煤焦沥青诱发大鼠肺癌组织中端粒酶的表达

http://www.100md.com 《河南医科大学学报》 2000年第3期

     作者：周舫 吴逸明 李建端 陈琛 王新朝

    单位：周舫 吴逸明 陈琛 王新朝(河南医科大学劳动卫生学与卫生毒理学教研室 郑州 450052)；李建端(河南医科大学生物化学教研室 郑州 450052)

    关键词：端粒酶；煤焦沥青；肺肿瘤；诊断

    河南医科大学学报000312 摘要 目的：判断端粒酶活性在肺癌中的诊断价值。方法：将Wistar大鼠随机分为实验组17只和对照组8只，实验组采用支气管灌注煤焦沥青法诱导大鼠肺癌，用改良的TRAP银染法测定大鼠肺癌及正常组织中的端粒酶活性。结果：实验组诱发出肺癌8例，鳞状上皮化生1例，8例肺癌中有7例为端粒酶阳性(87.5%)，鳞状上皮化生的1例也为端粒酶阳性，实验组其余8例与对照组8例端粒酶均为阴性。有癌组与对照组和无癌组相比差异均有显著性(P<0.01)。结论：端粒酶较特异地表达于肺癌组织中，有望成为肺癌的诊断指标。

    分类号 R135. 2

    Expression of telomerase activity in rat lung cancer induced by coal tar pitch

    ZHOU Fang，WU Yiming，CHEN Chen，WANG Xinchao

    (Department of Occupational Health and Health Toxicology，Henan Medical University,Zhengzhou 450052)

    LI Jianduan，(Department of Biochemistry,Henah Medical University,Zhengzhou 450052)

    Abstract Aim: Judge the value of telomerase activity in the diagnosis of lung cancer. Methods: Wistar rats were random allocated into two groups:17 in the experimental group and 8 in the control one.Use the animal model of rat lung cancer induced by coal tar pitch(CTP) Perfusion, with the modified TRAP(telomerase reaction amplification protocol) silver- staining method to examine the telomerase activity of the rat lung cancer and normal tissues. Results: 8 of 17 in the experimental group were induced to lung cancer,also there was 1 speciman with squamous metaplasia, 7of 8 lung cancer were telomerase positive (87.5%) and the one with squamous metaplasia was telomerase positive too. the other 8 of experimental group and the whole 8 of control group were all telomerase negative. the cancer group was significantly different with either non-cancer group or control group (P<0.01).Conclusion: Telomerase activity could be detected in the lung cancer specifically,it could be a hopeful index in the diagnosis of lung cancer.

    Key words telomerase；Coal Tar Pitch； lung neoplasm；diagnosis

    肺癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率和死亡率有不断上升的趋势。但目前临床上尚缺乏普查、筛选肺癌早期患者的简便易行的有效手段。端粒与端粒酶是近来分子生物学研究的热点之一，端粒的存在对维持染色体的结构完整性至关重要。多篇报道显示端粒酶与肿瘤细胞的永生性有密切的关系，它极有可能成为肿瘤的一种最具普遍意义的标志酶^[1]。大量流行病学和动物实验表明煤焦沥青能引起肺癌^[2]。作者采用大鼠支气管灌注煤焦沥青法诱导大鼠肺癌的动物模型，应用改良的TRAP银染法测定大鼠肺癌、正常组织中端粒酶的表达，探索将端粒酶测定应用于肺癌早期诊断和职业高危人群筛查的可能性，以期建立一种适用于人群普查筛选早期肺癌患者的简便易行的有效方法。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 初断乳Wistar大鼠25只，河南医科大学实验动物中心提供。

    1.2 大鼠肺癌的诱发及肺标本采集处理 动物定期称重，观察一般情况，注意抗感染处理，检疫2周后随机分成2组，实验组17只，对照组8只。分别对实验组和对照组灌注0.2 ml(质量浓度为160 g/L)的煤焦沥青玉米油悬液和炭粉玉米油悬液，每隔7～10 d灌注1次，共灌注6次，累计灌注量192 mg。染毒后6个月颈动脉放血法处死大鼠，对肺脏同时取2份标本，1份置Ep管中放入液氮中保存，1份留做病理切片检查。标本处理：取液氮保存的新鲜组织(10～100 mg)于500 μl 冻洗液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8),1.5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L KCl₂,1 mmol/L BME(二巯基乙醇)]冲洗1次(4 ℃，5 000 r/min,5 min), 加20～200 μl冻解液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5), 1 mmol/L MgCl₂, 1 mmol/L EGTA, 0.1 mmol/L PMSF, 5 mmol/L BME,5 g/L CHAPS,体积分数为10%的甘油，DEPC水]匀浆，0 ℃孵化30 min后，离心(4 ℃，16 000 r/min，10 min)。 吸出上层液体即为端粒酶提取物，留2 μl用考马斯亮兰G-250蛋白定量法进行蛋白定量。根据定量结果， 将组织提取物用冻解液稀释至同一质量浓度3 mg/L，迅速存于液氮中。

    1.3 端粒酶活性测定 端粒重复序列扩增(TRAP)反应^[3，4]: 5 μl 10×PCR缓冲液[0.3 mol/L Tris-HCl(pH 8.4), 15 mmol/L MgCl₂, 50 mmol/L BME,0.63 mol/L KCl,5 mmol/L EGTA,5 g/L NP 40,1 g/L明胶]，0.1 μg TS引物，5 μl 500 μmol/L 4×dNTP，DEPC水加至总体积46 μl。提取物加入PCR 缓冲体系中，50 μl石蜡封闭，25 ℃孵化20 min，反应液预热至90 ℃ 1 min，迅速将0.1 μg CX引物，3 u Taq DNA聚合酶，透过石蜡层加入管底，移入基因扩增仪循环31次(94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，最后延伸5 min)。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳^[5]: 以0.5×TBE(0.045 mol/L Tris硼酸，0.001 mol/L EDTA)为电泳缓冲液，在150 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(280 V,3 h)。银染, 观察结果。

    1.4 统计方法 用SAS统计软件进行统计分析处理。采用修正过的χ²检验，检验水准取0.05。

    2 结果

    2.1 煤焦沥青诱癌结果 实验组17只中有8只诱发出肺癌，其中鳞癌7例，腺癌1例，其余9例中有1例出现鳞状上皮化生，余未见异常。8例对照组中有1例出现腺体增生，余无异常。

    2.2 端粒酶活性表达情况 8例肺癌组织中7例端粒酶阳性表达(87.5%)，鳞状上皮化生的1例也为端粒酶阳性表达，实验组中未诱发出肺癌者和对照组均为端粒酶阴性表达。将实验组分为有癌组和无癌组，有癌组与对照组、无癌组相比差异均有显著性(P<0.01)。

    3 讨 论

    端粒是真核细胞染色体末端的重复DNA序列，其生物学功能是防止染色体DNA降解、末端融合、非正常重组和染色体缺失。此外，端粒DNA重复序列可以在染色体末端提供可消耗的非编码程序，解决了DNA半保留复制的“末端复制问题”^[6] 。这些生物功能表明端粒功能与基因表达有关。端粒酶在肺癌中表达情况的研究已有许多报道，如Lee等^[7]用TRAP 方法同时检测了肺癌细胞系、癌组织及正常组织中的端粒酶活性，结果100%的细胞系、78 %的癌组织有端粒酶阳性表达，而正常肺组织为端粒酶阴性表达。Hiyama等^[8]的研究结果表明端粒酶活性检测不仅在肺癌的诊断中有价值，并且还可能是肺部免疫性疾病的一个标志。Fujiwara等^[9]研究了不同分化程度的肺腺癌中端粒酶活性和染色体畸变情况，证实端粒酶活性与肺癌的分化程度有关，分化程度越差，端粒酶阳性率越高。可见，端粒酶还可能是判断肿瘤恶性程度的一个因子。Hiyama等^[10]也指出端粒酶特异表达于肺癌组织，在临床肺癌诊断中将是十分有用的新标志酶，且其活性水平可能与某些生化特性有关。

    全国肿瘤普查和各地的调查表明，焦油和沥青作业工人恶性肿瘤，尤其是肺癌发生率明显高于一般人群^[11]。因此，作者采用煤焦沥青诱发大鼠肺癌的动物模型进行研究， 煤焦沥青中大量的多环芳烃(PAHs)及其代谢产物可最终结合于细胞DNA 鸟苷N-7，诱导G-T颠换，与ras点突变的机制类似^[12]。 分析有可能是其激活了ras基因，而ras基因的激活出现于职业肺癌发病过程中的早期并且是发病的关键环节。ras的激活与P53，Rb等的失活是肿瘤发生的重要基础。对本实验中端粒酶激活的原理根据有关资料作如下推测：端粒在细胞分裂和老化中逐渐缩短，当缩短到一定程度时，由于位于端粒下游的染色质上先前受抑制的基因解除抑制或由于含有减少重复片段的端粒末端缺乏保护造成的DNA损伤刺激，或两者共同作用， 产生引发细胞衰老的第一个死亡阶段(M₁期)，这时，由于ras基因突变或合并抑癌基因的突变，使细胞越过M₁期继续分裂，端粒继续缩短而达到危机点M₂(crisis)，并将导致细胞死亡。在M₂期双着丝粒染色体形成频率提高，增加了染色体不分离的机率，对转变为突变等位基因的纯合分化起作用。一旦野生型等位基因的有效部分被排除，端粒酶活性解除抑制，极少数细胞由此而越过M₂进入永生化，转化为癌细胞^[13]。

    由本次实验结果可见，在煤焦沥青诱发出的大鼠肺癌标本中，端粒酶有高特异性的表达，其检出率(87.5%)与国外报道(80.1%)基本相近^[14]， 而在正常组织中却基本不表达或表达很低。在本实验中，有癌组与无癌组、对照组相比，其端粒酶阳性表达均有显著性差异(P<0.01)，而无癌组与对照组虽然灌注药物不同，但二者的端粒酶表达却无明显差异，这就进一步说明了端粒酶在职业性诱癌因素的作用下仍特异性表达于肿瘤组织，提示其极有可能成为诊断职业性肺癌的一个特异而灵敏的指标。同时，作者还注意到，在出现鳞状上皮化生的1例肺组织中也出现了端粒酶阳性表达，提示在肺癌的多阶段病理发生过程中端粒酶的异常表达可能发生在早期阶段。Miura等^[15] 用多种化学致癌物诱导大鼠肿瘤并动态观察在肿瘤发生的多个阶段中端粒酶活性的表达情况，发现在用药后立即出现端粒酶激活，推断端粒酶激活发生在早期阶段，这与作者的推断是吻合的。由以上论述可见，端粒酶活性测定很可能是职业性肺癌诊断中一个很有价值的预报因子，至于其是否有希望成为一个肺癌高危人群筛查的早期指标，仍有待进一步的研究。

    基金项目：河南省自然科学基金资助项目 97330001，984020300

    研究方向：肺癌的病因学、预防、早期诊断和综合治疗，E-mail：ymwu@371.net

    作者简介：吴逸明，男，55岁，教授，博士生导师，参考文献

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    2000-01-05收稿

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/29/65/746.htm