HCV侵染患者外周血单个核细胞后对细胞免疫功能的影响
作者：王健 张荣波 许礼发 蔡茹
单位：安徽省淮南工业学院医学分院病原学与免疫学教研室，淮南 232001
关键词：肝炎；丙型；免疫学；单核细胞；T淋巴细胞亚群；受体；白细胞介素2；免疫；细胞；聚合酶链反应
安徽医科大学学报990209
摘要 目的 探讨丙型病毒性肝炎(丙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)HCV-RNA(+)后对其细胞免疫功能的影响及其在丙肝发病机制中的作用。方法 以RT-PCR法检测135例丙肝患者PBMC内HCV-RNA，同时用生物素—链霉亲和素(BSA)系统检测其T细胞亚群及经PHA诱导前后膜白介素-2受体(mIL-2R)的表达水平。结果 丙肝患者与正常对照相比，CD+3、CD+4及mIL-2R表达水平降低，CD+8水平增高，差异均有显著性(P<0.01) 。PBMC内HCV-RNA(+)组与HCV-RNA(-)组相比较，前者CD+3、CD+4 百分率降低，CD+8百分率增高，CD+4/CD+8比值下降均大于后者，差异有显著性(P<0.05)。PHA诱导前后HCV-RNA (+)者明显低于HCV-RNA(-)者，mIL-2R表达水平亦以患者低于正常对照(P<0.05)。结论 丙肝患者细胞免疫功能低下，病毒侵染PBMC后可加重患者的细胞免疫功能紊乱，抑制mIL-2R表达，使病情迁延反复。检测丙肝患者PBMC内HCV-RNA对揭示丙肝发病机制及其防治均有重要意义。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R512.63
The influence of PBMC infected by HCV on the
function of cellular immunity
Wang Jian, Zhang Rongbo, Xu Lifa et al
(Dept of Etiology and Immunology, Medical College of Huainan
Industry University, Huainan Anhui 232001)
Abstract Objective To study the function of cellular immunity after being infected by HCV in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in patients with hepatitis C and effect on pathogenesis of hepatitis C. Methods HCV-RNA was detected by reverse transcription nested polymerase chain reaction(RT-PCR) from PBMC in 135 cases of hepatitis C, and the expressive level of T cell subsets and membrane interleukin-2 receptor(mIL-2R) before or after PHA inducement were detected by biotin-streptavidin(BSA) system. Results The levels of CD3, CD4 and mIR-2R were all lower and CD8 was higher in patients with hepatitis C than in normal control (P<0.01). It was lower in positive HCV-RNA than in non-positive HCV-RNA in PBMC. The levels of mIL-2R before and after PHA inducement were both significantly lower in patients with hepatitis C than those in normal control(P<0.05). It was significantly lower in positive HCV-RNA than that in nonpositive HCV-RNA. Conclusion The function of cellular immunity was lower obviously in patients with hepatitis C. Infection of HCV in PBMC could cause the disorder of cellular immunity function, and restrained the expression of mIL-2R and made the patient's condition deferment or relapse.Detection of HCV-RNA in PBMC in patients with hepatitis C could help us explain the pathogenesis of hepatitis C,which showed significance for the prevention and treatment of Hepatitis C.
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MeCH hepatitis C/immunol;monocyted;T-lymphocyte subsets;receptors,interleukin-2;immunity,cellular;polymerase chain reaction.
丙型病毒性肝炎(丙肝)是一种严重危害人类身心健康的传染性疾病，其发病机制十分复杂。以往文献〔1〕表明，丙肝的发病主要与患者的细胞免疫功能有关。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)为免疫活性细胞的集合体，富含T淋巴细胞，其在机体抗HCV感染中起极为重要的作用。本研究用RT-PCR法检测丙肝患者PBMC内HCV-RNA，同时用生物素—链霉亲和素(Biotin-streptavidin，BSA)系统测定其CD+3、CD+4、CD+8 百分率及PHA诱导前后膜白介素-2受体(membrane interleukin-2 receptor, mIL-2R)表达水平，以评价HCV侵染PBMC后对细胞免疫功能的影响，探讨其在丙肝发病机制中的作用。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 135例丙肝患者系本院门诊部及附属医院、教学医院1995年1月～1998年7月治疗的患者，并经ELISA法筛选抗-HCV(+)。患者中急性丙肝31例，慢性丙肝104例，临床诊断参照1990年全国第6届肝炎会议修订的诊断标准。其中男88例，女47例，平均年龄34.5岁。另选取中心血站20名体检正常献血员为正常对照，其中男14例，女6例，平均年龄30岁。
1.2 试剂 HCV-RNA诊断试剂盒购自上海华美生物工程公司，批号950210。T细胞亚群及mIL-2R诊断试剂盒购自上海思创生化电子有限公司。淋巴细胞分离液购自上海生化试剂二厂，批号：941026。1640培养粉为USA产品。
1.3 方法 T细胞亚群及mIL-2R检测参照朱睛晖、王健等方法〔2，3〕。PBMC内HCV-RNA检测以淋巴细胞分离液常规分离出PBMC，用灭菌Hank液洗涤3次，调整细胞数至1×109.L-1, 取100 μl细胞悬液加等量裂解液，混匀后置37℃温箱中裂解20 min后镜检， 细胞裂解充分后参照常规血清HCV-RNA方法进行检测，另以20名正常献血员PBMC悬液同法裂解，做HCV-RNA检测，探讨是否存在由于裂解液对细胞自身DNA作用所致的假阳性，每次检测设空白、阴性、阳性对照各1孔。引物选自HCV-RNA基因组5′编码区(5′-NC)，最终扩增片段长度为194 bp 。第1次PCR扩增在逆转录酶作用下进行cDNA合成，扩增条件为94℃预处理4 min，以后依次为94℃ 40 s、55℃ 40 s 、72℃ 1 min , 循环30次，将cDNA产物立即进行第2次PCR，扩增条件为94℃预处理4 min，以后依次为94℃ 50 s、55℃ 40 s、72℃ 90 s ，循环35次。扩增产物经含2% EB的琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察结果，出现与阳性对照一致者判为阳性。
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2 结果
经RT-PCR对135例丙肝患者PBMC检测，发现有56例HCV-RNA(+)，说明HCV易侵犯患者PBMC。T细胞是一种多功能的细胞群体，当HCV侵染时，受染的各T细胞亚群出现不同形式改变(见表1)，并可影响PHA对其mIL-2R的诱导反应(见表2)。
表1 丙肝患者T细胞亚群检测结果(
±s, %) 类型
n
CD+3
CD+4
CD+8
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CD+4/CD+8
正常对照
20
66.85±7.20
48.35±6.56
30.45±4.88
1.61±0.42
丙肝
135
61.21±8.46**
40.88±7.07**
, 百拇医药
35.14±6.32**
1.19±0.55**
PBMC内HCV-RNA(+)
56
58.73±8.75**△
39.28±6.84**△
36.33±5.67**△
1.06±0.59**△
PBMC内HCV-RNA(-)
79
, 百拇医药
62.20±8.36**
42.03±7.25**
33.92±6.89*
1.28±0.53**
与正常对照相比：*P<0.05, **P<0.01； PBMC内HCV-RNA(+)与PBMC内HCV-RNA(-)相比：△P<0.05
表2 PBMC经PHA诱导前后mIL-2R 表达水平(±s,%) 类型
n
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mIL-2R
静息期
诱导期
正常对照
20
4.36±1.50
36.72±3.10
丙肝
135
3.22±1.89*
33.62±3.85*
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PBMC内HCV-RNA(+)
56
2.84±1.94**
32.06±3.94**
PBMC内HCV-RNA(-)
79
3.58±1.87△
34.15±3.78△
与正常对照相比：*P<0.05, **P<0.01； PBMC内HCV-RNA(+)与PBMC内HCV-RNA(-)相比： △P<0.05
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3 讨论
HCV-RNA是HCV侵染的直接证据，当HCV侵染PBMC后，可以在细胞质、细胞核、核仁中复制增殖〔4，5〕，直接影响细胞内的各种代谢，这无疑会对其正常功能表达产生影响。BSA是一种新型酶免疫检测系统，具有较好的特异性和敏感性〔3〕。本研究用BSA系统对135例丙肝患者检测发现，其CD+3、CD+4降低，CD+8增高，CD+4/CD+8比值下降，与正常对照相比，差异有显著性(P<0.01)，与以往文献〔6〕报道基本一致。表明丙肝患者体内存在明显细胞免疫功能低下，其中PBMC内HCV-RNA(+)与PBMC内HCV-RNA(-)相比，亦CD+3、CD+4降低，CD+8增高，CD+4/CD+8比值下降，差异有显著性(P<0.05)。提示丙肝患者T细胞亚群改变不仅与HCV感染有关，也与HCV是否感染PBMC密切相关，HCV侵染PBMC后可进一步加重患者细胞免疫功能紊乱。
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CD+3通常代表总T细胞，其减少反映患者抗病毒免疫应答功能部分缺损。CD+4代表Th/Ti，具有诱导B细胞产生抗体、诱导抑制性T细胞产生和分泌IL-2的功能，CD+4减少可能是机体免疫失调的结果，与机体不能及时清除HCV有关。CD+8代表Ts/Tc，具有抑制B细胞产生抗体，对Ⅰ类MHC抗原的靶细胞产生细胞毒作用。CD+8升高可造成肝细胞持续性破坏，是引起临床上ALT持续性增高的原因之一。CD+4/CD+8的比例关系是机体免疫调控网络的重要枢纽。生理状态下，二者相互协调、相互制约，处于动态平衡。当CD+4降低，通常代表Th辅助功能下降；而CD+8增高，表明Tc参与活动性肝病的肝损伤，它既限制了机体对HCV的体液免疫应答，也限制了机体对HCV感染肝细胞的细胞免疫应答，导致HCV在肝细胞内持续存在。HCV对PBMC中的CD+3、CD+4、CD+8等T细胞普通易感〔4〕，并与宿主细胞发生整合，干扰这些细胞的正常代谢，这不仅不利于HCV的清除，而且抑制CD+3、CD+4等细胞免疫活性的表达，呈现细胞免疫功能减弱的表现〔7〕。同时CD+8增高，易造成肝细胞周围的CD+8浸润，CD+4/CD+8比例失调是免疫调控紊乱的结果。本研究结果显示，CD+4/CD+8比例下降，以CD+4下降更为显著，而PBMC内HCV-RNA(+)者，CD+4降低并伴有CD+8显著升高，这是导致丙肝患者病情迁延反复、久治难愈的原因之一。
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mIL-2R是T细胞活化的重要标志〔8〕。丙肝患者mIL-2R表达水平在PHA诱导前低于正常对照，差异有显著性(P<0.05)，且以PBMC内HCV-RNA(+)者更明显；而PBMC内HCV-RNA(-)者较轻，与正常对照相比，差异无显著性(P>0.05)。提示HCV感染不仅对T细胞表面的mIL-2R有抑制作用，而且HCV感染PBMC后，这种抑制作用更加明显。用PHA诱导PBMC 72 h后，再次检测其表达水平，发现其mIL-2R水平较静息状态明显增高，但与正常对照相比，差异仍有显著性(P<0.05)，且以PBMC内HCV-RNA(+)者更显著(P<0.01)。提示丙肝患者PBMC对PHA的诱导反应能力下降，同时经PHA诱导后，HCV对mIL-2R同样有抑制作用。本研究表明：一方面，HCV感染T细胞后，使启动T细胞活化信号减弱，mIL-2R表达能力下降，T细胞的自分泌效应降低，使其抗HCV的能力削弱。另一方面，IL-2R受HCV等抗原物质的慢性刺激，可使膜上的IL-2R脱落入血，形成可溶性IL-2R，即sIL-2R(Soluble interlekin-2 receptor) ,其和mIL-2R竞争性与血清中游离IL-2结合，中和活化T细胞周围的IL-2,形成负反馈调节，减弱T细胞的自分泌和旁分泌效应，加重丙肝患者的免疫调节功能紊乱〔9〕，上述两方面共同作用，使HCV感染持续化。
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HCV具有嗜肝细胞性，亦可肝外感染〔10〕。本研究用RT-PCR法对丙肝患者PBMC进行HCV-RNA检测，证实确有HCV-RNA存在。同时对20名体检正常献血员同步检测，结果均为阴性，排除因裂解液对细胞自身DNA或RNA所致的假阳性，保证检测的特异性。PBMC内HCV-RNA(+)是肝外感染的直接证据，其与肝细胞内HCV-RNA有密切关系。当肝细胞内HCV-RNA消失时，PBMC内HCV-RNA数量也减少，故对许多暂不具备开展肝穿术条件者，通过PBMC内HCV-RNA检测能间接反映肝细胞内HCV-RNA存在。目前检测HCV-RNA大多以患者血清为标本，对HCV暂不释放入血的肝内外感染不易检出，具有一定的局限性。PBMC来源多，分离提纯较方便，对其内HCV-RNA检测是对血清HCV-RNA的一个重要补充，有利于提高HCV检测的阳性率，同时进行免疫功能检测有利于阐明丙肝患者细胞免疫功能紊乱的机制，是考核疗效、判断愈后的有价值指标。
综上所述：丙肝患者体内存在明显细胞免疫功能低下，HCV感染PBMC后可进一步加重患者细胞免疫功能紊乱。PBMC作为HCV复制的另一场所，与丙肝慢性化有关。平行测定丙肝患者T细胞亚群、mIL-2R 和PBMC内HCV-RNA，对揭示丙肝患者细胞免疫功能低下的病因及其疗效判定、预后判断均有重要意义。
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基金项目：煤炭部高校青年科学基金项目(编号96-072)
作者简介：王 健，男，37岁，讲师，教研室副主任
参考文献
1 叶维法，钟振义. 肝病免疫学. 天津：天津科学技术出版社,1997:302～307
2 朱睛晖,陆俊茜,吴海辉等. 用BSA系统免疫细胞化学法检测人外周血T和B淋巴细胞群. 上海医学检验杂志,1993;8(4):201～211
3 王 健,祁新兰. BSA系统检测慢性乙肝患者T淋巴细胞亚群. 皖南医学院学报,1997;16(1):5～7
4 Müller HM, Pfaff E,Goesser T et al. Peripheral leakocytes serve as a possible extrahepatic site for hepatitis C virus replication. J Gen Virol,1993;74(4):669～676
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5 Muratori L,Giostra F,Catalcta M et al. Testing for hepatitis C virus sequence in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic hepatitis C in the absence of serum hepatitis C virus RNA. Lever, 1994;14(3):124～128
6 章幼奕. 丙型肝炎病毒感染外周血淋巴细胞亚群变化及意义. 临床肝胆病杂志, 1993;9(4):212～213
7 Willems M, Peerlinck K, Moshage H et al. Hepatitis C virus-RNA in plasma and in peripheral blood mononuclear cells of hemophiliacs with chronic hepatitis C: evidence for viral replication in peripheral blood mononuclear cells. J Med Virol,1994;42(3):272～278
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8 王 健,李朝品. HBV感染乙肝患者PBMC后对细胞免疫功能的影响. 中国人兽共患病杂志,1998;14(6):90～92
9 叶红军,杨世忠,李 石等. 可溶性白介素-2受体在慢性乙型肝炎中的意义及其升高机理初探. 中华消化杂志,1994;14(1):86
10 Yun ZB, Sonnerborg A, Weiland O et al. Hepatitis C virus replication in liver and peripheral blood mononuclear cells of interferon-α-treated and untreated patients with chronic hepatitis C. Scand J Gastroenterol, 1994;29(1):82～86
1998-09-10收稿，1998-12-30修回, http://www.100md.com
单位：安徽省淮南工业学院医学分院病原学与免疫学教研室，淮南 232001
关键词：肝炎；丙型；免疫学；单核细胞；T淋巴细胞亚群；受体；白细胞介素2；免疫；细胞；聚合酶链反应
安徽医科大学学报990209
摘要 目的 探讨丙型病毒性肝炎(丙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)HCV-RNA(+)后对其细胞免疫功能的影响及其在丙肝发病机制中的作用。方法 以RT-PCR法检测135例丙肝患者PBMC内HCV-RNA，同时用生物素—链霉亲和素(BSA)系统检测其T细胞亚群及经PHA诱导前后膜白介素-2受体(mIL-2R)的表达水平。结果 丙肝患者与正常对照相比，CD+3、CD+4及mIL-2R表达水平降低，CD+8水平增高，差异均有显著性(P<0.01) 。PBMC内HCV-RNA(+)组与HCV-RNA(-)组相比较，前者CD+3、CD+4 百分率降低，CD+8百分率增高，CD+4/CD+8比值下降均大于后者，差异有显著性(P<0.05)。PHA诱导前后HCV-RNA (+)者明显低于HCV-RNA(-)者，mIL-2R表达水平亦以患者低于正常对照(P<0.05)。结论 丙肝患者细胞免疫功能低下，病毒侵染PBMC后可加重患者的细胞免疫功能紊乱，抑制mIL-2R表达，使病情迁延反复。检测丙肝患者PBMC内HCV-RNA对揭示丙肝发病机制及其防治均有重要意义。
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中国图书资料分类法分类号 R512.63
The influence of PBMC infected by HCV on the
function of cellular immunity
Wang Jian, Zhang Rongbo, Xu Lifa et al
(Dept of Etiology and Immunology, Medical College of Huainan
Industry University, Huainan Anhui 232001)
Abstract Objective To study the function of cellular immunity after being infected by HCV in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in patients with hepatitis C and effect on pathogenesis of hepatitis C. Methods HCV-RNA was detected by reverse transcription nested polymerase chain reaction(RT-PCR) from PBMC in 135 cases of hepatitis C, and the expressive level of T cell subsets and membrane interleukin-2 receptor(mIL-2R) before or after PHA inducement were detected by biotin-streptavidin(BSA) system. Results The levels of CD3, CD4 and mIR-2R were all lower and CD8 was higher in patients with hepatitis C than in normal control (P<0.01). It was lower in positive HCV-RNA than in non-positive HCV-RNA in PBMC. The levels of mIL-2R before and after PHA inducement were both significantly lower in patients with hepatitis C than those in normal control(P<0.05). It was significantly lower in positive HCV-RNA than that in nonpositive HCV-RNA. Conclusion The function of cellular immunity was lower obviously in patients with hepatitis C. Infection of HCV in PBMC could cause the disorder of cellular immunity function, and restrained the expression of mIL-2R and made the patient's condition deferment or relapse.Detection of HCV-RNA in PBMC in patients with hepatitis C could help us explain the pathogenesis of hepatitis C,which showed significance for the prevention and treatment of Hepatitis C.
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MeCH hepatitis C/immunol;monocyted;T-lymphocyte subsets;receptors,interleukin-2;immunity,cellular;polymerase chain reaction.
丙型病毒性肝炎(丙肝)是一种严重危害人类身心健康的传染性疾病，其发病机制十分复杂。以往文献〔1〕表明，丙肝的发病主要与患者的细胞免疫功能有关。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)为免疫活性细胞的集合体，富含T淋巴细胞，其在机体抗HCV感染中起极为重要的作用。本研究用RT-PCR法检测丙肝患者PBMC内HCV-RNA，同时用生物素—链霉亲和素(Biotin-streptavidin，BSA)系统测定其CD+3、CD+4、CD+8 百分率及PHA诱导前后膜白介素-2受体(membrane interleukin-2 receptor, mIL-2R)表达水平，以评价HCV侵染PBMC后对细胞免疫功能的影响，探讨其在丙肝发病机制中的作用。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 135例丙肝患者系本院门诊部及附属医院、教学医院1995年1月～1998年7月治疗的患者，并经ELISA法筛选抗-HCV(+)。患者中急性丙肝31例，慢性丙肝104例，临床诊断参照1990年全国第6届肝炎会议修订的诊断标准。其中男88例，女47例，平均年龄34.5岁。另选取中心血站20名体检正常献血员为正常对照，其中男14例，女6例，平均年龄30岁。
1.2 试剂 HCV-RNA诊断试剂盒购自上海华美生物工程公司，批号950210。T细胞亚群及mIL-2R诊断试剂盒购自上海思创生化电子有限公司。淋巴细胞分离液购自上海生化试剂二厂，批号：941026。1640培养粉为USA产品。
1.3 方法 T细胞亚群及mIL-2R检测参照朱睛晖、王健等方法〔2，3〕。PBMC内HCV-RNA检测以淋巴细胞分离液常规分离出PBMC，用灭菌Hank液洗涤3次，调整细胞数至1×109.L-1, 取100 μl细胞悬液加等量裂解液，混匀后置37℃温箱中裂解20 min后镜检， 细胞裂解充分后参照常规血清HCV-RNA方法进行检测，另以20名正常献血员PBMC悬液同法裂解，做HCV-RNA检测，探讨是否存在由于裂解液对细胞自身DNA作用所致的假阳性，每次检测设空白、阴性、阳性对照各1孔。引物选自HCV-RNA基因组5′编码区(5′-NC)，最终扩增片段长度为194 bp 。第1次PCR扩增在逆转录酶作用下进行cDNA合成，扩增条件为94℃预处理4 min，以后依次为94℃ 40 s、55℃ 40 s 、72℃ 1 min , 循环30次，将cDNA产物立即进行第2次PCR，扩增条件为94℃预处理4 min，以后依次为94℃ 50 s、55℃ 40 s、72℃ 90 s ，循环35次。扩增产物经含2% EB的琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察结果，出现与阳性对照一致者判为阳性。
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2 结果
经RT-PCR对135例丙肝患者PBMC检测，发现有56例HCV-RNA(+)，说明HCV易侵犯患者PBMC。T细胞是一种多功能的细胞群体，当HCV侵染时，受染的各T细胞亚群出现不同形式改变(见表1)，并可影响PHA对其mIL-2R的诱导反应(见表2)。
表1 丙肝患者T细胞亚群检测结果(
±s, %) 类型n
CD+3
CD+4
CD+8
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CD+4/CD+8
正常对照
20
66.85±7.20
48.35±6.56
30.45±4.88
1.61±0.42
丙肝
135
61.21±8.46**
40.88±7.07**
, 百拇医药
35.14±6.32**
1.19±0.55**
PBMC内HCV-RNA(+)
56
58.73±8.75**△
39.28±6.84**△
36.33±5.67**△
1.06±0.59**△
PBMC内HCV-RNA(-)
79
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62.20±8.36**
42.03±7.25**
33.92±6.89*
1.28±0.53**
与正常对照相比：*P<0.05, **P<0.01； PBMC内HCV-RNA(+)与PBMC内HCV-RNA(-)相比：△P<0.05
表2 PBMC经PHA诱导前后mIL-2R 表达水平(
±s,%) 类型n
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mIL-2R
静息期
诱导期
正常对照
20
4.36±1.50
36.72±3.10
丙肝
135
3.22±1.89*
33.62±3.85*
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PBMC内HCV-RNA(+)
56
2.84±1.94**
32.06±3.94**
PBMC内HCV-RNA(-)
79
3.58±1.87△
34.15±3.78△
与正常对照相比：*P<0.05, **P<0.01； PBMC内HCV-RNA(+)与PBMC内HCV-RNA(-)相比： △P<0.05
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3 讨论
HCV-RNA是HCV侵染的直接证据，当HCV侵染PBMC后，可以在细胞质、细胞核、核仁中复制增殖〔4，5〕，直接影响细胞内的各种代谢，这无疑会对其正常功能表达产生影响。BSA是一种新型酶免疫检测系统，具有较好的特异性和敏感性〔3〕。本研究用BSA系统对135例丙肝患者检测发现，其CD+3、CD+4降低，CD+8增高，CD+4/CD+8比值下降，与正常对照相比，差异有显著性(P<0.01)，与以往文献〔6〕报道基本一致。表明丙肝患者体内存在明显细胞免疫功能低下，其中PBMC内HCV-RNA(+)与PBMC内HCV-RNA(-)相比，亦CD+3、CD+4降低，CD+8增高，CD+4/CD+8比值下降，差异有显著性(P<0.05)。提示丙肝患者T细胞亚群改变不仅与HCV感染有关，也与HCV是否感染PBMC密切相关，HCV侵染PBMC后可进一步加重患者细胞免疫功能紊乱。
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CD+3通常代表总T细胞，其减少反映患者抗病毒免疫应答功能部分缺损。CD+4代表Th/Ti，具有诱导B细胞产生抗体、诱导抑制性T细胞产生和分泌IL-2的功能，CD+4减少可能是机体免疫失调的结果，与机体不能及时清除HCV有关。CD+8代表Ts/Tc，具有抑制B细胞产生抗体，对Ⅰ类MHC抗原的靶细胞产生细胞毒作用。CD+8升高可造成肝细胞持续性破坏，是引起临床上ALT持续性增高的原因之一。CD+4/CD+8的比例关系是机体免疫调控网络的重要枢纽。生理状态下，二者相互协调、相互制约，处于动态平衡。当CD+4降低，通常代表Th辅助功能下降；而CD+8增高，表明Tc参与活动性肝病的肝损伤，它既限制了机体对HCV的体液免疫应答，也限制了机体对HCV感染肝细胞的细胞免疫应答，导致HCV在肝细胞内持续存在。HCV对PBMC中的CD+3、CD+4、CD+8等T细胞普通易感〔4〕，并与宿主细胞发生整合，干扰这些细胞的正常代谢，这不仅不利于HCV的清除，而且抑制CD+3、CD+4等细胞免疫活性的表达，呈现细胞免疫功能减弱的表现〔7〕。同时CD+8增高，易造成肝细胞周围的CD+8浸润，CD+4/CD+8比例失调是免疫调控紊乱的结果。本研究结果显示，CD+4/CD+8比例下降，以CD+4下降更为显著，而PBMC内HCV-RNA(+)者，CD+4降低并伴有CD+8显著升高，这是导致丙肝患者病情迁延反复、久治难愈的原因之一。
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mIL-2R是T细胞活化的重要标志〔8〕。丙肝患者mIL-2R表达水平在PHA诱导前低于正常对照，差异有显著性(P<0.05)，且以PBMC内HCV-RNA(+)者更明显；而PBMC内HCV-RNA(-)者较轻，与正常对照相比，差异无显著性(P>0.05)。提示HCV感染不仅对T细胞表面的mIL-2R有抑制作用，而且HCV感染PBMC后，这种抑制作用更加明显。用PHA诱导PBMC 72 h后，再次检测其表达水平，发现其mIL-2R水平较静息状态明显增高，但与正常对照相比，差异仍有显著性(P<0.05)，且以PBMC内HCV-RNA(+)者更显著(P<0.01)。提示丙肝患者PBMC对PHA的诱导反应能力下降，同时经PHA诱导后，HCV对mIL-2R同样有抑制作用。本研究表明：一方面，HCV感染T细胞后，使启动T细胞活化信号减弱，mIL-2R表达能力下降，T细胞的自分泌效应降低，使其抗HCV的能力削弱。另一方面，IL-2R受HCV等抗原物质的慢性刺激，可使膜上的IL-2R脱落入血，形成可溶性IL-2R，即sIL-2R(Soluble interlekin-2 receptor) ,其和mIL-2R竞争性与血清中游离IL-2结合，中和活化T细胞周围的IL-2,形成负反馈调节，减弱T细胞的自分泌和旁分泌效应，加重丙肝患者的免疫调节功能紊乱〔9〕，上述两方面共同作用，使HCV感染持续化。
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HCV具有嗜肝细胞性，亦可肝外感染〔10〕。本研究用RT-PCR法对丙肝患者PBMC进行HCV-RNA检测，证实确有HCV-RNA存在。同时对20名体检正常献血员同步检测，结果均为阴性，排除因裂解液对细胞自身DNA或RNA所致的假阳性，保证检测的特异性。PBMC内HCV-RNA(+)是肝外感染的直接证据，其与肝细胞内HCV-RNA有密切关系。当肝细胞内HCV-RNA消失时，PBMC内HCV-RNA数量也减少，故对许多暂不具备开展肝穿术条件者，通过PBMC内HCV-RNA检测能间接反映肝细胞内HCV-RNA存在。目前检测HCV-RNA大多以患者血清为标本，对HCV暂不释放入血的肝内外感染不易检出，具有一定的局限性。PBMC来源多，分离提纯较方便，对其内HCV-RNA检测是对血清HCV-RNA的一个重要补充，有利于提高HCV检测的阳性率，同时进行免疫功能检测有利于阐明丙肝患者细胞免疫功能紊乱的机制，是考核疗效、判断愈后的有价值指标。
综上所述：丙肝患者体内存在明显细胞免疫功能低下，HCV感染PBMC后可进一步加重患者细胞免疫功能紊乱。PBMC作为HCV复制的另一场所，与丙肝慢性化有关。平行测定丙肝患者T细胞亚群、mIL-2R 和PBMC内HCV-RNA，对揭示丙肝患者细胞免疫功能低下的病因及其疗效判定、预后判断均有重要意义。
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基金项目：煤炭部高校青年科学基金项目(编号96-072)
作者简介：王 健，男，37岁，讲师，教研室副主任
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1998-09-10收稿，1998-12-30修回, http://www.100md.com