抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及其鉴定
作者：黄升海 史百芬 王明丽 张咏南 胡 勇 汪红俊
单位：安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032
关键词：呼吸道合胞病毒；抗体；单克隆；分离和提纯；鉴定
安徽医科大学学报990303
摘要 目的 制备抗呼吸道合胞病毒(RSV)的单克隆抗体，并对其特性进行系统地鉴定。方法 以活的RSV-Long株滴鼻(TCID50为1×10-6，取100TCID50 0.125 ml进行)加RSV感染Hep-2细胞(CPE达
～
)腹腔注射免疫Balb/c鼠，用细胞融合技术制备能稳定分泌抗RSV的单克隆抗体细胞株。结果 细胞融合一次成功，融合率为96%，抗RSV抗体阳性孔率为65%。鉴定1株杂交瘤细胞F3株，染色体数为98条，抗体亚类属IgG1，对RSV抗原特异；在无补体存在的情况下其腹水抗体中和效价为1∶128，且具融合抑制活性，腹水融合抑制效价为1∶64。结论 F3株单克隆抗体为抗RSV F蛋白的McAb。
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中国图书资料分类法分类号 R725.6； R392.11
Preparation and identification of monoclonal
antibody against respiratory syncytial virus
Huang Shenghai, Shi Baifen, Wang Minli et al
(Dept of Aetiology, Anhui Medical Univesity, Hefei 230032)
Abstract Objective To establish the monoclonal antibody (McAb) against respiratory syncytial virus(RSV) and to identify its properties. Methods BALB/c mice were immunized with live RSV-Long strain intranasally, and enhanced with Hep-2 cells infected RSV intraperitoneally. SP2/0 cells were fused with the spleen cells harvested from Balb/c mice. Results Cells were fused successfully only by one time, the fusion rate was 96 percent and the positive rate was 65 percent. F3 strain hybridoma cells could secret McAb against RSV specifically, the McAb type belonged to IgG1 subtype. It had activities of neutralization and fusing-inhibition and its neutralizing and fusing-inhibition titres of ascite fluids of mice were 1∶128 and 1∶64 respectively. Conclusion The antibody of F3 strain is anti-RSV-F McAb.
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MeSH respiratory syncytial viruses; antibodies monoclonal/isol
呼吸道合胞病毒(RSV)属副粘病毒科肺炎病毒属，结构复杂，是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染，特别是婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的最重要的病原〔1〕，目前尚无有效的防治措施，因此深入研究其结构与功能的关系意义重大。单克隆抗体(McAb)技术的应用，大大促进了对RSV颗粒蛋白的认识。我室成功地建立了4株能稳定分泌抗RSV单克隆抗体的细胞株，并对其中1株(F3株)进行了系统鉴定，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 建株 RSV-Long株(A亚型)、R6武汉地方株(B亚型)及Hep-2细胞均购自湖北省预防医学科学院病毒所，3株RSV分离株由本室自患儿咽拭子(标本由省立医院儿科供)分离获得。麻疹病毒、腺病毒3型及7型抗原购自北京解放军262医院实验科。HRP-羊抗小鼠IgG(工作浓度1∶300)、FITC-兔抗小鼠IgG(工作浓度1∶10)均购自上海华美生物工程公司。其他材料为本室自备。
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选8周龄Balb/c♀鼠(安徽省医学科学研究所供，皖医实动准字第02号)，以RSV-Long株活病毒滴鼻作基础免疫。10天后用RSV感染Hep-2细胞腹腔注射，3周后再以固定法加强免疫1次，3天后取脾细胞与SP 2/0细胞融合。细胞融合参照文献〔2〕方法进行。以间接ELISA筛选抗体阳性孔，并按有限稀释法进行，连续3次克隆化和亚克隆化培养。取3×106个杂交瘤细胞注入7天前已预先注射硅胶H的Balb/c鼠腹腔〔3〕，10天后抽取腹水。
图1 F3株抗RSV McAb的融合抑制试验结果
a:Hep-2细胞对照， b:1∶64稀释腹水， c:病毒对照
1.2 F3株抗RSV McAb的鉴定 分别以间接ELISA和间接免疫荧光法(IFA)测定杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价；以微量中和试验测定腹水中和效价，按Reed-Muench法计算；间接ELISA作RSV McAb的特异性鉴定；以Western-blot和融合抑制试验作F3株抗RSV McAb所识别的病毒特异性多肽鉴定。Western-blot中电泳及转印系统均为Pharmacia产品，操作按仪器所附操作手册进行，参照Laemmli〔4〕和Towbin等〔5〕方法稍作改进。融合抑制试验参照West等〔6〕方法并作改动：先将Hep-2细胞接种于40孔微孔细胞培养板，待长成单层后每孔接种100 TCID50 RSV-Long株病毒0.2 ml,37℃中吸附1 h，甩去上清以PBS洗2次，依次加入无血清维持液作2倍系列稀释的F3株腹水，每一稀释度均做3孔，并作相应的细胞和病毒对照。37℃ 36 h后甩去上清，由两位操作者同时观察结果，以细胞对照记1+，病毒对照记4+，合胞体产生2+的稀释度作为腹水的融合抑制效价。固定，染色，拍照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 建株结果 细胞融合一次成功，融合率为96%。经间接ELISA筛选，抗RSV抗体阳性孔占65%(125/192)，挑选4株强阳性孔进行克隆化培养，并选其中F3株杂交瘤进行3次连续克隆化及亚克隆化培养，经液氮冻存3个月后复苏传代，并连续体外培养3个月以上，细胞生长良好，均稳定分泌抗RSV抗体，且效价不变。行Balb/c鼠腹腔接种，均产生腹水，而且产量较高。
2.2 鉴定结果
2.2.1 一般鉴定 细胞培养上清及腹水抗体效价，ELISA分别为1∶16和1∶16384，IFA分别为1∶16和1∶10 000；在无补体存在下腹水中和效价为1∶128；染色体鉴定，F3株杂交瘤细胞染色体数为98条；经标准亚类抗血清鉴定，抗体类型为IgG1亚类。
, 百拇医药 2.2.2 特异性鉴定 ①F3株抗RSV McAb能与不同株RSV抗原反应(包括Long株、R6地方株和本室分离株)，②与麻疹病毒、腺病毒3型及7型抗原均无交叉反应，③设Hep-2细胞、SP 2/0细胞、培养液等对照均为阴性，④以鼠抗RSV多克隆抗体血清与RSV抗原结合后，再加入RSV McAb则不起反应。
2.2.3 融合抑制试验 经证明F3株抗RSV MaAb具融合抑制活力，能有效地抑制已受染细胞的融合，使之不能形成明显的合胞体，腹水融合抑制效价为1∶64，重复3孔，结果均一致。见图1。但经数次Western-blot检测，我们未能发现任何与该McAb反应的RSV蛋白多肽。
3 讨论
RSV极不稳定，组织培养中病毒产量很低，给制备高滴度的RSV抗原及病毒纯化带来很大困难。在单克隆抗体制备过程中，用我们的方法免疫Balb/c鼠，程序简便节省，无需纯化病毒及抗原，也不需要大量繁殖病毒，且细胞融合率较高，一次融合成功，较其他方法〔7〕优越。本研究采用间接ELISA筛选抗RSV抗体阳性孔，方法简便，快速，敏感，特异性强，可早期筛除抗细胞成分的细胞株。经检测显示，F3株McAb只与RSV抗原呈特异性反应，与其它病毒抗原、Hep-2细胞、SP 2/0细胞等均不反应，可被RSV免疫鼠血清所封闭，证实该McAb是抗RSV特异性单克隆抗体。我们用硅胶H预处理Balb/c鼠，F3株细胞均可产生腹水，腹水产量高、澄清，且动物存活时间长，可反复抽取腹水，与文献〔3〕报道一致。
, 百拇医药
RSV为有膜病毒，其包膜上的F蛋白(即融合蛋白)可致RSV的融合病变，形成多核巨细胞。F蛋白很少变异，各株间有50%抗原相关〔8〕，也是RSV最重要的保护性抗原，国内尚未见抗RSV McAb融合抑制试验的报道。我们制备的F3株McAb具中和活性和融合抑制活性，在无补体存在下其腹水中和效价为1∶128，融合抑制效价为1∶64，且能与各株RSV抗原反应〔9〕，我们认为F3株McAb应为抗RSV F蛋白的单抗，况且抑制受染细胞融合正是抗RSV F蛋白单抗本身的特性。但在Western-blot中此McAb不能与相应结构蛋白反应，其原因可能有：①RSV抗原在制备及SDS处理过程中，抗原决定簇构象发生改变；②RSV抗原含量太少，经电泳转印后难以呈明显的可见反应。为明确F3株McAb所识别的RSV特异性多肽，需进一步提高RSV蛋白含量，改进转印方法或作免疫沉淀法等。但我们认为在这种情况下增加融合抑制试验以鉴定单抗的性质，有一定实用价值，且经济方便。
, 百拇医药
基金项目：安徽省教委资助课题，编号95JL0079
作者简介：黄升海，男，31岁，讲师，硕士
史百芬，女，53岁，副教授，硕士生导师
参考文献
1 Selwyn BJ. The epidemiology of acute respiratory tract infection in young children: comparison of findings from several developing countries. J Infect Dis, 1990;12(4)：870～888
2 顾方舟，曹逸云，董德祥等译. 病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993：561～570
, 百拇医药
3 曾瑞云，王 红，周 芸等. 单克隆抗体的制备——不同诱导剂预处理小鼠的比较.上海第二医科大学学报，1994；14(27)：135～137
4 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970;227(5221)：680～685
5 Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophorecti transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA, 1979;76(9):4 350～4 354
, 百拇医药
6 West WH, Lounsbach GR, Bourgeois C et al. Biological activity, binding site and affinity of monoclonal antibodies to the fusion protein of respiratory syncytial virus. J Gen Virol, 1993;75(10):2 813～2 819
7 段佩若，赵一博，赵 华等. 抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及临床应用. 中华医学杂志， 1989；69(3)：174～175
8 廖清亚，田慕贞. 人类呼吸道合胞病毒的抗原变异. 国外医学微生物学分册，1993；16(5)：204～206
9 Walsh EE, Hruska J. Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus protein: Identification of the Fusion Protein. J Virol, 1983;47(1):171～177
1999-03-03收稿，1999-06-10修回, http://www.100md.com
单位：安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032
关键词：呼吸道合胞病毒；抗体；单克隆；分离和提纯；鉴定
安徽医科大学学报990303
摘要 目的 制备抗呼吸道合胞病毒(RSV)的单克隆抗体，并对其特性进行系统地鉴定。方法 以活的RSV-Long株滴鼻(TCID50为1×10-6，取100TCID50 0.125 ml进行)加RSV感染Hep-2细胞(CPE达
～)腹腔注射免疫Balb/c鼠，用细胞融合技术制备能稳定分泌抗RSV的单克隆抗体细胞株。结果 细胞融合一次成功，融合率为96%，抗RSV抗体阳性孔率为65%。鉴定1株杂交瘤细胞F3株，染色体数为98条，抗体亚类属IgG1，对RSV抗原特异；在无补体存在的情况下其腹水抗体中和效价为1∶128，且具融合抑制活性，腹水融合抑制效价为1∶64。结论 F3株单克隆抗体为抗RSV F蛋白的McAb。, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R725.6； R392.11
Preparation and identification of monoclonal
antibody against respiratory syncytial virus
Huang Shenghai, Shi Baifen, Wang Minli et al
(Dept of Aetiology, Anhui Medical Univesity, Hefei 230032)
Abstract Objective To establish the monoclonal antibody (McAb) against respiratory syncytial virus(RSV) and to identify its properties. Methods BALB/c mice were immunized with live RSV-Long strain intranasally, and enhanced with Hep-2 cells infected RSV intraperitoneally. SP2/0 cells were fused with the spleen cells harvested from Balb/c mice. Results Cells were fused successfully only by one time, the fusion rate was 96 percent and the positive rate was 65 percent. F3 strain hybridoma cells could secret McAb against RSV specifically, the McAb type belonged to IgG1 subtype. It had activities of neutralization and fusing-inhibition and its neutralizing and fusing-inhibition titres of ascite fluids of mice were 1∶128 and 1∶64 respectively. Conclusion The antibody of F3 strain is anti-RSV-F McAb.
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MeSH respiratory syncytial viruses; antibodies monoclonal/isol
呼吸道合胞病毒(RSV)属副粘病毒科肺炎病毒属，结构复杂，是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染，特别是婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的最重要的病原〔1〕，目前尚无有效的防治措施，因此深入研究其结构与功能的关系意义重大。单克隆抗体(McAb)技术的应用，大大促进了对RSV颗粒蛋白的认识。我室成功地建立了4株能稳定分泌抗RSV单克隆抗体的细胞株，并对其中1株(F3株)进行了系统鉴定，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 建株 RSV-Long株(A亚型)、R6武汉地方株(B亚型)及Hep-2细胞均购自湖北省预防医学科学院病毒所，3株RSV分离株由本室自患儿咽拭子(标本由省立医院儿科供)分离获得。麻疹病毒、腺病毒3型及7型抗原购自北京解放军262医院实验科。HRP-羊抗小鼠IgG(工作浓度1∶300)、FITC-兔抗小鼠IgG(工作浓度1∶10)均购自上海华美生物工程公司。其他材料为本室自备。
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选8周龄Balb/c♀鼠(安徽省医学科学研究所供，皖医实动准字第02号)，以RSV-Long株活病毒滴鼻作基础免疫。10天后用RSV感染Hep-2细胞腹腔注射，3周后再以固定法加强免疫1次，3天后取脾细胞与SP 2/0细胞融合。细胞融合参照文献〔2〕方法进行。以间接ELISA筛选抗体阳性孔，并按有限稀释法进行，连续3次克隆化和亚克隆化培养。取3×106个杂交瘤细胞注入7天前已预先注射硅胶H的Balb/c鼠腹腔〔3〕，10天后抽取腹水。
图1 F3株抗RSV McAb的融合抑制试验结果
a:Hep-2细胞对照， b:1∶64稀释腹水， c:病毒对照
1.2 F3株抗RSV McAb的鉴定 分别以间接ELISA和间接免疫荧光法(IFA)测定杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价；以微量中和试验测定腹水中和效价，按Reed-Muench法计算；间接ELISA作RSV McAb的特异性鉴定；以Western-blot和融合抑制试验作F3株抗RSV McAb所识别的病毒特异性多肽鉴定。Western-blot中电泳及转印系统均为Pharmacia产品，操作按仪器所附操作手册进行，参照Laemmli〔4〕和Towbin等〔5〕方法稍作改进。融合抑制试验参照West等〔6〕方法并作改动：先将Hep-2细胞接种于40孔微孔细胞培养板，待长成单层后每孔接种100 TCID50 RSV-Long株病毒0.2 ml,37℃中吸附1 h，甩去上清以PBS洗2次，依次加入无血清维持液作2倍系列稀释的F3株腹水，每一稀释度均做3孔，并作相应的细胞和病毒对照。37℃ 36 h后甩去上清，由两位操作者同时观察结果，以细胞对照记1+，病毒对照记4+，合胞体产生2+的稀释度作为腹水的融合抑制效价。固定，染色，拍照。
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2 结果
2.1 建株结果 细胞融合一次成功，融合率为96%。经间接ELISA筛选，抗RSV抗体阳性孔占65%(125/192)，挑选4株强阳性孔进行克隆化培养，并选其中F3株杂交瘤进行3次连续克隆化及亚克隆化培养，经液氮冻存3个月后复苏传代，并连续体外培养3个月以上，细胞生长良好，均稳定分泌抗RSV抗体，且效价不变。行Balb/c鼠腹腔接种，均产生腹水，而且产量较高。
2.2 鉴定结果
2.2.1 一般鉴定 细胞培养上清及腹水抗体效价，ELISA分别为1∶16和1∶16384，IFA分别为1∶16和1∶10 000；在无补体存在下腹水中和效价为1∶128；染色体鉴定，F3株杂交瘤细胞染色体数为98条；经标准亚类抗血清鉴定，抗体类型为IgG1亚类。
, 百拇医药 2.2.2 特异性鉴定 ①F3株抗RSV McAb能与不同株RSV抗原反应(包括Long株、R6地方株和本室分离株)，②与麻疹病毒、腺病毒3型及7型抗原均无交叉反应，③设Hep-2细胞、SP 2/0细胞、培养液等对照均为阴性，④以鼠抗RSV多克隆抗体血清与RSV抗原结合后，再加入RSV McAb则不起反应。
2.2.3 融合抑制试验 经证明F3株抗RSV MaAb具融合抑制活力，能有效地抑制已受染细胞的融合，使之不能形成明显的合胞体，腹水融合抑制效价为1∶64，重复3孔，结果均一致。见图1。但经数次Western-blot检测，我们未能发现任何与该McAb反应的RSV蛋白多肽。
3 讨论
RSV极不稳定，组织培养中病毒产量很低，给制备高滴度的RSV抗原及病毒纯化带来很大困难。在单克隆抗体制备过程中，用我们的方法免疫Balb/c鼠，程序简便节省，无需纯化病毒及抗原，也不需要大量繁殖病毒，且细胞融合率较高，一次融合成功，较其他方法〔7〕优越。本研究采用间接ELISA筛选抗RSV抗体阳性孔，方法简便，快速，敏感，特异性强，可早期筛除抗细胞成分的细胞株。经检测显示，F3株McAb只与RSV抗原呈特异性反应，与其它病毒抗原、Hep-2细胞、SP 2/0细胞等均不反应，可被RSV免疫鼠血清所封闭，证实该McAb是抗RSV特异性单克隆抗体。我们用硅胶H预处理Balb/c鼠，F3株细胞均可产生腹水，腹水产量高、澄清，且动物存活时间长，可反复抽取腹水，与文献〔3〕报道一致。
, 百拇医药
RSV为有膜病毒，其包膜上的F蛋白(即融合蛋白)可致RSV的融合病变，形成多核巨细胞。F蛋白很少变异，各株间有50%抗原相关〔8〕，也是RSV最重要的保护性抗原，国内尚未见抗RSV McAb融合抑制试验的报道。我们制备的F3株McAb具中和活性和融合抑制活性，在无补体存在下其腹水中和效价为1∶128，融合抑制效价为1∶64，且能与各株RSV抗原反应〔9〕，我们认为F3株McAb应为抗RSV F蛋白的单抗，况且抑制受染细胞融合正是抗RSV F蛋白单抗本身的特性。但在Western-blot中此McAb不能与相应结构蛋白反应，其原因可能有：①RSV抗原在制备及SDS处理过程中，抗原决定簇构象发生改变；②RSV抗原含量太少，经电泳转印后难以呈明显的可见反应。为明确F3株McAb所识别的RSV特异性多肽，需进一步提高RSV蛋白含量，改进转印方法或作免疫沉淀法等。但我们认为在这种情况下增加融合抑制试验以鉴定单抗的性质，有一定实用价值，且经济方便。
, 百拇医药
基金项目：安徽省教委资助课题，编号95JL0079
作者简介：黄升海，男，31岁，讲师，硕士
史百芬，女，53岁，副教授，硕士生导师
参考文献
1 Selwyn BJ. The epidemiology of acute respiratory tract infection in young children: comparison of findings from several developing countries. J Infect Dis, 1990;12(4)：870～888
2 顾方舟，曹逸云，董德祥等译. 病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993：561～570
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3 曾瑞云，王 红，周 芸等. 单克隆抗体的制备——不同诱导剂预处理小鼠的比较.上海第二医科大学学报，1994；14(27)：135～137
4 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970;227(5221)：680～685
5 Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophorecti transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA, 1979;76(9):4 350～4 354
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6 West WH, Lounsbach GR, Bourgeois C et al. Biological activity, binding site and affinity of monoclonal antibodies to the fusion protein of respiratory syncytial virus. J Gen Virol, 1993;75(10):2 813～2 819
7 段佩若，赵一博，赵 华等. 抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及临床应用. 中华医学杂志， 1989；69(3)：174～175
8 廖清亚，田慕贞. 人类呼吸道合胞病毒的抗原变异. 国外医学微生物学分册，1993；16(5)：204～206
9 Walsh EE, Hruska J. Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus protein: Identification of the Fusion Protein. J Virol, 1983;47(1):171～177
1999-03-03收稿，1999-06-10修回, http://www.100md.com