rhIL-10对小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性的影响
作者：陈飞虎 路景涛 陈敏珠 智 强
单位：陈飞虎 路景涛 陈敏珠 安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032；智强 安徽桑尼生物技术研究所，合肥 230042
关键词：白细胞介素10；T淋巴细胞；杀伤细胞；天然
安徽医科大学学报990406 摘要：目的 研究rhIL-10对小鼠免疫功能的影响。方法 用MTT还原法检测ConA诱导的T淋巴细胞增殖试验，中性红染色法检测NK细胞活性。结果 rhIL-10能抑制小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性(P<0.01)，这种抑制作用随剂量增加而加强。结论 rhIL-10能抑制小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性，并呈剂量依赖关系。
中国图书资料分类法分类号：R392.12；R331.14%
Effects of recombinant human interleukin-10 on activity
, 百拇医药
of T lymphocytes and NK cells
Chen Feihu, Lu Jingtao, Chen Minzhu et al
(Clinical Institute of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To investigate effect of exogenetic recombinant human interleukin-10 on immunologic functions of organism. Methods Proliferation model of T lymphocytes induced by ConA was tested with MTT reduction method and activity of NK cells was measured by method of neutral red staining. Results It was found that recombinant human interleukin-10 under administration of 5,20 and 80 μg.kg-1 in vivo possessed inhibitory effect on activity of T lymphocytes and NK cells (P<0.01). The potency was intensified with increase of dosage. Conclusion Exogenetic recombinant human interleukin-10 can inhibit activity of T-lymphocytes and NK cells. There is relationship between effect and dosage.
, 百拇医药
MeSH interleukin-10; T-lymphocytes; killer cells, natural
1989年，美国DNAX研究所Fiorention等发现TH2细胞能产生一种细胞因子合成抑制因子，后命名为白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)，该因子对单核巨噬细胞的活性具有直接的抑制作用〔1〕，亦可通过降低对单核巨噬细胞等抗原提呈细胞(APC)表面MHCⅡ类分子的表达，间接抑制TH1细胞合成细胞因子和T细胞的增殖，因此IL-10被认为是一种抗炎和免疫抑制因子〔2〕。同时它又是一种免疫刺激因子对B细胞、胸腺细胞和肥大细胞〔3～5〕的生长具有协调和促进作用。IL-10的这些生物作用，提示其潜在的医学应用价值。本研究利用重组人白细胞介素10(rhIL-10)，给小鼠皮下注射，观察对小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性的影响。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药品与试剂 rhIL-10由安徽桑尼生物技术研究所提供，批号980825；刀豆蛋白A(ConA)，Sigma产品，批号BP0337-4；噻唑兰(MTT)购于北京邦定生物医学公司，批号971010；RPMI-1640，GIBCO公司产品；L929细胞株本室保存。
1.2 动物 C57小鼠，体重18～22 g，♀♂各半，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖实动准字第01号。
1.3 仪器 Napro-6100 CO2培养箱，美国杜帮公司产品；XSZ倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；EL301 Strip reader酶标仪，美国BioTek公司产品。
2 方法与结果
, 百拇医药
2.1 rhIL-10对ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响 取C57BL小鼠随机分为4组：生理盐水组；rhIL-10三种剂量组：5，20，80 μg.kg-1每日皮下给药1次，连续7天，第8天将小鼠眼球放血后脱颈椎处死，接常规方法取脾脏，制成单个核细胞悬液，以RPMI-1640完全培养液(CM)调整细胞浓度为1×107.L-1。于96孔细胞培养板中，每孔加入200 μl脾细胞悬液，再加入50 μl含ConA的培养液，ConA的终浓度为3 mg.L-1。置37℃，5% CO2孵箱中孵育72 h，终止培养前4 h，轻轻吸取上清液200 μl。加不含小牛血清RPMI-1640稀释的MTT液0.5 g.L-1孔，继续培养4 h。届时，每孔加入200 μl酸性异丙醇，令紫色结晶全部溶解。用酶联免疫检测仪在波长570 nm处读取A值。应用SPSS统计软件对各组数据进行方差分析(F=85.0117，P<0.0005)，组间比较用t检验，结果见表1。
, 百拇医药
表1rhIL-10对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性的影响(
±s,n=6) 组 别
剂量
μg.kg-1
A值
(570 nm)
生理盐水
0.523±0.029
rhIL-10
5
0.446±0.021**
, 百拇医药
rhIL-10
20
0.424±0.014**
rhIL-10
80
0.343±0.080**
与生理盐水组比较，**P<0.01
结果表明，rhIL-10三个剂量均能显著抑制小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应，经药效与剂量依赖关系统计分析P<0.01，表明这种抑制作用呈剂量依赖关系。
2.2 rhIL-10对小鼠NK细胞活性的影响 分组与给药同前，按常规方法取小鼠脾脏，制成单个核细胞悬液，以CM调整细胞浓度为1×107.L-1作为效应细胞。靶细胞为取对数生长期的L929细胞，以4‰中性红染色，用CM调整靶细胞浓度为1×106.L-1，取100 μl加入96孔培养板各孔中，放37℃孵育4 h，取出培养液，用PBS洗一次以除去效应细胞和被杀伤而脱落下来的靶细胞，每孔加入200 μl醛酸乙醇溶解留下的靶细胞，摇匀，离心自每孔取100 μl至酶标板，用酶标仪在540 nm处测A值。
, 百拇医药
应用SPSS统计软件对各组数据进行方差分析(F=30.2291，P<0.00005)组间比较用t检验，结果见表2。
表2 rhIL-10对小鼠NK细胞活性的影响(±s,n=6) 组 别
剂量(μg.kg-1)
溶解(%)
生理盐水
36.37±3.28
rhIL-10
5
26.88±3.51**
, http://www.100md.com
rhIL-10
20
23.34±3.88**
rhIL-10
80
16.82±3.45**
与生理盐水组比较，**P<0.01
结果表明rhIL-10三个剂量均能抑制小鼠NK细胞活性，经药效与剂量依赖关系统计分析P<0.01，表明这种抑制作用呈剂量依赖关系。
3 讨论
, 百拇医药 rhIL-10主要由活化的巨噬细胞、B细胞和TH2细胞分泌，能抑制MΦ表达MHC Ⅱ类分子，直接刺激B细胞增殖和分化，促进抗体产生，同时它能抑制单核细胞分子的分泌，间接抑制TH0和TH1细胞分泌IL-2、IFN-γ〔3～5〕。研究表明：IL-10是一种重要的免疫调节剂，在细胞免疫和体液免疫中的平衡与稳定的调控中起关键作用。机体IL-10表达和分泌异常，将会导致一系列免疫应答和反应的紊乱，从而诱发机体免疫性疾病的发生。我们用rhIL-10 5，20，80 μg.kg-1给小鼠注射，增加小鼠体内外源性rhIL-10含量，结果表明不同的rhIL-10均能抑制机体T淋巴细胞增殖能力和NK细胞活性，这种抑制作用与剂量呈依赖关系。提示运用rhIL-10能改变机体的免疫状态，可用于某些免疫异常疾病的治疗，进一步研究尚待深入。
作者简介：陈飞虎，男，37岁，副教授，博士生；
, http://www.100md.com
陈敏珠，女，66岁，教授，博士生导师
参考文献
1 Wang P, Wu P， Siegel MI et al. IL-10 inhibits transcription of cytokine genes in human peripheril blood mononulear cells. J Immunol,1994;153(2):811
2 David FF, Albert Z, Paulo V et al. IL-10 acts on the antigen-presenting cells to inhibit cytokine production by TH1 cells. J Immunol,1991;146(2):344
3 Finke J, Ternes P, Lange W et al. Expression of interleukin 10 in B lymphocytes of different origin. Leukemia,1993;7(11):1 852
, 百拇医药
4 Takashi S, Anne OG, Ian MN et al. Identification of a novel thymocyte growth-promoting factor derived from cell lymphomas. Cell Immunol,1990:129(1)：228
5 Thompson SL, Dhar V, Bond MW et al. Interleukin 10: a noval stimulatory factor for mast cells and their progenitors. J Exp Med,1991;173(2):507
1999-04-21收稿
1999-06-01修回, http://www.100md.com
单位：陈飞虎 路景涛 陈敏珠 安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032；智强 安徽桑尼生物技术研究所，合肥 230042
关键词：白细胞介素10；T淋巴细胞；杀伤细胞；天然
安徽医科大学学报990406 摘要：目的 研究rhIL-10对小鼠免疫功能的影响。方法 用MTT还原法检测ConA诱导的T淋巴细胞增殖试验，中性红染色法检测NK细胞活性。结果 rhIL-10能抑制小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性(P<0.01)，这种抑制作用随剂量增加而加强。结论 rhIL-10能抑制小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性，并呈剂量依赖关系。
中国图书资料分类法分类号：R392.12；R331.14%
Effects of recombinant human interleukin-10 on activity
, 百拇医药
of T lymphocytes and NK cells
Chen Feihu, Lu Jingtao, Chen Minzhu et al
(Clinical Institute of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To investigate effect of exogenetic recombinant human interleukin-10 on immunologic functions of organism. Methods Proliferation model of T lymphocytes induced by ConA was tested with MTT reduction method and activity of NK cells was measured by method of neutral red staining. Results It was found that recombinant human interleukin-10 under administration of 5,20 and 80 μg.kg-1 in vivo possessed inhibitory effect on activity of T lymphocytes and NK cells (P<0.01). The potency was intensified with increase of dosage. Conclusion Exogenetic recombinant human interleukin-10 can inhibit activity of T-lymphocytes and NK cells. There is relationship between effect and dosage.
, 百拇医药
MeSH interleukin-10; T-lymphocytes; killer cells, natural
1989年，美国DNAX研究所Fiorention等发现TH2细胞能产生一种细胞因子合成抑制因子，后命名为白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)，该因子对单核巨噬细胞的活性具有直接的抑制作用〔1〕，亦可通过降低对单核巨噬细胞等抗原提呈细胞(APC)表面MHCⅡ类分子的表达，间接抑制TH1细胞合成细胞因子和T细胞的增殖，因此IL-10被认为是一种抗炎和免疫抑制因子〔2〕。同时它又是一种免疫刺激因子对B细胞、胸腺细胞和肥大细胞〔3～5〕的生长具有协调和促进作用。IL-10的这些生物作用，提示其潜在的医学应用价值。本研究利用重组人白细胞介素10(rhIL-10)，给小鼠皮下注射，观察对小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性的影响。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药品与试剂 rhIL-10由安徽桑尼生物技术研究所提供，批号980825；刀豆蛋白A(ConA)，Sigma产品，批号BP0337-4；噻唑兰(MTT)购于北京邦定生物医学公司，批号971010；RPMI-1640，GIBCO公司产品；L929细胞株本室保存。
1.2 动物 C57小鼠，体重18～22 g，♀♂各半，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖实动准字第01号。
1.3 仪器 Napro-6100 CO2培养箱，美国杜帮公司产品；XSZ倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；EL301 Strip reader酶标仪，美国BioTek公司产品。
2 方法与结果
, 百拇医药
2.1 rhIL-10对ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响 取C57BL小鼠随机分为4组：生理盐水组；rhIL-10三种剂量组：5，20，80 μg.kg-1每日皮下给药1次，连续7天，第8天将小鼠眼球放血后脱颈椎处死，接常规方法取脾脏，制成单个核细胞悬液，以RPMI-1640完全培养液(CM)调整细胞浓度为1×107.L-1。于96孔细胞培养板中，每孔加入200 μl脾细胞悬液，再加入50 μl含ConA的培养液，ConA的终浓度为3 mg.L-1。置37℃，5% CO2孵箱中孵育72 h，终止培养前4 h，轻轻吸取上清液200 μl。加不含小牛血清RPMI-1640稀释的MTT液0.5 g.L-1孔，继续培养4 h。届时，每孔加入200 μl酸性异丙醇，令紫色结晶全部溶解。用酶联免疫检测仪在波长570 nm处读取A值。应用SPSS统计软件对各组数据进行方差分析(F=85.0117，P<0.0005)，组间比较用t检验，结果见表1。
, 百拇医药
表1rhIL-10对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性的影响(
±s,n=6) 组 别剂量
μg.kg-1
A值
(570 nm)
生理盐水
0.523±0.029
rhIL-10
5
0.446±0.021**
, 百拇医药
rhIL-10
20
0.424±0.014**
rhIL-10
80
0.343±0.080**
与生理盐水组比较，**P<0.01
结果表明，rhIL-10三个剂量均能显著抑制小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应，经药效与剂量依赖关系统计分析P<0.01，表明这种抑制作用呈剂量依赖关系。
2.2 rhIL-10对小鼠NK细胞活性的影响 分组与给药同前，按常规方法取小鼠脾脏，制成单个核细胞悬液，以CM调整细胞浓度为1×107.L-1作为效应细胞。靶细胞为取对数生长期的L929细胞，以4‰中性红染色，用CM调整靶细胞浓度为1×106.L-1，取100 μl加入96孔培养板各孔中，放37℃孵育4 h，取出培养液，用PBS洗一次以除去效应细胞和被杀伤而脱落下来的靶细胞，每孔加入200 μl醛酸乙醇溶解留下的靶细胞，摇匀，离心自每孔取100 μl至酶标板，用酶标仪在540 nm处测A值。
, 百拇医药
应用SPSS统计软件对各组数据进行方差分析(F=30.2291，P<0.00005)组间比较用t检验，结果见表2。
表2 rhIL-10对小鼠NK细胞活性的影响(
±s,n=6) 组 别剂量(μg.kg-1)
溶解(%)
生理盐水
36.37±3.28
rhIL-10
5
26.88±3.51**
, http://www.100md.com
rhIL-10
20
23.34±3.88**
rhIL-10
80
16.82±3.45**
与生理盐水组比较，**P<0.01
结果表明rhIL-10三个剂量均能抑制小鼠NK细胞活性，经药效与剂量依赖关系统计分析P<0.01，表明这种抑制作用呈剂量依赖关系。
3 讨论
, 百拇医药 rhIL-10主要由活化的巨噬细胞、B细胞和TH2细胞分泌，能抑制MΦ表达MHC Ⅱ类分子，直接刺激B细胞增殖和分化，促进抗体产生，同时它能抑制单核细胞分子的分泌，间接抑制TH0和TH1细胞分泌IL-2、IFN-γ〔3～5〕。研究表明：IL-10是一种重要的免疫调节剂，在细胞免疫和体液免疫中的平衡与稳定的调控中起关键作用。机体IL-10表达和分泌异常，将会导致一系列免疫应答和反应的紊乱，从而诱发机体免疫性疾病的发生。我们用rhIL-10 5，20，80 μg.kg-1给小鼠注射，增加小鼠体内外源性rhIL-10含量，结果表明不同的rhIL-10均能抑制机体T淋巴细胞增殖能力和NK细胞活性，这种抑制作用与剂量呈依赖关系。提示运用rhIL-10能改变机体的免疫状态，可用于某些免疫异常疾病的治疗，进一步研究尚待深入。
作者简介：陈飞虎，男，37岁，副教授，博士生；
, http://www.100md.com
陈敏珠，女，66岁，教授，博士生导师
参考文献
1 Wang P, Wu P， Siegel MI et al. IL-10 inhibits transcription of cytokine genes in human peripheril blood mononulear cells. J Immunol,1994;153(2):811
2 David FF, Albert Z, Paulo V et al. IL-10 acts on the antigen-presenting cells to inhibit cytokine production by TH1 cells. J Immunol,1991;146(2):344
3 Finke J, Ternes P, Lange W et al. Expression of interleukin 10 in B lymphocytes of different origin. Leukemia,1993;7(11):1 852
, 百拇医药
4 Takashi S, Anne OG, Ian MN et al. Identification of a novel thymocyte growth-promoting factor derived from cell lymphomas. Cell Immunol,1990:129(1)：228
5 Thompson SL, Dhar V, Bond MW et al. Interleukin 10: a noval stimulatory factor for mast cells and their progenitors. J Exp Med,1991;173(2):507
1999-04-21收稿
1999-06-01修回, http://www.100md.com