无胶筛分毛细管电泳在蛋白质分离中的应用
作者：张振中 吴逸明 蒋红丽 吴如金
单位：张振中(河南医科大学药学系 郑州 450052)；吴逸明(河南医科大学劳动卫生学与卫生毒理学教研室 郑州 450052)；蒋红丽(河南省卫生防疫站中心仪器室 郑州 450053)；吴如金(中国药科大学药物分析教研室 南京 210009)
关键词：HPCE；无胶筛分；蛋白质
河南医科大学学报000317 摘要 目的：运用高效毛细管电泳(HPCE)分离6种蛋白质。方法：以线性高分子聚合物聚乙二醇(PEG20000)作为筛分介质，150 mmol/L Tris-100 mmol/L CHES(pH8.7)作为运行缓冲液,运行电压20 kV。结果： 磷酸化酶B、牛血清白蛋白、肌动蛋白、碳酸酐酶、烟草花叶病毒外壳蛋白和胰蛋白酶抑制剂达到基线分离。结论：高效毛细管电泳分离生物大分子具有快速、 高效等优点。
, http://www.100md.com
分类号 O651.8
Proteins separation by non-gel sieving high performance capillary electrophoresis
ZHANG Zhenzhong,(Department of Pharmacy, Henan Medical University , Zhengzhou 450052)
WU Yiming,(Department of Occupational Health and Health Toxicology, Henan Medical University ,Zhengzhou 450052)
JIANG Hongli,( Division of Center Instrument, Henan Provincial Epidemic Prevention Station, Zhengzhou 450053)
, 百拇医药
WU Rujin
( Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University , Nanjing 210009)
Abstract Aim:To separate proteins by high performance capillary electrophoresis(HPCE). Methods:The method of polymethlene glycol (PEG20000) used as separation matrix was developed for the separation of proteins. The running buffer was composed of 150 mmol/L Tris-100 mmol/L CHES and the running voltage was 20 kV. Results: Proteins which were phosphrylase (MW 94000)，serum albumin(MW 67000)， actin(MW 43000)，carborin anlydrase(MW 30000)，Tobacco Mosaic virus shell protein(MW 17500) and trypsin inhibitor(MW 20100)were resolved successfully. Conclusion: HPCE with the characteristics of rapidity, high performance is useful to separate proteins.
, 百拇医药
Key words HPCE；non-gel sieving； proteins
毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是90年代最重要的分离分析手段之一，是当今分析化学和分析生物化学公认的前沿领域。毛细管电泳在生物工程、医学药物和食品检测等生命科学和化学所涉及的领域显示了极其重要的应用前景，也是人类进入纳米时代一种富有潜在应用价值的手段，并已在核酸、蛋白质的分析中取得了重要成果[1]。无胶筛分毛细管电泳是近几年发展起来的CE技术的一个分支，筛分介质多为线性聚丙烯酰胺，纤维素[2～4]等高分子化合物。而利用聚乙二醇(PEG)作为筛分介质国内尚未见报道。作者以PEG作为筛分介质成功分离了6种蛋白质，为毛细管电泳在蛋白质药物分析中的应用奠定了实验基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 Beckman P/ACE 5500毛细管电泳仪，二极管阵列检测器，未涂层石英毛细管47 cm×50 μm(河北省永年光导纤维厂)，磷酸化酶B(Mr＝94 000)，牛血清白蛋白(Mr 67 000)，肌动蛋白(Mr＝43 000)，碳酸酐酶(Mr 30 000)，胰蛋白酶抑制剂(Mr＝20 100)和烟草花叶病毒外壳蛋白(Mr＝17 500)均为中科院上海东风试剂厂产品；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，2-(N-环己胺)乙磺酸(CHES)和十二烷基硫酸钠(SDS)为华美生物工程公司产品；聚乙二醇(PEG20000，日本进口分装);运行缓冲液40 g/L PEG(含4.0 mmol/L SDS, 150 mmol/L Tris和100 mmol/L CHES pH 8.7)；样品缓冲液 60 mmol/L Tris (含35 mmol/L SDS, 70 mmol/L巯基乙醇，pH 6.9)。
, 百拇医药
1.2 样品预处理 在1ml离心管中加入适量蛋白质样品及样品缓冲液，盖紧盖子，置于沸水中10 min，后离心3 min，置冰箱(4 ℃)保存。
1.3 实验方法 石英毛细管分别以1 mol/L NaOH，双蒸水和运行缓冲液冲洗3 min后，以压力方式于阴极处进样，紫外检测(214 nm)，运行电压20 kV，温度为23 ℃。
2 结果与讨论
2.1 PEG质量浓度对结果的影响 PEG质量浓度对分离效果有显著影响，PEG质量浓度越高，运行缓冲液粘度越大，蛋白质出峰时间越长，甚至不出峰。PEG质量浓度为10 g/L、20 g/L 时可能由于未达到临界浓度，筛分效果较差。实验表明40 g/L为宜。
2.2 缓冲液pH值对结果的影响 缓冲液pH值影响毛细管内表面的状态，pH值较低时内表面存在大量硅羟基，与蛋白质分子相互作用容易引起峰拖尾。同时缓冲液pH值也影响蛋白质-SDS复合物的荷电状态，从而影响其迁移速度大小。实验发现在pH小于7.0的情况下分离效果较差，甚至会出现蛋白质沉淀；在pH 8.7时6种蛋白质分离情况较好(见图1)。
, 百拇医药
图1 6种蛋白质的分离图谱
1.烟草花叶病毒外壳蛋白；2.胰蛋白酶抑制剂；3.碳酸酐酶；4.肌动蛋白；5.牛血清蛋白；6.磷酸化酶B
2.3 Tris-CHES缓冲液浓度对结果的影响 随着缓冲液浓度增大，分离度逐渐变好。但浓度过大，电流增大，焦耳热增加，柱效下降。最终选定150 mmol/L Tris-100 mmol/L CHES。
2.4 工作电压对结果的影响 实验结果表明，增加工作电压，蛋白质-SDS复合物迁移速度加快，分离度增加，但超过20 kV时，焦耳热增加，柱效下降，分离度降低。实验选定恒定工作电压20 kV。
2.5 讨论 在实验条件下，无胶筛分毛细管电泳分离了6种蛋白质(图1)。其迁移规律基本符合传统经验公式U =a + blnM(其中U为电泳淌度、Mr为相对分子质量，a和b为实验常数)。自1989年Zhu等[4]提出在CE缓冲液中加入纤维素衍生物以甲基纤维素为筛分介质分离了DNA片段以来，已有诸多学者利用多种线性高分子聚合物作为筛分介质 ，用于分离分析蛋白质分子 ，在寡聚核苷酸分离和蛋白质相对分子质量测定方面取得了重要进展。PEG作为一种线性高分子聚合物，其羟基可与毛细管壁上羟基发生相互作用，减少管壁对蛋白质的吸附，提高柱效，减少峰的拖尾现象，改善峰形。由于PEG的性质随相对分子质量的不同而有差异，相对分子质量大小决定了其链的长短及筛孔径的大小。因此在实验中应根据被分离的蛋白质的相对分子质量范围选定合适的PEG，优化实验参数。
, 百拇医药
基金项目：河南省自然科学基金资助项目 204022300
研究方向：肺癌的病因、预防、早期诊断的综合治疗，E-mail:ymwu@ 371.net
作者简介：吴逸明，男，55岁，教授，博士生导师，参考文献
[1]Christoph H. Capillary electrophoresis of proteins andnucleic acids in gels and entangled polymer solutions.J Chromatography A, 1995, 698:19
[2]Singhal RP, Jun X. Separation of DNA restriction fragments by polymer-solution capillary zone electrophoresis. J Chromatography A,1993, 652:47
, 百拇医药
[3]Jochen M, Odilo M, Jan B, et al. DNA sequence analysis of Prinker-modified restriction fragments after collection from capillary electrophoresis with replaceable matrices. J Chromatography A，1996, 744:303
[4]Zhu MD, Hansen D, Burd S, et al. Factors affecting free zone electrophoresis and isoelectric focusing in Capillary Electrophoresis. J Chromatogra, 1989, 480:311
2000-01-05收稿, 百拇医药
单位：张振中(河南医科大学药学系 郑州 450052)；吴逸明(河南医科大学劳动卫生学与卫生毒理学教研室 郑州 450052)；蒋红丽(河南省卫生防疫站中心仪器室 郑州 450053)；吴如金(中国药科大学药物分析教研室 南京 210009)
关键词：HPCE；无胶筛分；蛋白质
河南医科大学学报000317 摘要 目的：运用高效毛细管电泳(HPCE)分离6种蛋白质。方法：以线性高分子聚合物聚乙二醇(PEG20000)作为筛分介质，150 mmol/L Tris-100 mmol/L CHES(pH8.7)作为运行缓冲液,运行电压20 kV。结果： 磷酸化酶B、牛血清白蛋白、肌动蛋白、碳酸酐酶、烟草花叶病毒外壳蛋白和胰蛋白酶抑制剂达到基线分离。结论：高效毛细管电泳分离生物大分子具有快速、 高效等优点。
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分类号 O651.8
Proteins separation by non-gel sieving high performance capillary electrophoresis
ZHANG Zhenzhong,(Department of Pharmacy, Henan Medical University , Zhengzhou 450052)
WU Yiming,(Department of Occupational Health and Health Toxicology, Henan Medical University ,Zhengzhou 450052)
JIANG Hongli,( Division of Center Instrument, Henan Provincial Epidemic Prevention Station, Zhengzhou 450053)
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WU Rujin
( Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University , Nanjing 210009)
Abstract Aim:To separate proteins by high performance capillary electrophoresis(HPCE). Methods:The method of polymethlene glycol (PEG20000) used as separation matrix was developed for the separation of proteins. The running buffer was composed of 150 mmol/L Tris-100 mmol/L CHES and the running voltage was 20 kV. Results: Proteins which were phosphrylase (MW 94000)，serum albumin(MW 67000)， actin(MW 43000)，carborin anlydrase(MW 30000)，Tobacco Mosaic virus shell protein(MW 17500) and trypsin inhibitor(MW 20100)were resolved successfully. Conclusion: HPCE with the characteristics of rapidity, high performance is useful to separate proteins.
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Key words HPCE；non-gel sieving； proteins
毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是90年代最重要的分离分析手段之一，是当今分析化学和分析生物化学公认的前沿领域。毛细管电泳在生物工程、医学药物和食品检测等生命科学和化学所涉及的领域显示了极其重要的应用前景，也是人类进入纳米时代一种富有潜在应用价值的手段，并已在核酸、蛋白质的分析中取得了重要成果[1]。无胶筛分毛细管电泳是近几年发展起来的CE技术的一个分支，筛分介质多为线性聚丙烯酰胺，纤维素[2～4]等高分子化合物。而利用聚乙二醇(PEG)作为筛分介质国内尚未见报道。作者以PEG作为筛分介质成功分离了6种蛋白质，为毛细管电泳在蛋白质药物分析中的应用奠定了实验基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 Beckman P/ACE 5500毛细管电泳仪，二极管阵列检测器，未涂层石英毛细管47 cm×50 μm(河北省永年光导纤维厂)，磷酸化酶B(Mr＝94 000)，牛血清白蛋白(Mr 67 000)，肌动蛋白(Mr＝43 000)，碳酸酐酶(Mr 30 000)，胰蛋白酶抑制剂(Mr＝20 100)和烟草花叶病毒外壳蛋白(Mr＝17 500)均为中科院上海东风试剂厂产品；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，2-(N-环己胺)乙磺酸(CHES)和十二烷基硫酸钠(SDS)为华美生物工程公司产品；聚乙二醇(PEG20000，日本进口分装);运行缓冲液40 g/L PEG(含4.0 mmol/L SDS, 150 mmol/L Tris和100 mmol/L CHES pH 8.7)；样品缓冲液 60 mmol/L Tris (含35 mmol/L SDS, 70 mmol/L巯基乙醇，pH 6.9)。
, 百拇医药
1.2 样品预处理 在1ml离心管中加入适量蛋白质样品及样品缓冲液，盖紧盖子，置于沸水中10 min，后离心3 min，置冰箱(4 ℃)保存。
1.3 实验方法 石英毛细管分别以1 mol/L NaOH，双蒸水和运行缓冲液冲洗3 min后，以压力方式于阴极处进样，紫外检测(214 nm)，运行电压20 kV，温度为23 ℃。
2 结果与讨论
2.1 PEG质量浓度对结果的影响 PEG质量浓度对分离效果有显著影响，PEG质量浓度越高，运行缓冲液粘度越大，蛋白质出峰时间越长，甚至不出峰。PEG质量浓度为10 g/L、20 g/L 时可能由于未达到临界浓度，筛分效果较差。实验表明40 g/L为宜。
2.2 缓冲液pH值对结果的影响 缓冲液pH值影响毛细管内表面的状态，pH值较低时内表面存在大量硅羟基，与蛋白质分子相互作用容易引起峰拖尾。同时缓冲液pH值也影响蛋白质-SDS复合物的荷电状态，从而影响其迁移速度大小。实验发现在pH小于7.0的情况下分离效果较差，甚至会出现蛋白质沉淀；在pH 8.7时6种蛋白质分离情况较好(见图1)。
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图1 6种蛋白质的分离图谱
1.烟草花叶病毒外壳蛋白；2.胰蛋白酶抑制剂；3.碳酸酐酶；4.肌动蛋白；5.牛血清蛋白；6.磷酸化酶B
2.3 Tris-CHES缓冲液浓度对结果的影响 随着缓冲液浓度增大，分离度逐渐变好。但浓度过大，电流增大，焦耳热增加，柱效下降。最终选定150 mmol/L Tris-100 mmol/L CHES。
2.4 工作电压对结果的影响 实验结果表明，增加工作电压，蛋白质-SDS复合物迁移速度加快，分离度增加，但超过20 kV时，焦耳热增加，柱效下降，分离度降低。实验选定恒定工作电压20 kV。
2.5 讨论 在实验条件下，无胶筛分毛细管电泳分离了6种蛋白质(图1)。其迁移规律基本符合传统经验公式U =a + blnM(其中U为电泳淌度、Mr为相对分子质量，a和b为实验常数)。自1989年Zhu等[4]提出在CE缓冲液中加入纤维素衍生物以甲基纤维素为筛分介质分离了DNA片段以来，已有诸多学者利用多种线性高分子聚合物作为筛分介质 ，用于分离分析蛋白质分子 ，在寡聚核苷酸分离和蛋白质相对分子质量测定方面取得了重要进展。PEG作为一种线性高分子聚合物，其羟基可与毛细管壁上羟基发生相互作用，减少管壁对蛋白质的吸附，提高柱效，减少峰的拖尾现象，改善峰形。由于PEG的性质随相对分子质量的不同而有差异，相对分子质量大小决定了其链的长短及筛孔径的大小。因此在实验中应根据被分离的蛋白质的相对分子质量范围选定合适的PEG，优化实验参数。
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基金项目：河南省自然科学基金资助项目 204022300
研究方向：肺癌的病因、预防、早期诊断的综合治疗，E-mail:ymwu@ 371.net
作者简介：吴逸明，男，55岁，教授，博士生导师，参考文献
[1]Christoph H. Capillary electrophoresis of proteins andnucleic acids in gels and entangled polymer solutions.J Chromatography A, 1995, 698:19
[2]Singhal RP, Jun X. Separation of DNA restriction fragments by polymer-solution capillary zone electrophoresis. J Chromatography A,1993, 652:47
, 百拇医药
[3]Jochen M, Odilo M, Jan B, et al. DNA sequence analysis of Prinker-modified restriction fragments after collection from capillary electrophoresis with replaceable matrices. J Chromatography A，1996, 744:303
[4]Zhu MD, Hansen D, Burd S, et al. Factors affecting free zone electrophoresis and isoelectric focusing in Capillary Electrophoresis. J Chromatogra, 1989, 480:311
2000-01-05收稿, 百拇医药