HLA-DRB1基因多态性与河南汉族人群急性淋巴细胞白血病关联分析
作者：曹孟德 秦东春 岳保红 苏堤 王东升 苏天水 燕桂香 盛光耀
单位：曹孟德 苏堤 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)；秦东春 秦东春 岳保红 苏天水 燕桂香 盛光耀(河南医科大学第一附属医院检验科 郑州 450052)
关键词：HLA-DRB1基因；多态现象；白血病，淋巴细胞，急性
河南医科大学学报000111摘 要：目的： 探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)易感性与HLA-DRB1基因多态性之间的关联性，找出ALL的易感基因。方法：采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)DNA分型技术对56例ALL患者和105例健康对照组进行了HLA-DRB1基因分型。结果： ALL组与HLA-DR7基因关联,基因频率为24.1%，RR=2.56，χ2=7.34，P<0.01,病因分数为0.29；其他等位基因频率ALL组与对照组间差异无显著性。结论： HLA-DR7与ALL有关联。
, 百拇医药
中图分类号：R617
Association between HLA-DRB1 alleles polymorphism and susceptibility to acute lymphoblastic leukemia in a Henan Chinese population of Han nationality
CAO Mengde Su Di WANG Dongsheng
(Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
QIN Dongchun YUE Baohong SU Tianshui YAN Guixiang
, http://www.100md.com
(Clinical of Laboratory, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
SHENG Guangyao
(Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052
Abstract：Aim: In order to explore the association between HLA-DRB1 alleles polymorphism and susceptibility to acute lymphoblastic leukemia in a Henan Chinese population of Han nationality and find the susceptible genes of ALL. Methods: 105 normal people and 56 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) were carried out HLA-DRB1 genotyping analysis by polymerase chain reaction with sequence specific primers (PCR-SSP). Results: Compared with normal controls, the frequency of HLA-DR7 was significantly increased in the patient group, with a relative risk (RR) being 2.56，χ2=7.34, P<0.01 and with an etiological fraction (EF) being 0.29, while the frequencies of other DRB1 alleles were not significantly increased in the ALL group. Conclusion: These results were shown that susceptibility to ALL are strongly associated with the HLA-DR7 gene.
, http://www.100md.com
Key words：HLA-DRB1 alleles; polymorphism ;leukemia, lymphoblastic,acute▲
急性淋巴细胞白血病(ALL)的发病机制目前仍不清楚。流行病学研究认为儿童普通型ALL可能是由于儿童出生后的早期感染所引起的罕见结果[1]。决定儿童是否死于普通型ALL的因素之一是其对感染的应答情况。由于对感染的免疫应答部分处于HLA基因控制之下，因此，近年来，国外一些研究人员对急性淋巴细胞白血病与HLA基因之间的关联进行了研究，发现ALL易感性与HLA-DRB位点的等位基因密切相关[2～5],但针对华人的研究尚未见报道。作者对56例ALL患者及105例健康对照进行了HLA-DRB1的PCR-SSP基因分型研究，试图从中发现ALL易感性与HLA-DRB1基因的关系，为ALL的发病因素及早期诊断提供参考。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 病例及健康对照 结合临床症状、查体、血象、骨髓细胞学和血细胞化学检查，确诊为急性淋巴细胞白血病的河南汉族患者，共56例，经联合化疗缓解，停止化疗1周后抽静脉血送检。血液样品由河南医科大学第一附属医院检验科及小儿科提供。56例患者中，男性48例，女性8例，年龄范围为3～65岁；选择身体健康、年龄相近与患者无血缘关系的个体105例作为对照组。
1.2 引物设计与合成 参照Olerup等人的方案[6]设计HLA-DR1～DRw18序列特异性引物、阳性内对照引物共24个，由中国科学院上海植物生理研究所贝克曼*PMG 生物技术联合示范实验室合成。
1.3 模板DNA制备 采用酚氯仿法及快速盐析法分别从EDTA抗凝的外周静脉血分离的白细胞中提取DNA，并用紫外可见分光光度计测定DNA含量及纯度，其A(260 nm)/A(280 nm)应在1.6～2.0范围内。其具体方法如下。
, http://www.100md.com
1.3.1 样本处理:EDTA抗凝的外周静脉血4 ml,离心(1000 r/min)3 min后吸取白细胞层,加入10 ml红细胞裂解液,洗涤几次至无红色备用。
1.3.2 DNA提取
1.3.2.1 标准酚-氯仿抽提法：上述备用白细胞的一半加1.4 ml白细胞核裂解液,120 μl 100 g/L SDS和蛋白酶K(终浓度300 mg/L),37 ℃消化过夜。次日加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合物(体积比为25∶24∶1)和氯仿、异戊醇混合物(体积比为24∶1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇,-20 ℃或-80 ℃沉淀2 h,再用体积分数为70% 的冰乙醇洗1次,自然干燥,100 μl TE缓冲液溶解, 4℃冰箱贮存备用。
1.3.2.2 快速盐析法[7]:上述备用白细胞的另一半加1ml白细胞核裂解液,80μl 100g/L SDS和蛋白酶K(终浓度400mg/L),56 ℃恒温水浴消化1 h后,加入6 mol/L NaCl 300μl 剧烈振荡15～30 s,离心(10000r/min)10 min,吸取上清液0.8～1.0 ml加入冰无水乙醇2ml,上下颠倒数次至絮状DNA沉淀析出,挑出DNA放入体积分数为70%的冰乙醇洗一次,自然干燥,100μl TE缓冲液溶解,4 ℃冰箱贮存备用。
, 百拇医药
1.4 PCR-SSP基因分型 序列特异引物只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，从而通过PCR反应特异地扩增该基因片段。每一PCR反应管中反应体系为50μl，含有模板DNA 50～100 ng，TaqDNA聚合酶1.5U，dNTP各200μmol，特异性引物1μmol,阳性对照引物0.2μmol。反应条件为：94 ℃，60 s；65 ℃，60 s；72 ℃，60s。共25个循环，然后72 ℃延伸7min。
1. 5 扩增产物的检测 取10 μl加有载样缓冲液的PCR扩增产物加样至含有溴化乙锭、质量分数为2%琼脂糖凝胶中，在电压5～10 V/cm下电泳30 min后，置紫外透射仪上观察结果。
1.6 统计学处理 疾病与HLA-DRB等位基因的相关性通过相对危险率RR(Relative Risk)按Woolf公式计算:RR=ad/bc。式中a为群体中携带某一特定HLA型别的病例数;d为不携带某一特定HLA型别的对照组人数;b为不携带某一特定HLA型别的病例数;c为携带某一特定HLA型别的对照组人数。RR的显著性检验按Haldane公式计算:χ2 = (ad-bc)2N/(a+b)(c+d)(a+c)(b+d);当RR的显著性确定后，为进一步明确表示相关等位基因对疾病的作用，当RR>1时按公式EF=(RR-1)/RR×a/(a+b)计算病因分数EF。
, 百拇医药
2 结果
56例ALL患者与105例正常人HLA-DRB1等位基因频率RR值及显著性分析结果见表1。ALL患者组HLA-DR7基因频率为24.1%，表型频率为51.9%，与正常对照组比较，RR=2.56，χ2 =7.34，P<0.01；病因分数为0.29；其他HLA-DRB1基因频率在实验组与对照组相比，差异无显著性。
表1 ALL患者与正常人对照HLA-DRB1等位基因频率分布 DRB1
基因
正常对照(105例)
ALL患者(56例)
阳性例数
基因型频率/%
, 百拇医药
阳性例数
基因型频率/%
DR1
9
4.2
0
0
DR2
49
23.3
26
23.2
DR3
, http://www.100md.com
3
1.4
2
1.8
DR4
15
7.2
8
7.1
DR11(5)
13
6.2
7
, http://www.100md.com 6.3
DR12(5)
20
9.5
10
8.9
DR6
22
10.5
8
7.1
DR7
28
, 百拇医药 13.3
27
24.1*
DR8
11
5.2
1
0.01
DR9
31
14.8
16
14.3
, 百拇医药
DR10
5
2.4
0
0
*RR=2.56，χ2=7.34，P<0.01
3 讨论
ALL是第一个被发现与HLA单倍型相关的人类疾病。Walford报道A2B12单倍型在儿童ALL中的频率升高，该单倍型还与癌症家族综合征相关并在正常家族中呈现特有的分离模式[5]。Dearden等[2]采用PCR-SSCP方法对儿童普通型ALL中的HLA-DQB1的研究结果显示，DQB1*0501频率升高;Taylor等[3]报道DPB1*0201在患普通型ALL儿童中的频率是成人的2倍,约是对照婴儿的3倍;DPB1*0201/0301,/0401及/0402杂合率是对照的3～4倍，提示HLA-DPB1*0201单独或同其他DPB1等位基因一起赋予儿童普通型ALL的易感性。钱凤伟等[8]曾用血清学方法对25例ALL患者与78名正常对照进行HLA-A、B、C分型比较，显示Cw5频率增高。作者采用PCR-SSP方法在分子水平探讨了HLA-DR基因与ALL易感性的关联程度，研究结果显示，DR7频率在ALL患者组中明显升高，达24.1%,表型频率为51.9%，同对照相比，相对危险率RR＝2.56,χ2=7.34，P<0.01,病因分数为0.29,而其他基因无显著差异。结果提示, ALL与HLA-DR7关联。
, 百拇医药
不同关联的原因可能是HLA复合体中存在几个易感位点或MHC位点间连锁失衡，亦或存在疾病异质性、单倍型及超型关联。在有多个易感位点的情形中，不同位点在不同人群中占优势，进而产生与相同疾病关联的多样性。由于白血病是一多基因、多因子疾病，如不进行仔细分析，HLA关联性将被忽略，除非该病主要的易感基因与MHC连锁，否则，不可能发现很强的关联性。截止目前，尚未见以华人为对象从分子水平上研究ALL与HLA基因关联的报道。尽管本结果与钱凤伟等[8]的血清学研究结果不同，但作者首次借助PCR-SSP技术从分子水平上研究HLA-DRB1基因型与ALL的关联，为进一步探寻ALL的易感基因提供了线索。■
*河南省科技攻关基金资助项目 97120027
作者简介：曹孟德，男，35岁，博士，副教授，研究方向：HLA及肿瘤免疫学
参考文献：
, 百拇医药
[1]艾辉胜.白血病的现代诊断与分型.见: 艾辉胜，罗荣城,乐晓峰主编.现代白血病学.北京:人民军医出版社,1997.133
[2]Dearden SP, Taylor GM, Gokhale DA, et al, Molecular analysis of HLA-DQB1 alleles in childhood common acute lymphoblastic leukemia.Br J Cancer, 1996, 73:603
[3]Taylor GM,Robinson MD, Binchy A, et al. Preliminary evidence of an association between HLA-DPB10201 and childhood common acute lymphoblastic leukemia supports an infectious aetiology. Leukemia, 1995, 9:440
, http://www.100md.com
[4]Dorak MT, Owen G, Galbraith I, et al. Nature of HLA-associated predisposition to childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 1995, 9:875
[5]Walford RL. Acute childhood leukemia in relation to the HL-a human transplantation antigens.Nature,1970,225:461
[6]Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers in 2 hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens,1992,39:225
[7]Miller SA, Dykes DD, Polesky HF, et al. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res,1988,16:1215
[8]钱凤伟,叶根耀,孔繁华,等.急性淋巴细胞白血病和HLA.中华内科杂志，1986，25(4)：217
(1999-04-20收稿), http://www.100md.com
单位：曹孟德 苏堤 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)；秦东春 秦东春 岳保红 苏天水 燕桂香 盛光耀(河南医科大学第一附属医院检验科 郑州 450052)
关键词：HLA-DRB1基因；多态现象；白血病，淋巴细胞，急性
河南医科大学学报000111摘 要：目的： 探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)易感性与HLA-DRB1基因多态性之间的关联性，找出ALL的易感基因。方法：采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)DNA分型技术对56例ALL患者和105例健康对照组进行了HLA-DRB1基因分型。结果： ALL组与HLA-DR7基因关联,基因频率为24.1%，RR=2.56，χ2=7.34，P<0.01,病因分数为0.29；其他等位基因频率ALL组与对照组间差异无显著性。结论： HLA-DR7与ALL有关联。
, 百拇医药
中图分类号：R617
Association between HLA-DRB1 alleles polymorphism and susceptibility to acute lymphoblastic leukemia in a Henan Chinese population of Han nationality
CAO Mengde Su Di WANG Dongsheng
(Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
QIN Dongchun YUE Baohong SU Tianshui YAN Guixiang
, http://www.100md.com
(Clinical of Laboratory, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
SHENG Guangyao
(Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052
Abstract：Aim: In order to explore the association between HLA-DRB1 alleles polymorphism and susceptibility to acute lymphoblastic leukemia in a Henan Chinese population of Han nationality and find the susceptible genes of ALL. Methods: 105 normal people and 56 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) were carried out HLA-DRB1 genotyping analysis by polymerase chain reaction with sequence specific primers (PCR-SSP). Results: Compared with normal controls, the frequency of HLA-DR7 was significantly increased in the patient group, with a relative risk (RR) being 2.56，χ2=7.34, P<0.01 and with an etiological fraction (EF) being 0.29, while the frequencies of other DRB1 alleles were not significantly increased in the ALL group. Conclusion: These results were shown that susceptibility to ALL are strongly associated with the HLA-DR7 gene.
, http://www.100md.com
Key words：HLA-DRB1 alleles; polymorphism ;leukemia, lymphoblastic,acute▲
急性淋巴细胞白血病(ALL)的发病机制目前仍不清楚。流行病学研究认为儿童普通型ALL可能是由于儿童出生后的早期感染所引起的罕见结果[1]。决定儿童是否死于普通型ALL的因素之一是其对感染的应答情况。由于对感染的免疫应答部分处于HLA基因控制之下，因此，近年来，国外一些研究人员对急性淋巴细胞白血病与HLA基因之间的关联进行了研究，发现ALL易感性与HLA-DRB位点的等位基因密切相关[2～5],但针对华人的研究尚未见报道。作者对56例ALL患者及105例健康对照进行了HLA-DRB1的PCR-SSP基因分型研究，试图从中发现ALL易感性与HLA-DRB1基因的关系，为ALL的发病因素及早期诊断提供参考。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 病例及健康对照 结合临床症状、查体、血象、骨髓细胞学和血细胞化学检查，确诊为急性淋巴细胞白血病的河南汉族患者，共56例，经联合化疗缓解，停止化疗1周后抽静脉血送检。血液样品由河南医科大学第一附属医院检验科及小儿科提供。56例患者中，男性48例，女性8例，年龄范围为3～65岁；选择身体健康、年龄相近与患者无血缘关系的个体105例作为对照组。
1.2 引物设计与合成 参照Olerup等人的方案[6]设计HLA-DR1～DRw18序列特异性引物、阳性内对照引物共24个，由中国科学院上海植物生理研究所贝克曼*PMG 生物技术联合示范实验室合成。
1.3 模板DNA制备 采用酚氯仿法及快速盐析法分别从EDTA抗凝的外周静脉血分离的白细胞中提取DNA，并用紫外可见分光光度计测定DNA含量及纯度，其A(260 nm)/A(280 nm)应在1.6～2.0范围内。其具体方法如下。
, http://www.100md.com
1.3.1 样本处理:EDTA抗凝的外周静脉血4 ml,离心(1000 r/min)3 min后吸取白细胞层,加入10 ml红细胞裂解液,洗涤几次至无红色备用。
1.3.2 DNA提取
1.3.2.1 标准酚-氯仿抽提法：上述备用白细胞的一半加1.4 ml白细胞核裂解液,120 μl 100 g/L SDS和蛋白酶K(终浓度300 mg/L),37 ℃消化过夜。次日加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合物(体积比为25∶24∶1)和氯仿、异戊醇混合物(体积比为24∶1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇,-20 ℃或-80 ℃沉淀2 h,再用体积分数为70% 的冰乙醇洗1次,自然干燥,100 μl TE缓冲液溶解, 4℃冰箱贮存备用。
1.3.2.2 快速盐析法[7]:上述备用白细胞的另一半加1ml白细胞核裂解液,80μl 100g/L SDS和蛋白酶K(终浓度400mg/L),56 ℃恒温水浴消化1 h后,加入6 mol/L NaCl 300μl 剧烈振荡15～30 s,离心(10000r/min)10 min,吸取上清液0.8～1.0 ml加入冰无水乙醇2ml,上下颠倒数次至絮状DNA沉淀析出,挑出DNA放入体积分数为70%的冰乙醇洗一次,自然干燥,100μl TE缓冲液溶解,4 ℃冰箱贮存备用。
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1.4 PCR-SSP基因分型 序列特异引物只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，从而通过PCR反应特异地扩增该基因片段。每一PCR反应管中反应体系为50μl，含有模板DNA 50～100 ng，TaqDNA聚合酶1.5U，dNTP各200μmol，特异性引物1μmol,阳性对照引物0.2μmol。反应条件为：94 ℃，60 s；65 ℃，60 s；72 ℃，60s。共25个循环，然后72 ℃延伸7min。
1. 5 扩增产物的检测 取10 μl加有载样缓冲液的PCR扩增产物加样至含有溴化乙锭、质量分数为2%琼脂糖凝胶中，在电压5～10 V/cm下电泳30 min后，置紫外透射仪上观察结果。
1.6 统计学处理 疾病与HLA-DRB等位基因的相关性通过相对危险率RR(Relative Risk)按Woolf公式计算:RR=ad/bc。式中a为群体中携带某一特定HLA型别的病例数;d为不携带某一特定HLA型别的对照组人数;b为不携带某一特定HLA型别的病例数;c为携带某一特定HLA型别的对照组人数。RR的显著性检验按Haldane公式计算:χ2 = (ad-bc)2N/(a+b)(c+d)(a+c)(b+d);当RR的显著性确定后，为进一步明确表示相关等位基因对疾病的作用，当RR>1时按公式EF=(RR-1)/RR×a/(a+b)计算病因分数EF。
, 百拇医药
2 结果
56例ALL患者与105例正常人HLA-DRB1等位基因频率RR值及显著性分析结果见表1。ALL患者组HLA-DR7基因频率为24.1%，表型频率为51.9%，与正常对照组比较，RR=2.56，χ2 =7.34，P<0.01；病因分数为0.29；其他HLA-DRB1基因频率在实验组与对照组相比，差异无显著性。
表1 ALL患者与正常人对照HLA-DRB1等位基因频率分布 DRB1
基因
正常对照(105例)
ALL患者(56例)
阳性例数
基因型频率/%
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阳性例数
基因型频率/%
DR1
9
4.2
0
0
DR2
49
23.3
26
23.2
DR3
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3
1.4
2
1.8
DR4
15
7.2
8
7.1
DR11(5)
13
6.2
7
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DR12(5)
20
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DR6
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24.1*
DR8
11
5.2
1
0.01
DR9
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14.8
16
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DR10
5
2.4
0
0
*RR=2.56，χ2=7.34，P<0.01
3 讨论
ALL是第一个被发现与HLA单倍型相关的人类疾病。Walford报道A2B12单倍型在儿童ALL中的频率升高，该单倍型还与癌症家族综合征相关并在正常家族中呈现特有的分离模式[5]。Dearden等[2]采用PCR-SSCP方法对儿童普通型ALL中的HLA-DQB1的研究结果显示，DQB1*0501频率升高;Taylor等[3]报道DPB1*0201在患普通型ALL儿童中的频率是成人的2倍,约是对照婴儿的3倍;DPB1*0201/0301,/0401及/0402杂合率是对照的3～4倍，提示HLA-DPB1*0201单独或同其他DPB1等位基因一起赋予儿童普通型ALL的易感性。钱凤伟等[8]曾用血清学方法对25例ALL患者与78名正常对照进行HLA-A、B、C分型比较，显示Cw5频率增高。作者采用PCR-SSP方法在分子水平探讨了HLA-DR基因与ALL易感性的关联程度，研究结果显示，DR7频率在ALL患者组中明显升高，达24.1%,表型频率为51.9%，同对照相比，相对危险率RR＝2.56,χ2=7.34，P<0.01,病因分数为0.29,而其他基因无显著差异。结果提示, ALL与HLA-DR7关联。
, 百拇医药
不同关联的原因可能是HLA复合体中存在几个易感位点或MHC位点间连锁失衡，亦或存在疾病异质性、单倍型及超型关联。在有多个易感位点的情形中，不同位点在不同人群中占优势，进而产生与相同疾病关联的多样性。由于白血病是一多基因、多因子疾病，如不进行仔细分析，HLA关联性将被忽略，除非该病主要的易感基因与MHC连锁，否则，不可能发现很强的关联性。截止目前，尚未见以华人为对象从分子水平上研究ALL与HLA基因关联的报道。尽管本结果与钱凤伟等[8]的血清学研究结果不同，但作者首次借助PCR-SSP技术从分子水平上研究HLA-DRB1基因型与ALL的关联，为进一步探寻ALL的易感基因提供了线索。■
*河南省科技攻关基金资助项目 97120027
作者简介：曹孟德，男，35岁，博士，副教授，研究方向：HLA及肿瘤免疫学
参考文献：
, 百拇医药
[1]艾辉胜.白血病的现代诊断与分型.见: 艾辉胜，罗荣城,乐晓峰主编.现代白血病学.北京:人民军医出版社,1997.133
[2]Dearden SP, Taylor GM, Gokhale DA, et al, Molecular analysis of HLA-DQB1 alleles in childhood common acute lymphoblastic leukemia.Br J Cancer, 1996, 73:603
[3]Taylor GM,Robinson MD, Binchy A, et al. Preliminary evidence of an association between HLA-DPB10201 and childhood common acute lymphoblastic leukemia supports an infectious aetiology. Leukemia, 1995, 9:440
, http://www.100md.com
[4]Dorak MT, Owen G, Galbraith I, et al. Nature of HLA-associated predisposition to childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 1995, 9:875
[5]Walford RL. Acute childhood leukemia in relation to the HL-a human transplantation antigens.Nature,1970,225:461
[6]Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers in 2 hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens,1992,39:225
[7]Miller SA, Dykes DD, Polesky HF, et al. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res,1988,16:1215
[8]钱凤伟,叶根耀,孔繁华,等.急性淋巴细胞白血病和HLA.中华内科杂志，1986，25(4)：217
(1999-04-20收稿), http://www.100md.com