多重等位基因特异性PCR-HLA-ⅡDNA分型
作者：肖露露 陈洪涛 王长希 郑克立 谭茵
单位：广州器官移植配型中心，广东 广州 510095
关键词：HLA-A2抗原；核苷酸重复多态性；聚合酶链反应
中山医科大学学报000306
摘 要：【目的】对人类组织相容性抗原(Human Leucocyte Antigen System)Ⅱ类进行高分辨基因分析。【方法】用多重PCR和等位基因特异性PCR技术相结合[1，2]，建立多重等位基因特异性PCR方法。【结果】24对引物成功地分辨43份DNA的HLA-DRB1、B3、B4、B5*51个等位基因和DQB1*15个等位基因的4位数特异性，识别基因片段长度为281 bp。【结论】多重等位基因特异性PCR技术敏感、微量、节省和分辨能力高，是进行复杂的HLA多态性研究中有价值的佐证试验。
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中图分类号：Q 503，R 392.2 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)03-0179-03
HLA-Ⅱ DNA Typing by Multiplex Alle-specific Amplification
XIAO Lu-lu,CHEN Hong-tao,TAN Yin
(Guangzhou Tissue Typing Centre Tissue Typing LAB,Guangzhou 510095,China)
WANG Chang-xi,ZHENG Ke-li
(First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
, 百拇医药
Abstract:【Objectivel】To analyse type ll HLA(Human Leucocyte Antigen) system genes in higher separative grades.【Method】By leaded multiplex PCR tecknique into allele specific PCR,the multiplex allele specific PCR(MAS-PCR) method is estabilished.【Results】43 DNA samples were typing on HLA-DRB1,B3,B4,B5 and DQB1 seats by 24 primers,the identified gene fragment legth is 281 bp.【Conclusions】MAS-PCR is sensitive,micro-quantitative and save time.MAS-PCR will be helpful on the DNA study of HLA system which has a large number of allele.
, 百拇医药
Key words:HLA-A2 antigen; nucleotids repeat polymorphism; polymerase chain reaction
PCR-HLA分型技术已引人注目地冲击了广泛的临床医学领域，由于各实验室技术设备和方法不同，致使室间差异较大，据统计，国内室间差异在5%～25%。例如，1999年中山三院成功地进行了广东首例非亲缘BMT术后GVHD仅为Ⅰ°的病例，患者在术后3个月时已完全表达供者的遗传标志，但是，术前广州某实验室和本实验室对患者做的HLA分型结果之间有50%不一致。HLA分型结果的差异不仅使各实验室的数据资料失去共享意义，也直接影响临床医疗工作。为此，我们参照文献建立多重等位基因特异性PCR(Multiplex Alle-Specific Amplification,MAS-PCR)用以佐证常规血清学和PCR，有效提高HLA分型准确率。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本来源
采集需要器官移植的患者、拟捐献器官者血0.5 mL/例，脾脏组织50 g/例，共43例，置-20 ℃保存备用。
1.2 试剂来源
包含51个基因特异性的24对引物为美国加州大学(UCLA)组织分型实验室主任Paol.Terasaki教授赠送，特异性为DRB1*0101，0102，0103，0301，0302，401，0402，0403，0404，0405，0406，0407，0408，0409，0410，0411，0701，0801，0802，0803，0804，0805，0901，1001，1101，1102，1103，1104，1201，1202，1301，1302，1303，1304，1305，1401，1402，1403，1405，1406，1501，1502，1503，1601，1602 DRB3* 0101，0201，0202，0301；DRB4* 0101；DRB5* 0101，0102，02；DQB1*0201，0301，0302，0303，0401，0501，0502，0601，0602，0603，0604，0605(*为经WHO命名委员会通过的HLA基因的特异性)。Marker和Gold Taq酶分别为Pharmacia和PE公司产品。
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1.3 制备DNA模板
改良的酚氯仿法提取模板DNA[3]。
1.4 MAS-PCR-HLA分型
1.4.1 DNA模板预处理 模板100 ng，dNTP 200 mol，引物2 pmol,反应体积10 μL，镁离子10 mol/L。置PE-9600扩增仪经95 ℃ 5 min,0 ℃ 5 min，加入Gold Taq酶0.5 U。
1.4.2 DNA扩增程序 95 ℃ 1 min，57 ℃ 30 min， 73 ℃ 30 min，共32个循环。
1.4.3 电 泳 0.5 U TBE琼脂糖制胶。加入marker-phi-xheal 174(DNA片段长度bp的标准品)0.5 μL于第1泳道。150 V电泳40 min。紫外光下拍照分析结果。
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2 结 果
2.1 DNA质量
经Pharmacia核酸定量仪检测，43份标本的DNA为160～219 mg(平均199 mg)，纯度A260/A280 =1.55～2.40(平均1.98)。
2.2 DNA扩增效果
从图1、2可见所有扩增条带均清晰，其中marker由上至下片段长度依次为1 353，1 078，872，603，310，281，271，234，194，118，72 bp。
图1第7、10、12和13泳道分别在234、118、271 bp位置各显现1条扩增带；第8泳道在271、194 bp，第11泳道在271、118 bp位置均显现两条扩增带。
图2第2、3、4、12泳道上分别在281、234、271 、72 bp位置各显现1条扩增带，第8、9、10、13泳道分别在234、127 bp，281、194 bp，271、118 bp，194、118 bp位置均显现2条扩增带。
, 百拇医药
2.3 分辨水平
43例HLA-Ⅱ分型中，血清学、PCR-SSP和MAS-PCR结果一致34例，一致率79%；室间(3/9)或血清学与PCR-SSP结果(6/9)不一致共9例，不一致率21%，均经MAS-PCR确定HLA特异性，其中2例还得到直接硷基测序技术(direct sequency by PE-ABI377 DNA sequencer)确证支持，见表1。
图1 MAS-PCR-HLA-DRB分型电泳
Fig.1 The lectropheris of MAS-PCR-HLA-DRB Typing
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图2 MAS-PCR-HLA-DR、DQ分型电泳
Fig.2 The lectropheris of MAS-PCR-HLA-DRB、DQB Typing
3 讨 论
HLA区高度复杂的多态性取决与其核苷酸序列的特异性及硷基长度，其中DR座位片段266 bp，DQ座位片段281 bp。80年代末PCR渗透到HLA-DNA分析中，使传统血清学方法中难度较大的问题，既必须获得活性好、纯度高和大量的B淋巴细胞才能进行的HLA-Ⅱ分型变得十分容易。通常的PCR-HLA分型，是在1个反应系统含1对引物，需要多于51个反应管和相应引物对才能达到表1所示的高分辨水平。此外，受DNA扩增仪内置96孔扩增管的条件限制，每次只能承担1份DNA的扩增工作。MAS-PCR原理是在同一个反应系统中包含了2对以上引物扩增系统。即竞争PCR系统，也就是将需要多个PCR反应的引物置于一个系统中完成。Gilbert-ST等将MAS-PCR技术应用于对病毒及其变异体的识别[1]，黄晓明等将此技术应用于人类疾病遗传的连锁分析中[2]。我们将MAS-PCR引进HLA-Ⅱ- DNA分裂，在1个反应系统含2对以上引物，可同时扩增4份DNA(每份DNA 24只反应管)，分型实验不仅简洁了许多，并且避免了众多数量耗材、繁琐加样步骤和昂贵经费的重负。
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表1 几种HLA分型技术HLA-DRB1*分型的比较
Table 1 The comparision with several HLA-DRB1* typing techniques Ssample No.
Serology
lab 1/lab 2
PCR-SSP
MAS-PCR
Direct Sequency
950705
12，Blank/12,14
, 百拇医药
12,Blank
1202,Blank
1202,1202
96010501
14,16/3,15
14,16
1405,1601
96010502
14,16/3,15
14,16
1405,1601
970627
, 百拇医药
4,Blank
04,08
0401,0801
970414
12,Blank
12,13
1202,Blank
1202,1202
970433
9,14
09,15
0901,1503
, 百拇医药
970908
4,16
04,15
0405,1501
970851
14,Blank
12,14
1202,1404
9714301
8,Blank
08,12
0802,1202
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MAS-PCR在1个反应体系中所包含的各引物扩增时会发生相互制约，弱势扩增往往会被强势扩增所掩盖，造成某些HLA基因的分解产物(allele)不表达。为弥补缺陷，我们以一种新型聚合酶-Gold Taq酶替换常规的Taq酶，从图1～2中可见单一或多条扩增条带均清晰，显示出Glod Taq酶是一种超长的、精确的DNA聚合酶，能够恢复活性，用于热启动，能有效地提高PCR反应的特异性、灵敏度和各产物的均一性，发挥出MAS-PCR功能优势。表1中例1和例5用直接硷基测序技术检测支持MAS-PCR的结果，也提示MAS-PCR可作为HLA分型的新技术。
从表1可见，依靠MAS-PCR确认DNA-HLA分型的9例中，例1～3是2间实验室的血清学结果不一致，经过MAS-PCR和PCR-SSP方法确认正确结果，占33%(3/9)；例4～9为血清学和PCR-SSP结果不一致，经过MAS-PCR确认正确结果，占67%(6/9)。说明对HLA-Ⅱ的识别，传统血清学有抗原交叉反应组的影响(如表1例2)，虽然分子生物学技术具有优势，但是普通PCR技术受到患者近期输血、既往移植等因素干扰(如表1例5)，因此有必要在组织分型实验室建立MAS-PCR技术，作为一种新的、重复性好的HLA分型的佐证方法。表1中2例依靠直接硷基测序得到与MAS-PCR一致结果还提示MAS-PCR可发挥质量控制作用。
, 百拇医药
基金项目：广东省自然科学基金资助课题(960131)
作者简介：肖露露(1954-)，女，江西万安人，主任医师，1976年中山医科大学毕业.
参考文献：
[1]Gilbert S T,Larochelle R,Magar R,et al.Typing of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses by a multiplex PCR assay[J].J Clin Microbiology,1997,5(1):264.
[2]黄晓明，胡向阳，宗 卉，等.二核苷酸重复多态性的非同位素检测及其在基因诊断中的应用[J].遗传学报， 1995，22(2)：81.
[3]陈洪涛，肖露露，于立新，等.快速PCR-SSP-HLA-DR分型于血清学比较[J].中华泌尿外科杂志，1997，19(1)：40.
收稿日期：1999-09-28, 百拇医药
单位：广州器官移植配型中心，广东 广州 510095
关键词：HLA-A2抗原；核苷酸重复多态性；聚合酶链反应
中山医科大学学报000306
摘 要：【目的】对人类组织相容性抗原(Human Leucocyte Antigen System)Ⅱ类进行高分辨基因分析。【方法】用多重PCR和等位基因特异性PCR技术相结合[1，2]，建立多重等位基因特异性PCR方法。【结果】24对引物成功地分辨43份DNA的HLA-DRB1、B3、B4、B5*51个等位基因和DQB1*15个等位基因的4位数特异性，识别基因片段长度为281 bp。【结论】多重等位基因特异性PCR技术敏感、微量、节省和分辨能力高，是进行复杂的HLA多态性研究中有价值的佐证试验。
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中图分类号：Q 503，R 392.2 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)03-0179-03
HLA-Ⅱ DNA Typing by Multiplex Alle-specific Amplification
XIAO Lu-lu,CHEN Hong-tao,TAN Yin
(Guangzhou Tissue Typing Centre Tissue Typing LAB,Guangzhou 510095,China)
WANG Chang-xi,ZHENG Ke-li
(First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
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Abstract:【Objectivel】To analyse type ll HLA(Human Leucocyte Antigen) system genes in higher separative grades.【Method】By leaded multiplex PCR tecknique into allele specific PCR,the multiplex allele specific PCR(MAS-PCR) method is estabilished.【Results】43 DNA samples were typing on HLA-DRB1,B3,B4,B5 and DQB1 seats by 24 primers,the identified gene fragment legth is 281 bp.【Conclusions】MAS-PCR is sensitive,micro-quantitative and save time.MAS-PCR will be helpful on the DNA study of HLA system which has a large number of allele.
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Key words:HLA-A2 antigen; nucleotids repeat polymorphism; polymerase chain reaction
PCR-HLA分型技术已引人注目地冲击了广泛的临床医学领域，由于各实验室技术设备和方法不同，致使室间差异较大，据统计，国内室间差异在5%～25%。例如，1999年中山三院成功地进行了广东首例非亲缘BMT术后GVHD仅为Ⅰ°的病例，患者在术后3个月时已完全表达供者的遗传标志，但是，术前广州某实验室和本实验室对患者做的HLA分型结果之间有50%不一致。HLA分型结果的差异不仅使各实验室的数据资料失去共享意义，也直接影响临床医疗工作。为此，我们参照文献建立多重等位基因特异性PCR(Multiplex Alle-Specific Amplification,MAS-PCR)用以佐证常规血清学和PCR，有效提高HLA分型准确率。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本来源
采集需要器官移植的患者、拟捐献器官者血0.5 mL/例，脾脏组织50 g/例，共43例，置-20 ℃保存备用。
1.2 试剂来源
包含51个基因特异性的24对引物为美国加州大学(UCLA)组织分型实验室主任Paol.Terasaki教授赠送，特异性为DRB1*0101，0102，0103，0301，0302，401，0402，0403，0404，0405，0406，0407，0408，0409，0410，0411，0701，0801，0802，0803，0804，0805，0901，1001，1101，1102，1103，1104，1201，1202，1301，1302，1303，1304，1305，1401，1402，1403，1405，1406，1501，1502，1503，1601，1602 DRB3* 0101，0201，0202，0301；DRB4* 0101；DRB5* 0101，0102，02；DQB1*0201，0301，0302，0303，0401，0501，0502，0601，0602，0603，0604，0605(*为经WHO命名委员会通过的HLA基因的特异性)。Marker和Gold Taq酶分别为Pharmacia和PE公司产品。
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1.3 制备DNA模板
改良的酚氯仿法提取模板DNA[3]。
1.4 MAS-PCR-HLA分型
1.4.1 DNA模板预处理 模板100 ng，dNTP 200 mol，引物2 pmol,反应体积10 μL，镁离子10 mol/L。置PE-9600扩增仪经95 ℃ 5 min,0 ℃ 5 min，加入Gold Taq酶0.5 U。
1.4.2 DNA扩增程序 95 ℃ 1 min，57 ℃ 30 min， 73 ℃ 30 min，共32个循环。
1.4.3 电 泳 0.5 U TBE琼脂糖制胶。加入marker-phi-xheal 174(DNA片段长度bp的标准品)0.5 μL于第1泳道。150 V电泳40 min。紫外光下拍照分析结果。
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2 结 果
2.1 DNA质量
经Pharmacia核酸定量仪检测，43份标本的DNA为160～219 mg(平均199 mg)，纯度A260/A280 =1.55～2.40(平均1.98)。
2.2 DNA扩增效果
从图1、2可见所有扩增条带均清晰，其中marker由上至下片段长度依次为1 353，1 078，872，603，310，281，271，234，194，118，72 bp。
图1第7、10、12和13泳道分别在234、118、271 bp位置各显现1条扩增带；第8泳道在271、194 bp，第11泳道在271、118 bp位置均显现两条扩增带。
图2第2、3、4、12泳道上分别在281、234、271 、72 bp位置各显现1条扩增带，第8、9、10、13泳道分别在234、127 bp，281、194 bp，271、118 bp，194、118 bp位置均显现2条扩增带。
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2.3 分辨水平
43例HLA-Ⅱ分型中，血清学、PCR-SSP和MAS-PCR结果一致34例，一致率79%；室间(3/9)或血清学与PCR-SSP结果(6/9)不一致共9例，不一致率21%，均经MAS-PCR确定HLA特异性，其中2例还得到直接硷基测序技术(direct sequency by PE-ABI377 DNA sequencer)确证支持，见表1。
图1 MAS-PCR-HLA-DRB分型电泳
Fig.1 The lectropheris of MAS-PCR-HLA-DRB Typing
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图2 MAS-PCR-HLA-DR、DQ分型电泳
Fig.2 The lectropheris of MAS-PCR-HLA-DRB、DQB Typing
3 讨 论
HLA区高度复杂的多态性取决与其核苷酸序列的特异性及硷基长度，其中DR座位片段266 bp，DQ座位片段281 bp。80年代末PCR渗透到HLA-DNA分析中，使传统血清学方法中难度较大的问题，既必须获得活性好、纯度高和大量的B淋巴细胞才能进行的HLA-Ⅱ分型变得十分容易。通常的PCR-HLA分型，是在1个反应系统含1对引物，需要多于51个反应管和相应引物对才能达到表1所示的高分辨水平。此外，受DNA扩增仪内置96孔扩增管的条件限制，每次只能承担1份DNA的扩增工作。MAS-PCR原理是在同一个反应系统中包含了2对以上引物扩增系统。即竞争PCR系统，也就是将需要多个PCR反应的引物置于一个系统中完成。Gilbert-ST等将MAS-PCR技术应用于对病毒及其变异体的识别[1]，黄晓明等将此技术应用于人类疾病遗传的连锁分析中[2]。我们将MAS-PCR引进HLA-Ⅱ- DNA分裂，在1个反应系统含2对以上引物，可同时扩增4份DNA(每份DNA 24只反应管)，分型实验不仅简洁了许多，并且避免了众多数量耗材、繁琐加样步骤和昂贵经费的重负。
, http://www.100md.com
表1 几种HLA分型技术HLA-DRB1*分型的比较
Table 1 The comparision with several HLA-DRB1* typing techniques Ssample No.
Serology
lab 1/lab 2
PCR-SSP
MAS-PCR
Direct Sequency
950705
12，Blank/12,14
, 百拇医药
12,Blank
1202,Blank
1202,1202
96010501
14,16/3,15
14,16
1405,1601
96010502
14,16/3,15
14,16
1405,1601
970627
, 百拇医药
4,Blank
04,08
0401,0801
970414
12,Blank
12,13
1202,Blank
1202,1202
970433
9,14
09,15
0901,1503
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970908
4,16
04,15
0405,1501
970851
14,Blank
12,14
1202,1404
9714301
8,Blank
08,12
0802,1202
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MAS-PCR在1个反应体系中所包含的各引物扩增时会发生相互制约，弱势扩增往往会被强势扩增所掩盖，造成某些HLA基因的分解产物(allele)不表达。为弥补缺陷，我们以一种新型聚合酶-Gold Taq酶替换常规的Taq酶，从图1～2中可见单一或多条扩增条带均清晰，显示出Glod Taq酶是一种超长的、精确的DNA聚合酶，能够恢复活性，用于热启动，能有效地提高PCR反应的特异性、灵敏度和各产物的均一性，发挥出MAS-PCR功能优势。表1中例1和例5用直接硷基测序技术检测支持MAS-PCR的结果，也提示MAS-PCR可作为HLA分型的新技术。
从表1可见，依靠MAS-PCR确认DNA-HLA分型的9例中，例1～3是2间实验室的血清学结果不一致，经过MAS-PCR和PCR-SSP方法确认正确结果，占33%(3/9)；例4～9为血清学和PCR-SSP结果不一致，经过MAS-PCR确认正确结果，占67%(6/9)。说明对HLA-Ⅱ的识别，传统血清学有抗原交叉反应组的影响(如表1例2)，虽然分子生物学技术具有优势，但是普通PCR技术受到患者近期输血、既往移植等因素干扰(如表1例5)，因此有必要在组织分型实验室建立MAS-PCR技术，作为一种新的、重复性好的HLA分型的佐证方法。表1中2例依靠直接硷基测序得到与MAS-PCR一致结果还提示MAS-PCR可发挥质量控制作用。
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作者简介：肖露露(1954-)，女，江西万安人，主任医师，1976年中山医科大学毕业.
参考文献：
[1]Gilbert S T,Larochelle R,Magar R,et al.Typing of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses by a multiplex PCR assay[J].J Clin Microbiology,1997,5(1):264.
[2]黄晓明，胡向阳，宗 卉，等.二核苷酸重复多态性的非同位素检测及其在基因诊断中的应用[J].遗传学报， 1995，22(2)：81.
[3]陈洪涛，肖露露，于立新，等.快速PCR-SSP-HLA-DR分型于血清学比较[J].中华泌尿外科杂志，1997，19(1)：40.
收稿日期：1999-09-28, 百拇医药