8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因表达的影响
作者：陈奎生 欧阳松云 姜国忠 高冬玲 张云汉 马利军 孙培宗
单位：陈奎生 姜国忠 高冬玲 张云汉(河南医科大学病理教研室 郑州 450052)；欧阳松云 马利军 孙培宗(河南医科大学一附院呼吸内科 郑州 450052)
关键词：8-Br-cAMP；细胞凋亡；原位杂交
河南医科大学学报000327 摘要 目的：观察8-Br-cAMP对人肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因表达的影响。方法：将体外培育的NSCLC-3细胞分为实验组和对照组，采用原位杂交方法观察8-Br-cAMP对NSCLC-3细胞c-myc、bcl-2基因表达的影响。结果：8-Br-cAMP处理后的实验组较未加8-Br-cAMP的对照组c-myc、bcl-2基因表达降低(P<0.01)。结论：8-Br-cAMP可下调与NSCLC-3细胞凋亡相关的c-myc、bcl-2基因表达。
, http://www.100md.com
分类号 R329.28
Effects of 8-Br-cAMP on expression of related apoptotic gene in human lung cancer NSCLC-3 cell line
CHEN Kuisheng,JIANG Guozhong,GAO Dongling,ZHANG Yunhan,(Department of Pathology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
OUYANG Songyun,MA Lijun,SUN Peizong
(Department of Respiratory Medicine ，the First Affiliated Hospi-tal,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
, 百拇医药
Abstract Aim: To observe the effects of 8-Br-cAMP on expression of the related apoptotic gene in human lung cancer NSCLC-3 cells.Methods： The cultured NSCLC-3 cells in vitro were divided into the experimental and the control groups.The effects of 8-Br-cAMP on expression of c-myc and bcl-2 in NSCLC-3 cells were observed by in situ hybridization.Results:The expression of c-myc and bcl-2 in the experimental group was weaker than that in the control group(P<0.01).Conclusion： 8-Br-cAMP could suppress the related apoptotic gene expression of c-myc and bcl-2 in NSCLC-3 cells.
, 百拇医药
Key words 8-Br-cAMP;cell apoptosis;in situ hybridization
8-溴-环腺苷酸(8-Bromo-cyclic 3',5'-adenosine monophosphate,8-Br-cAMP)可通过与DNA结合的cAMP受体位点的选择性结合，诱导细胞分化、凋亡，抑制恶性肿瘤生长[1]。有报道与8-Br-cAMP同属cAMP类似物的8-Cl-cAMP可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡[2]。但8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因表达的影响罕见报道。作者采用原位杂交方法观察8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞c-myc、bcl-2基因表达的影响，为探索治疗肺癌的新途径提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 NSCLC-3细胞株(上海肿瘤研究所提供)；8-Br-cAMP(Sigma公司)。
, 百拇医药
1.2 方法 将NSCLC-3细胞培养于RPMI-1640加体积分数为10%的胎牛血清中，传代贴壁培养，待细胞将铺满时，分为2组。①实验组：加终浓度为10-5mol/L的8-Br-cAMP培养24 h；②对照组：不加8-Br-cAMP培养24 h。胰蛋白酶消化后滴于预处理过的载玻片上；晾干后，多聚甲醛固定；经未加探针的预杂交后；加含探针(1 mg/L)的杂交液于43℃，杂交3 h；生物素-链霉亲和素和碱性磷酸酶显色体系[3]显色。油镜下观察原位杂交信号，以信号强弱进行分级评分，按评分积分值，进行两样本均数t检验。
2 结果
NSCLC-3细胞c-myc、bcl-2基因表达的定位：原位杂交阳性信号为蓝紫色颗粒，位于NSCLC-3细胞胞质中。
经8-Br-cAMP处理后的实验组比未经8-Br-cAMP处理的对照组c-myc、bcl-2基因表达减弱。原位杂交积分值经统计学处理，实验组和对照组相比差异有显著性(P<0.01)，见表1。
, 百拇医药
表1 8-Br-cAMP对NSCLC-3
细胞c-myc、bcl-2基因表达的影响 组别
c-myc
bcl-2
实验组
205±12
181±18
对照组
303±16
256±22
t值
2.16
, 百拇医药
2.01
2组比较，P值均<0.01
3 讨论
8-Br-cAMP为cAMP类似物，可通过与DNA结合的cAMP受体位点的选择性结合，诱导细胞分化，抑制恶性肿瘤生长。有文献报道：8-Br-cAMP在抑制一些肿瘤细胞生长的同时，可下调c-fos、c-jun、H-ras基因表达[4]。作者曾观察了8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞生长相关基因表达的影响，结果发现8-Br-cAMP可下调EGFR、c-myc、H-ras、突变型p53基因表达；上调野生型p53表达[5]。为探讨8-Br-cAMP抑制肿瘤细胞生长、促进其分化、诱导肿瘤细胞凋亡的广谱性，作者观察了8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因的影响。
c-myc基因在肺癌癌细胞中过度表达，与肺癌癌细胞的过度增殖关系密切。研究表明c-myc基因既有促进细胞增殖，又有诱导细胞凋亡的双重作用，主要是促进细胞增殖，一旦细胞增殖功能发生障碍，c-myc基因即启动细胞凋亡[6]。Zhao等[7]应用反义RNA技术使与食管癌EC8712细胞生长相关的c-myc基因表达下调，且诱导细胞凋亡。本实验结果表明，8-Br-cAMP可下调肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因c-myc基因的表达。
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bcl-2为第一个公认的人体细胞长寿基因，它抑制细胞死亡而不是刺激细胞增殖，并可直接抑制细胞凋亡。通过诱导bcl-2基因过度表达以延长重要细胞的寿命或降低bcl-2表达以促进肿瘤细胞凋亡，为临床分子药物设计提供了诱人的前景。本实验结果表明8-Br-cAMP可下调肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因bcl-2基因表达，为肺癌治疗提供了理论依据。
8-Br-cAMP下调肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关c-myc、bcl-2基因表达，可否促进NSCLC-3细胞凋亡，有待进一步研究。关于8-Br-cAMP调控c-myc、bcl-2基因表达的机制，尚不十分清楚，可能是c-myc、bcl-2基因上游有CRE(cAMP-responsive elem-ent)位点，8-Br-cAMP通过CRE调控其表达。
基金项目：河南省教委自然科学基金资助课题 1999320011
研究方向：肿瘤分子生物学
, 百拇医药
作者简介：陈奎生，男，35岁，硕士，讲师，参考文献
[1]Chen TC,Hinton DR,Zidovetzki,et al.Up-regulation of the cAMP/PKA pathway inhibits proliferation,induces differentiation,and leads to apoptosis in malignant gliomas.Lab lnvest,1998 ,78(2):165
[2]Bse R,Gjertsen BT,Dskeland SO,et al. 8-chloro-cAMP induces apoptotic cell death in a human mammary carcinoma cell (MCF-7)line.British J of Cancer,1995,72:1 151
[3]Blake MS.A rapid sensitive method for detection of alkaline phosphases conjugated anti-antibody on western blots.Anal Biochem,1984,136(1):175
, http://www.100md.com
[4]Peluso JJ,Luciano AM,Pappalardo A,et al.Cellular and molecular mechanisms that mediate insulin-dependent rat granulosa cell mitosis.Biol Reprod,1995,52(1):124
[5]陈奎生，郑乃刚，吴景兰，等.8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞生长相关基因表达的影响.解剖学报，1999，30(3)：227
[6]牛富文主编.医用分子细胞生物学.郑州：河南医科大学出版社，1996.263
[7]Zhao X,Wang X,Zhou C,et al.Abrupt reduction of c-myc expression by antisense RNA inducing terminal diffentiation and apoptosis of human esophageal cancer cell line.Sci China B,1995,38(5):580
1999-07-02收稿, 百拇医药
单位：陈奎生 姜国忠 高冬玲 张云汉(河南医科大学病理教研室 郑州 450052)；欧阳松云 马利军 孙培宗(河南医科大学一附院呼吸内科 郑州 450052)
关键词：8-Br-cAMP；细胞凋亡；原位杂交
河南医科大学学报000327 摘要 目的：观察8-Br-cAMP对人肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因表达的影响。方法：将体外培育的NSCLC-3细胞分为实验组和对照组，采用原位杂交方法观察8-Br-cAMP对NSCLC-3细胞c-myc、bcl-2基因表达的影响。结果：8-Br-cAMP处理后的实验组较未加8-Br-cAMP的对照组c-myc、bcl-2基因表达降低(P<0.01)。结论：8-Br-cAMP可下调与NSCLC-3细胞凋亡相关的c-myc、bcl-2基因表达。
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分类号 R329.28
Effects of 8-Br-cAMP on expression of related apoptotic gene in human lung cancer NSCLC-3 cell line
CHEN Kuisheng,JIANG Guozhong,GAO Dongling,ZHANG Yunhan,(Department of Pathology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
OUYANG Songyun,MA Lijun,SUN Peizong
(Department of Respiratory Medicine ，the First Affiliated Hospi-tal,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
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Abstract Aim: To observe the effects of 8-Br-cAMP on expression of the related apoptotic gene in human lung cancer NSCLC-3 cells.Methods： The cultured NSCLC-3 cells in vitro were divided into the experimental and the control groups.The effects of 8-Br-cAMP on expression of c-myc and bcl-2 in NSCLC-3 cells were observed by in situ hybridization.Results:The expression of c-myc and bcl-2 in the experimental group was weaker than that in the control group(P<0.01).Conclusion： 8-Br-cAMP could suppress the related apoptotic gene expression of c-myc and bcl-2 in NSCLC-3 cells.
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Key words 8-Br-cAMP;cell apoptosis;in situ hybridization
8-溴-环腺苷酸(8-Bromo-cyclic 3',5'-adenosine monophosphate,8-Br-cAMP)可通过与DNA结合的cAMP受体位点的选择性结合，诱导细胞分化、凋亡，抑制恶性肿瘤生长[1]。有报道与8-Br-cAMP同属cAMP类似物的8-Cl-cAMP可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡[2]。但8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因表达的影响罕见报道。作者采用原位杂交方法观察8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞c-myc、bcl-2基因表达的影响，为探索治疗肺癌的新途径提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 NSCLC-3细胞株(上海肿瘤研究所提供)；8-Br-cAMP(Sigma公司)。
, 百拇医药
1.2 方法 将NSCLC-3细胞培养于RPMI-1640加体积分数为10%的胎牛血清中，传代贴壁培养，待细胞将铺满时，分为2组。①实验组：加终浓度为10-5mol/L的8-Br-cAMP培养24 h；②对照组：不加8-Br-cAMP培养24 h。胰蛋白酶消化后滴于预处理过的载玻片上；晾干后，多聚甲醛固定；经未加探针的预杂交后；加含探针(1 mg/L)的杂交液于43℃，杂交3 h；生物素-链霉亲和素和碱性磷酸酶显色体系[3]显色。油镜下观察原位杂交信号，以信号强弱进行分级评分，按评分积分值，进行两样本均数t检验。
2 结果
NSCLC-3细胞c-myc、bcl-2基因表达的定位：原位杂交阳性信号为蓝紫色颗粒，位于NSCLC-3细胞胞质中。
经8-Br-cAMP处理后的实验组比未经8-Br-cAMP处理的对照组c-myc、bcl-2基因表达减弱。原位杂交积分值经统计学处理，实验组和对照组相比差异有显著性(P<0.01)，见表1。
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表1 8-Br-cAMP对NSCLC-3
细胞c-myc、bcl-2基因表达的影响 组别
c-myc
bcl-2
实验组
205±12
181±18
对照组
303±16
256±22
t值
2.16
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2.01
2组比较，P值均<0.01
3 讨论
8-Br-cAMP为cAMP类似物，可通过与DNA结合的cAMP受体位点的选择性结合，诱导细胞分化，抑制恶性肿瘤生长。有文献报道：8-Br-cAMP在抑制一些肿瘤细胞生长的同时，可下调c-fos、c-jun、H-ras基因表达[4]。作者曾观察了8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞生长相关基因表达的影响，结果发现8-Br-cAMP可下调EGFR、c-myc、H-ras、突变型p53基因表达；上调野生型p53表达[5]。为探讨8-Br-cAMP抑制肿瘤细胞生长、促进其分化、诱导肿瘤细胞凋亡的广谱性，作者观察了8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因的影响。
c-myc基因在肺癌癌细胞中过度表达，与肺癌癌细胞的过度增殖关系密切。研究表明c-myc基因既有促进细胞增殖，又有诱导细胞凋亡的双重作用，主要是促进细胞增殖，一旦细胞增殖功能发生障碍，c-myc基因即启动细胞凋亡[6]。Zhao等[7]应用反义RNA技术使与食管癌EC8712细胞生长相关的c-myc基因表达下调，且诱导细胞凋亡。本实验结果表明，8-Br-cAMP可下调肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因c-myc基因的表达。
, http://www.100md.com
bcl-2为第一个公认的人体细胞长寿基因，它抑制细胞死亡而不是刺激细胞增殖，并可直接抑制细胞凋亡。通过诱导bcl-2基因过度表达以延长重要细胞的寿命或降低bcl-2表达以促进肿瘤细胞凋亡，为临床分子药物设计提供了诱人的前景。本实验结果表明8-Br-cAMP可下调肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因bcl-2基因表达，为肺癌治疗提供了理论依据。
8-Br-cAMP下调肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关c-myc、bcl-2基因表达，可否促进NSCLC-3细胞凋亡，有待进一步研究。关于8-Br-cAMP调控c-myc、bcl-2基因表达的机制，尚不十分清楚，可能是c-myc、bcl-2基因上游有CRE(cAMP-responsive elem-ent)位点，8-Br-cAMP通过CRE调控其表达。
基金项目：河南省教委自然科学基金资助课题 1999320011
研究方向：肿瘤分子生物学
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作者简介：陈奎生，男，35岁，硕士，讲师，参考文献
[1]Chen TC,Hinton DR,Zidovetzki,et al.Up-regulation of the cAMP/PKA pathway inhibits proliferation,induces differentiation,and leads to apoptosis in malignant gliomas.Lab lnvest,1998 ,78(2):165
[2]Bse R,Gjertsen BT,Dskeland SO,et al. 8-chloro-cAMP induces apoptotic cell death in a human mammary carcinoma cell (MCF-7)line.British J of Cancer,1995,72:1 151
[3]Blake MS.A rapid sensitive method for detection of alkaline phosphases conjugated anti-antibody on western blots.Anal Biochem,1984,136(1):175
, http://www.100md.com
[4]Peluso JJ,Luciano AM,Pappalardo A,et al.Cellular and molecular mechanisms that mediate insulin-dependent rat granulosa cell mitosis.Biol Reprod,1995,52(1):124
[5]陈奎生，郑乃刚，吴景兰，等.8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞生长相关基因表达的影响.解剖学报，1999，30(3)：227
[6]牛富文主编.医用分子细胞生物学.郑州：河南医科大学出版社，1996.263
[7]Zhao X,Wang X,Zhou C,et al.Abrupt reduction of c-myc expression by antisense RNA inducing terminal diffentiation and apoptosis of human esophageal cancer cell line.Sci China B,1995,38(5):580
1999-07-02收稿, 百拇医药