及其鉴定。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 生物材料
质粒pBS/NGF含有hNGF的cDNA序列基因，由The Salk Institute for Biological Studies的Gage FH教授惠赠；逆转录病毒载体质粒pLXSN由Fred Hutchinson Cancer Research Center的Miller AD 教授惠赠；大肠杆菌JM109、DH5 α为本室保存菌株。
1.2 主要试剂
限制性内切酶BamHⅠ、Xho Ⅰ、Sal Ⅰ、ApaⅠ、EcoR Ⅰ,T4DNA连接酶，碱性磷酸酶CIP，Klenow DNA聚合酶Ⅰ，Agarase, Dig DNA labeling and detection kit,尼龙膜(Boehringer Mannheim公司)； PCR引物5′→3′GGTGCATAGCGTAATGTCCA,3′→5′GCAGGTCAGGCTCTTCTCA(上海细胞生物学研究所合成)。其它试剂均为分析纯以上产品。
, 百拇医药
1.3 pBS/NGF质粒的鉴定、目的基因及探针的制备
分别用HindⅢ单酶切及SmaⅠ和ApaⅠ双酶切pBS/NGF质粒。酶解后，用低熔点琼脂糖(LMT)电泳分离出含hNGF基因的片段。以pBS/NGF质粒为模板，用hNGF特异性引物进行PCR。反应条件：94 ℃变性7 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，30个循环。取5μL PCR产物15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果：用LMT电泳分离NGF基因片段，经Agarase消化回收，按照Dig DNA labeling and detection kit说明书标记制备探针。
1.4 pLNGFSN重组体的构建
DNA重组按文献[4]方法进行。首先将LMT电泳分离的0.97 kb NGF基因，经Agarase消化、回收并进行3′突出端的删切；pLXSN载体用XhoⅠ酶切，Klenow DNA聚合酶补平，碱性磷酸酶CIP去磷酸化处理；在T4 DNA连接酶的作用下将NGF基因与pLXSN载体连接成pLNGFSN；之后，取连接物转化DH5α宿主菌，挑取转化子，用碱变性法快速抽提质粒DNA，电泳筛选片段增大者再进行鉴定。
, 百拇医药
1.5 pLNGFSN重组体的鉴定
1.5.1 重组质粒NGF cDNA插入方向的鉴定
将提取的质粒DNA，分别用限制性内切酶BamH Ⅰ、HpaⅠ、EcoR Ⅰ 酶切，在pLXSN(5.874 kb)多克隆位点上有BamH Ⅰ、HpaⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ等位点，本研究选取XhoⅠ 为插入点。hNGF片段(0.97 kb)近3′末端也有1个EcoR Ⅰ 酶切位点。因此，如果NGF插入方向为正向连接，则产生6.25 kb和0.59 kb两个片段；如果为反向连接，则产生6.4 kb和0.38 kb两个片段。重组体用单一酶切位点的限制性内切酶BamH Ⅰ 酶切分析为线性6.84 kb的片段，用BamH Ⅰ 和HpaⅠ 双酶切为5.87 kb和0.97 kb两个片段。
1.5.2 PCR鉴定重组体
分别以pBS/NGF、pLNGFSN及pLXSN质粒DNA为模板，用hNGF特异性引物进行PCR。琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
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1.5.3 斑点杂交鉴定重组体
将重组质粒pLNGFSN DNA点膜，同时以质粒pBS/NGF及pLXSN DNA作为对照，用Digoxigenin标记的hNGF基因为探针，按Digoxigenin检测试剂盒操作进行预杂交、杂交及免疫学检测。
1.5.4 Southern杂交鉴定重组体
用限制性内切酶BamHⅠ、Hpa Ⅰ、EcoRⅠ酶切重组质粒pLNGF-SN，琼脂糖凝胶电泳，经变性、转印及预杂交后，以Digoxigenin标记的hNGF基因为探针，进行杂交与免疫学检测。
2 结果
2.1 质粒pBS/NGF的鉴定
质粒pBS/NGF经限制性内切酶HindⅢ酶切后，能够产生2.96 kb和1.8 kb两个片段，其中1.8 kb片段含有hNGF cDNA基因；用SmaⅠ和ApaⅠ双酶切后，产生6个片段，其中0.97 kb片段含有hNGF cDNA基因。以pBS/NGF质粒DNA为模板，经PCR扩增出长度为0.72 kb的hNGF基因，符合理论大小(图1)。
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图1 PCR鉴定pBS/NGF与重组质粒pLNGFSN
Fig.1 Identification of pBS/NGF and recombinant plasmid pLNGFSN by PCR
Lane 1:PCR Markers; Lane 2:plasmid pBS/NGF; Lane 3:plasmid pLNGFSN; Lane 4:pLXSN
2.2 逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
2.2.1 重组表达载体的构建
比较质粒pBS/NGF和真核表达质粒pLXSN的多克隆酶切位点，结合hNGF原基因片段编码区核苷酸序列酶切位点，选用限制性内切酶SmaⅠ和ApaⅠ对pBS/NGF质粒双酶切，用XhoⅠ对pLXSN进行完全酶切，分别电泳回收0.97 kb的hNGF原基因片段和5.87 kb的pLXSN病毒载体片段。两片段经平端处理后进行连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选的阳性克隆命名为pLNGFSN。
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2.2.2 重组表达载体中目的基因插入方向
小量扩增碱裂解法提取DNA，EcoRⅠ等限制性内切酶酶切鉴定方向，即EcoRⅠ限制性内切酶酶切后产生6.25 kb和0.59 kb两个片段者为单正向重组体(图2)。
图2 重组质粒的酶切分析
Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasmid
Lane 1:λ DNA /HindⅢ markers; Lane 2:plasmid pLXSN/XhoⅠ;Lane 3:recombinant plasmid/BamHⅠ; Lane 4:recombinant plasmid/BamHⅠ+HpaⅠ; Lane 5:recombinant plasmid/EcoRⅠ
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2.2.3 PCR鉴定
以重组表达载体pLNGFSN为模板，经PCR扩增出长度为0.72 kb的hNGF基因，结果见图1。
2.2.4 斑点杂交鉴定
Digoxigenin标记的hNGF cDNA探针与重组质pLNGFSN杂交呈阳性，质粒pBS/NGF为阳性对照，质粒pLXSN为阴性(图3)。证明hNGF cDNA基因已克隆入pLXSN载体中。
图3 重组质粒与hNGF探针斑点杂交
Fig.3 Patterns of hybridization of recombinantplasmid with hNGF cDNA probe
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Row 1:pBS/NGF; Row 2:pLNGFSN; Row 3:pLXSN
2.2.5 Southern杂交鉴定
Digoxigenin标记的hNGF cDNA探针分别与重组质粒pLNGFSN经BamHⅠ酶切后的线性化DNA、BamH Ⅰ与HpaⅠ双酶切后的0.97 kb小片段DNA及EcoRⅠ酶切后的大、小片段DNA均呈阳性杂交(图4)。这进一步证明hNGF cDNA基因已正确克隆入pLXSN载体中。
图4 重组质粒与hNGF探针Southern杂交
Fig.4 Patterns of Southern blot hybridization of recombinantplasmid with hNGF cDNA probe
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Lane 1:λNDA/HindⅢ markers; Lane 2:plasmid pLXSN/XhoⅠ; Lane 3:recombinant plasmid/BamHⅠ; Lane 4:recombinant plasmid/BamHⅠ+HpaⅠ; Lane 5:recombinant plasmid/EcoRⅠ
3 讨论
逆转录病毒载体介导的基因转移是将外源性基因导入靶细胞的有效手段。它不但能高效地将外源基因转入靶细胞，而且能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因中，并随细胞分裂而传给后代，在基因治疗中被广泛应用。本研究用的逆转录病毒载体来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，是在逆转录病毒载体N2基础上构建的新一代载体，按其结构属带有内部启动子的载体，不仅去除了gag、pol、env等结构基因，而且将gag基因的翻译起始密码子ATG变成终止子TAG，将5′端MoMLV序列用相应的小鼠肉瘤病毒(MoMSV)序列所取代，进一步降低了同源重组的概率，使逆转录病毒载体介导的基因转移隐患大大降低，具有较高的安全性[5]。研究人员利用pLXSN载体已成功地对ADA[6]、凝血因子Ⅷ[7]等进行了基因转移及表达的研究。
, 百拇医药
本研究构建的逆转录病毒载体带有 hNGFcDNA编码区基因，编码hNGF。NGF的研究是当今医学生物界的热点之一[1，2]，其相对分子质量为26 ku，由118个氨基酸组成的多肽，能介导多种生物学效应，尤其是对中枢神经系统的胆碱能神经元具有神经营养的作用，已用于AD等多种疾病的治疗[2]。但NGF不能通过血脑屏障，其应用受到了极大地限制。本研究应用基因重组技术构建hNGF逆转录病毒重组体，为脑内移植基因治疗奠定了基础。目前正尝试将基因工程细胞移植于脑内，对AD等中枢神经系统退变性疾病进行实验治疗，它与常规的治疗方法比较具有明显的优势：不受血脑屏障的限制，可长期表达，避免了反复给药的缺陷等。
参考文献
1.Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later. Science, 1987,237(4819):1154
, 百拇医药
2.Olson L. NGF and the treatment of Alzheimer′s disease. Exp Neurol, 1993,124(1):5
3.Blomer U, Naldini L, Verma I M,et al. Application of gene therapy to the CNS. Human Molecular Genetics, 1996,5(5):1397
4.Sambrook Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 53～85
5.Miller A D, Resman G J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques, 1989,7(9):980
, 百拇医药
6.Kaleko M, Garcia J V, Osborne W R A, et al. Expression of human adenosine deaminase in mice after transplantation of genetically-modified bone marrow. Blood, 1990,75(8):1733
7.Lynch C, Israel D I, Kaufman R J, et al. Sequences in the coding region of clatting factor Ⅷ act as dominant inhibitors of RNA accumulation and protein production. Human Gene Therapy, 1993,4(3):259
1998 - 12 - 31收稿
1999 - 04 -13修回, 百拇医药
单位：王传恩 阮奕文 姚志彬 谢瑶 中山医科大学 脑研究室 ；郭辉玉 微生物学教研室； 广州， 510089
关键词：神经生长因子；生物合成；遗传载体；重组，遗传；基因疗法；痴呆，老年性；治疗
中山医科大学学报/990302
摘 要 目的：构建携带人神经生长因子(hNGF)基因的真核细胞表达载体，为应用NGF进行老年性痴呆(AD)等疾病基因治疗打基础。 方法：应用基因重组技术将hNGF cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，用限制性内切酶酶切分析重组质粒pLNGFSN中hNGF基因的插入方向，用PCR、斑点杂交和Southern杂交对重组质粒pLNGFSN作进一步鉴定。结果：hNGF cDNA已正确地克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，而构建成重组逆转录病毒载体pLNGFSN。结论：真核细胞表达载体pLNGFSN的成功构建，为进一步开展NGF基因治疗AD等中枢神经系统疾病奠定了基础。
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中图号 R 394.3
Construction and Identification of Eukaryotic Cell Expression
Vector Carrying Human Nerve Growth Factor Gene
Wang Chuan′en1 Ruan Yiwen1 Yao Zhibin1 Xie Yao1 Guo Huiyu2
( 1 Department of Brain Research 2 Department of Microbiology, Sun Yat-sen University of
Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
, 百拇医药
Abstract Objective:To construct eukaryotic cell expression vector carrying human nerve growth factor complementary DNA (hNGF cDNA) for gene therapy. Methods:Through genetic recombination technique, hNGF cDNA was inserted into polylinker site of retroviral vector pLXSN. The recombinant plasmid pLNGFSN was verified with restriction analysis, PCR, Dot blot hybridization and Southern blot hybridization. Results: hNGF cDNA was cloned correctly into retroviral vector pLXSN. Recombinant retroviral vector pLNGFSN was constructed. Conclusion:The eukaryotic cell expression vector pLNGFSN was constructed successfully for gene therapy of Alzheimer′s and other central nervous system diseases.
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Subject headings nerve growth factor/biothesis; genetic vectors; recombination, genetic; gene therapy; dementia, senile/therapy
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经系统最为重要的生物活性分子之一，是目前防治老年性痴呆症(Alzheimer′s disease, AD)等多种神经退变性疾病的最有前途的一种神经营养因子[1，2]。但NGF属生物大分子，不能直接通过血脑屏障，其应用受到了限制。人们曾用脑室埋管或脑室内植入缓释囊等方法以解决给药途径问题，但都有一些无法克服的缺陷。用基因治疗方法来解决NGF治疗AD等疾病的给药途径问题是目前最有希望的方案[3]。其主要策略是利用基因重组和转移技术使神经细胞或非神经细胞获得NGF合成分泌能力，通过内生NGF保护变性的神经元并改善其学习记忆能力。作者拟用分子生物学及细胞生物学技术将人NGF(hNGF)基因转移到神经前体细胞或非神经细胞中，然后用于移植治疗实验性AD，为AD基因治疗这一新思路进行尝试。本文报告第一部分工作，即人NGF基因真核细胞表达载体的构建及其鉴定。
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1 材料和方法
1.1 生物材料
质粒pBS/NGF含有hNGF的cDNA序列基因，由The Salk Institute for Biological Studies的Gage FH教授惠赠；逆转录病毒载体质粒pLXSN由Fred Hutchinson Cancer Research Center的Miller AD 教授惠赠；大肠杆菌JM109、DH5 α为本室保存菌株。
1.2 主要试剂
限制性内切酶BamHⅠ、Xho Ⅰ、Sal Ⅰ、ApaⅠ、EcoR Ⅰ,T4DNA连接酶，碱性磷酸酶CIP，Klenow DNA聚合酶Ⅰ，Agarase, Dig DNA labeling and detection kit,尼龙膜(Boehringer Mannheim公司)； PCR引物5′→3′GGTGCATAGCGTAATGTCCA,3′→5′GCAGGTCAGGCTCTTCTCA(上海细胞生物学研究所合成)。其它试剂均为分析纯以上产品。
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1.3 pBS/NGF质粒的鉴定、目的基因及探针的制备
分别用HindⅢ单酶切及SmaⅠ和ApaⅠ双酶切pBS/NGF质粒。酶解后，用低熔点琼脂糖(LMT)电泳分离出含hNGF基因的片段。以pBS/NGF质粒为模板，用hNGF特异性引物进行PCR。反应条件：94 ℃变性7 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，30个循环。取5μL PCR产物15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果：用LMT电泳分离NGF基因片段，经Agarase消化回收，按照Dig DNA labeling and detection kit说明书标记制备探针。
1.4 pLNGFSN重组体的构建
DNA重组按文献[4]方法进行。首先将LMT电泳分离的0.97 kb NGF基因，经Agarase消化、回收并进行3′突出端的删切；pLXSN载体用XhoⅠ酶切，Klenow DNA聚合酶补平，碱性磷酸酶CIP去磷酸化处理；在T4 DNA连接酶的作用下将NGF基因与pLXSN载体连接成pLNGFSN；之后，取连接物转化DH5α宿主菌，挑取转化子，用碱变性法快速抽提质粒DNA，电泳筛选片段增大者再进行鉴定。
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1.5 pLNGFSN重组体的鉴定
1.5.1 重组质粒NGF cDNA插入方向的鉴定
将提取的质粒DNA，分别用限制性内切酶BamH Ⅰ、HpaⅠ、EcoR Ⅰ 酶切，在pLXSN(5.874 kb)多克隆位点上有BamH Ⅰ、HpaⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ等位点，本研究选取XhoⅠ 为插入点。hNGF片段(0.97 kb)近3′末端也有1个EcoR Ⅰ 酶切位点。因此，如果NGF插入方向为正向连接，则产生6.25 kb和0.59 kb两个片段；如果为反向连接，则产生6.4 kb和0.38 kb两个片段。重组体用单一酶切位点的限制性内切酶BamH Ⅰ 酶切分析为线性6.84 kb的片段，用BamH Ⅰ 和HpaⅠ 双酶切为5.87 kb和0.97 kb两个片段。
1.5.2 PCR鉴定重组体
分别以pBS/NGF、pLNGFSN及pLXSN质粒DNA为模板，用hNGF特异性引物进行PCR。琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
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1.5.3 斑点杂交鉴定重组体
将重组质粒pLNGFSN DNA点膜，同时以质粒pBS/NGF及pLXSN DNA作为对照，用Digoxigenin标记的hNGF基因为探针，按Digoxigenin检测试剂盒操作进行预杂交、杂交及免疫学检测。
1.5.4 Southern杂交鉴定重组体
用限制性内切酶BamHⅠ、Hpa Ⅰ、EcoRⅠ酶切重组质粒pLNGF-SN，琼脂糖凝胶电泳，经变性、转印及预杂交后，以Digoxigenin标记的hNGF基因为探针，进行杂交与免疫学检测。
2 结果
2.1 质粒pBS/NGF的鉴定
质粒pBS/NGF经限制性内切酶HindⅢ酶切后，能够产生2.96 kb和1.8 kb两个片段，其中1.8 kb片段含有hNGF cDNA基因；用SmaⅠ和ApaⅠ双酶切后，产生6个片段，其中0.97 kb片段含有hNGF cDNA基因。以pBS/NGF质粒DNA为模板，经PCR扩增出长度为0.72 kb的hNGF基因，符合理论大小(图1)。
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图1 PCR鉴定pBS/NGF与重组质粒pLNGFSN
Fig.1 Identification of pBS/NGF and recombinant plasmid pLNGFSN by PCR
Lane 1:PCR Markers; Lane 2:plasmid pBS/NGF; Lane 3:plasmid pLNGFSN; Lane 4:pLXSN
2.2 逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
2.2.1 重组表达载体的构建
比较质粒pBS/NGF和真核表达质粒pLXSN的多克隆酶切位点，结合hNGF原基因片段编码区核苷酸序列酶切位点，选用限制性内切酶SmaⅠ和ApaⅠ对pBS/NGF质粒双酶切，用XhoⅠ对pLXSN进行完全酶切，分别电泳回收0.97 kb的hNGF原基因片段和5.87 kb的pLXSN病毒载体片段。两片段经平端处理后进行连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选的阳性克隆命名为pLNGFSN。
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2.2.2 重组表达载体中目的基因插入方向
小量扩增碱裂解法提取DNA，EcoRⅠ等限制性内切酶酶切鉴定方向，即EcoRⅠ限制性内切酶酶切后产生6.25 kb和0.59 kb两个片段者为单正向重组体(图2)。
图2 重组质粒的酶切分析
Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasmid
Lane 1:λ DNA /HindⅢ markers; Lane 2:plasmid pLXSN/XhoⅠ;Lane 3:recombinant plasmid/BamHⅠ; Lane 4:recombinant plasmid/BamHⅠ+HpaⅠ; Lane 5:recombinant plasmid/EcoRⅠ
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2.2.3 PCR鉴定
以重组表达载体pLNGFSN为模板，经PCR扩增出长度为0.72 kb的hNGF基因，结果见图1。
2.2.4 斑点杂交鉴定
Digoxigenin标记的hNGF cDNA探针与重组质pLNGFSN杂交呈阳性，质粒pBS/NGF为阳性对照，质粒pLXSN为阴性(图3)。证明hNGF cDNA基因已克隆入pLXSN载体中。
图3 重组质粒与hNGF探针斑点杂交
Fig.3 Patterns of hybridization of recombinantplasmid with hNGF cDNA probe
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Row 1:pBS/NGF; Row 2:pLNGFSN; Row 3:pLXSN
2.2.5 Southern杂交鉴定
Digoxigenin标记的hNGF cDNA探针分别与重组质粒pLNGFSN经BamHⅠ酶切后的线性化DNA、BamH Ⅰ与HpaⅠ双酶切后的0.97 kb小片段DNA及EcoRⅠ酶切后的大、小片段DNA均呈阳性杂交(图4)。这进一步证明hNGF cDNA基因已正确克隆入pLXSN载体中。
图4 重组质粒与hNGF探针Southern杂交
Fig.4 Patterns of Southern blot hybridization of recombinantplasmid with hNGF cDNA probe
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Lane 1:λNDA/HindⅢ markers; Lane 2:plasmid pLXSN/XhoⅠ; Lane 3:recombinant plasmid/BamHⅠ; Lane 4:recombinant plasmid/BamHⅠ+HpaⅠ; Lane 5:recombinant plasmid/EcoRⅠ
3 讨论
逆转录病毒载体介导的基因转移是将外源性基因导入靶细胞的有效手段。它不但能高效地将外源基因转入靶细胞，而且能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因中，并随细胞分裂而传给后代，在基因治疗中被广泛应用。本研究用的逆转录病毒载体来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，是在逆转录病毒载体N2基础上构建的新一代载体，按其结构属带有内部启动子的载体，不仅去除了gag、pol、env等结构基因，而且将gag基因的翻译起始密码子ATG变成终止子TAG，将5′端MoMLV序列用相应的小鼠肉瘤病毒(MoMSV)序列所取代，进一步降低了同源重组的概率，使逆转录病毒载体介导的基因转移隐患大大降低，具有较高的安全性[5]。研究人员利用pLXSN载体已成功地对ADA[6]、凝血因子Ⅷ[7]等进行了基因转移及表达的研究。
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本研究构建的逆转录病毒载体带有 hNGFcDNA编码区基因，编码hNGF。NGF的研究是当今医学生物界的热点之一[1，2]，其相对分子质量为26 ku，由118个氨基酸组成的多肽，能介导多种生物学效应，尤其是对中枢神经系统的胆碱能神经元具有神经营养的作用，已用于AD等多种疾病的治疗[2]。但NGF不能通过血脑屏障，其应用受到了极大地限制。本研究应用基因重组技术构建hNGF逆转录病毒重组体，为脑内移植基因治疗奠定了基础。目前正尝试将基因工程细胞移植于脑内，对AD等中枢神经系统退变性疾病进行实验治疗，它与常规的治疗方法比较具有明显的优势：不受血脑屏障的限制，可长期表达，避免了反复给药的缺陷等。
参考文献
1.Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later. Science, 1987,237(4819):1154
, 百拇医药
2.Olson L. NGF and the treatment of Alzheimer′s disease. Exp Neurol, 1993,124(1):5
3.Blomer U, Naldini L, Verma I M,et al. Application of gene therapy to the CNS. Human Molecular Genetics, 1996,5(5):1397
4.Sambrook Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 53～85
5.Miller A D, Resman G J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques, 1989,7(9):980
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6.Kaleko M, Garcia J V, Osborne W R A, et al. Expression of human adenosine deaminase in mice after transplantation of genetically-modified bone marrow. Blood, 1990,75(8):1733
7.Lynch C, Israel D I, Kaufman R J, et al. Sequences in the coding region of clatting factor Ⅷ act as dominant inhibitors of RNA accumulation and protein production. Human Gene Therapy, 1993,4(3):259
1998 - 12 - 31收稿
1999 - 04 -13修回, 百拇医药