HBV DNA定量检测与HBV五项标志的关系及临床意义
作者：尹华发 卢建溪 高志良
单位：尹华发(安徽医科大学第一附属医院传染病科，合肥 230022)；卢建溪 高志良(中山医科大学第三附属医院传染病科，广州 510630)
关键词：肝炎病毒；乙型；DNA；聚合酶链反应
安徽医科大学学报000118 摘要 目的 了解HBsAg与抗-HBs同时阳性者临床类型、血清学标志与HBV DNA量之间的关系。方法 对26例HBsAg与抗-HBs同时阳性者应用Amplisensor法测定血清HBV DNA量。结果 慢性肝炎、重型肝炎和肝硬变者HBV DNA分别为：109.17±1.60、109.44±1.98和108.14±2.27(copy.L-1)；HBeAg(+)、抗-HBe(+)和两者都(-)组HBV DNA分别是： 1010.31±0.71、 108.34±2.20 和 108.16±1.49(copy.L-1)；HBsAg(S/N)值 ≤100 和 >100 者HBV DNA分别是：108.26±1.85 和 1010.31±0.93 (copy.L-1)；抗-HBs值≤10和>10 (IU.L-1)者分别为：109.07±1.85和109.20±1.91(copy.L-1)。结论 不同临床类型其病毒含量差异无显著性；HBsAg、HBeAg(S/N)值与病毒量呈正相关，而抗-HBs值与病毒含量无相关性。
, 百拇医药
中图分类号 R446.9； R373.21；R342.3
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0050-03
Clinical significance and correlation between quantity of HBV DNA and five serological markers in patients with hepatitis B
Yin Huafa, Lu Jianxi, Gao Zhiliang
(Dept of Infectious Disease, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)
, http://www.100md.com Abstract Objective To study the correlations between quantity of HBV DNA and clinical types, serological markers in patients with both HBsAg and anti-HBs positivity. Methods Quantities of HBV DNA in 26 cases of both HBsAg and anti-HBs positivity were measured by amplisensor assay. Results Quantities of HBV DNA in chronic hepatitis, fulminant hepatitis and cirrhosis were 109.17±1.60, 109.44±1.98 and 108.14±2.27(copy.L-1) respectively. Quantities of HBV DNA in patients with HBeAg positivity, anti-HBe positivity and both HBeAg and anti-HBe negative were 1010.31±0.71, 108.34±2.20 and 108.16±1.49(copy.L-1) respectively. Quantities of HBV DNA in patients whose HBsAg(S/N) titer ≤100 and >100 were 108.26±1.85 and 1010.31±0.93(copy.L-1) respectively. Quantities of HBV DNA in patients whose anti-HBs titer ≤10 and >10 (IU.L-1) were 109.07±1.85 and 109.20±1.91(copy.L-1) respectively. Conclusion There is no significant difference for quantities of HBV DNA in different clinical type of patients with both HBsAg and anti-HBs positivity. Quantity of HBV DNA is directly related to titer of HBsAg and HBeAg in serum samples. But there is no correlation between anti-HBs titer and HBV DNA quantity.
, http://www.100md.com
MeSH hepatitis virus, B; DNA; PCR
乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)是乙型肝炎病毒(HBV)复制最直接和最可靠的指标。
随着聚合酶链反应(PCR)技术的不断发展与进步，HBV DNA的检测技术由定性发展到定量，而且检测的灵敏度越来越高〔1〕。HBV DNA的定量检测在抗病毒药物的疗效评价，病情的活动及预后的判断等方面均有重要意义。HBV感染者可出现多种不同的血清学标志模式，其中有一部分呈HBsAg与抗-HBs同时阳性〔2〕。我们对这种类型的感染者进行了血清HBV DNA的定量检测。并就其与临床类型、血清标志物之间的关系进行了比较分析，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 病例选择 所有病例均来自1998年9月至1999年4月在中山医科大学第三附属医院传染病科门诊或住院部就诊的患者，其中有26例HBV感染者呈HBsAg与抗-HBs的同时阳性；男20例，女6例；年龄2～62岁(29.8岁±13.9岁)；临床类型：慢性肝炎16例(有1例合并肝癌)，重型肝炎7例(亚重肝1例，慢重肝6例)和肝硬变3例(1例合并肝癌)。诊断标准按《病毒性肝炎防治方案》(试行)〔3〕，部分病例系肝穿刺或手术取材病理证实。所有病例在取血标本前均无应用抗病毒或免疫调节药物史。另选择5例乙型肝炎病毒血清标志物(HBV M)阴性，肝功能正常的健康体检者作为对照。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 标本采集 清晨空腹带盖无菌管取静脉血，分离血清后-20℃冰箱分管保存、备检。
1.2.2 HBV 5M的检测 采用美国Abbott公司生产的IMx自动免疫分析仪及其配套的微粒子酶免疫分析法(MEIA)试剂盒，进行HBV 5M(HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc)的检测，其操作过程和结果判断均由IMx仪自动进行。
1.2.3 HBV DNA定量检测 采用美国Biotronics公司首创的Amplisensor法〔4〕及其试剂盒和配套设备进行HBV DNA的定量检测。具体操作按说明书进行，并严格按照Kwok等〔5〕提出的防止PCR污染措施实施。所有标本均在同一条件下同一批检验。其阳性截止值为≥2×106 copy.L-1。
, http://www.100md.com
1.3 统计学处理 各组均数比较采用t检验；相关性采用直线回归分析。
2 结果
2.1 不同临床类型患者HBV DNA的检测 结果见表1。虽然其HBV DNA含量各有不同，但差异无显著性(P>0.2或P>0.5)。
表1 不同临床类型患者HBV DNA检测结果 临床类型
例数
HBV DNA*
P值(与对照组相比)
慢性肝炎
16
9.17±1.60
, 百拇医药
<0.001
重型肝炎
7
9.44±1.98
<0.001
肝硬变
3
8.14±2.27
<0.05
健康对照
5
5.02±0.53
*系对数值2.2 HBeAg、抗-HBe与HBV DNA量的关系及相关分析 将患者按HBeAg、抗-HBe的状况分为HBeAg(+)、抗-HBe(+)和两者均(-)三组，其HBV DNA量见表2。
, 百拇医药
表2 HBeAg、抗-HBe与HBV DNA量的关系 组别
例数
HBV DNA*
P值
HBeAg(+)
11△
10.31±0.71
抗-HBe(+)
8△
8.34±2.20
<0.05
, 百拇医药
HBeAg与抗-HBe均(-)
8
8.16±1.49
<0.001
*系对数值，△有1例为HBeAg与抗-HBe同时阳性
从表2可以得知，HBeAg(+)者的HBV DNA量明显高于抗-HBe(+)和两者均(-)组(P<0.05或P<0.001)；而后两组之间，差异无显著性(P>0.5)。
对HBeAg(S/N)值与HBV DNA量间的直线回归分析，得出相关系数r=0.6273，两者间呈正相关(P<0.05)。
2.3 HBsAg、抗-HBs值与HBV DNA量的关系及相关分析 将HBsAg与抗-HBs同时阳性者，按其HBsAg(S/N)值将其分为≤100和>100两组；按其抗-HBs值，再将其分为≤10 IU.L-1 和>10 IU.L-1 两组，测各组HBV DNA的量，见表3。
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表3 HBsAg、抗-HBs值与HBV DNA量的关系 组别
HBsAg(S/N)
抗-HBs(IU.L-1)
合计
≤100
>100
≤10
>10
例数
15
11
12
, http://www.100md.com
14
26
HBV DNA*
8.26±1.85
10.31
±0.93
9.07
±1.85
9.20
±1.91
9.13
±1.86
, 百拇医药 P值
<0.005
>0.5
*系对数值
从表3可以得知，HBsAg(S/N)值>100组，其HBV DNA量明显高于≤100组，差异有显著性(P<0.005)；而抗-HBs值高低组间，HBV DNA量差异不显著(P>0.5)。
对HBsAg(S/N)值与HBV DNA量间的直线回归分析，得出相关系数r=0.5627，两者间存在正相关(P<0.005)。
而对抗-HBs值与HBV DNA量间的直线回归分析，得出相关系数r=0.0511，两者间无相关性(P>0.5)。
3 讨论
, 百拇医药
在HBV感染者中，有一部分呈HBsAg与抗-HBs同时阳性，此类型的感染者，在新加坡高达21%〔2〕。我们采用Abbott试剂及设备检测了我国的HBV感染者，其检出率为9.15%(论文待发表)。出现这种血清学现象的可能原因：一是感染者体内HBV基因(特别是S基因)发生了变异，结果出现了“免疫逃逸”〔6〕；二是不同亚型的HBV重叠感染，结果某一亚型的抗体对另一亚型的HBsAg不起中和抗体作用；三是HBV以外病原感染出现的交叉性的抗体反应〔7〕。
我们对HBsAg与抗-HBs同时阳性患者的血清HBV DNA水平检测发现其病毒含量与常见血清学标志的HBV感染者无明显的差别，其HBeAg(S/N)值与HBV DNA量呈正相关。这与国内报道〔8〕一致。我们在对HBsAg(S/N)值与DNA量的关系研究中还发现，此两者也存在着正相关关系。因此，测定血清中HBsAg和HBeAg值可以间接反映HBV DNA的量，这对临床上抗病毒药物的疗效及疾病的预后判断均有一定的指导意义。
, 百拇医药
至于不同临床类型与HBV DNA量的关系，多数报道认为急性肝炎者较慢性肝炎者为低，但对于慢性肝炎与肝硬变者却有不一致的结果〔9，10〕。本次对HBsAg与抗-HBs同时阳性者的研究发现，重型肝炎者的HBV DNA量并不低于慢性肝炎者，这与董惠卿〔9〕的报道结果不同。本组肝硬变者的病毒含量虽相对较低，但因例数较少，尚无统计学意义，有待于今后进一步的观察。我们认为HBV感染者HBV DNA的量与HBV M的状态存在着密切的关系。
本研究表明，在HBsAg与抗-HBs同时阳性的感染者中，其抗-HBs效价的高低与HBV DNA量无相关性，说明此类感染者体内的抗-HBs对HBV不起识别和清除作用。
基金项目：美国中华医学资金会及卫生部优秀青年人才资金资助(编号：97018)
作者简介：尹华发，男，36岁，副主任医师；
, 百拇医药
高志良，男，37岁，博士，研究员，硕士生导师
参考文献
1，Zaaijer HL, Borg F, Cuypers HTM et al. Comparison of methods for detection of hepatitis B virus DNA. J of Clin Microbio, 1994;32(9):2088～2091
2，Wang YM, Ng WC, Kang TY et al. Serological profiles of hepatitis B carrier patients in Singapore with special reference to the frequency and significance of concurrent presence of HBsAg and anti-HBs. Singapore Med J, 1996;37(2):150～152
, http://www.100md.com
3，病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995；13(4)：241～247
4，Wang CN, Wu KY, Wang HT. Quantitative PCR using the Amplisensor assay. in Dieffenbach CW and Dreksler GS ed. From PCR primer: “A Laboratory Manual.” Cold Spring Harbor laboratory press， 1995:193～202
5，Kwok S, Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature, 1989;339(6221):237～238
6，Yamamoto K, Horikita M, Tsuda F et al. Naturally occurring escape mutants of hepatitis B virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis B surface antigen. J of Virology, 1994;68(4):2671～2676
, http://www.100md.com
7，姚 桢编著.分子乙型肝炎病毒相关病学.北京：中国医药科技出版社，1998：25
8，张复春，吴婉芬，董惠卿等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997；15(1)：24～27
9，董惠卿，张复春，蔡晓莉等.定量聚合酶链反应检测血清乙型肝炎病毒DNA及其意义.广东卫生防疫，1996；22(4)：1～3
10，周 平，张木森，蔡 庆等.定量聚合酶链反应检测HBV感染者血清HBV DNA的临床意义.空军总医院学报，1997；13(4)：193～195
1999-07-02收稿，1999-10-14修回, http://www.100md.com
单位：尹华发(安徽医科大学第一附属医院传染病科，合肥 230022)；卢建溪 高志良(中山医科大学第三附属医院传染病科，广州 510630)
关键词：肝炎病毒；乙型；DNA；聚合酶链反应
安徽医科大学学报000118 摘要 目的 了解HBsAg与抗-HBs同时阳性者临床类型、血清学标志与HBV DNA量之间的关系。方法 对26例HBsAg与抗-HBs同时阳性者应用Amplisensor法测定血清HBV DNA量。结果 慢性肝炎、重型肝炎和肝硬变者HBV DNA分别为：109.17±1.60、109.44±1.98和108.14±2.27(copy.L-1)；HBeAg(+)、抗-HBe(+)和两者都(-)组HBV DNA分别是： 1010.31±0.71、 108.34±2.20 和 108.16±1.49(copy.L-1)；HBsAg(S/N)值 ≤100 和 >100 者HBV DNA分别是：108.26±1.85 和 1010.31±0.93 (copy.L-1)；抗-HBs值≤10和>10 (IU.L-1)者分别为：109.07±1.85和109.20±1.91(copy.L-1)。结论 不同临床类型其病毒含量差异无显著性；HBsAg、HBeAg(S/N)值与病毒量呈正相关，而抗-HBs值与病毒含量无相关性。
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中图分类号 R446.9； R373.21；R342.3
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0050-03
Clinical significance and correlation between quantity of HBV DNA and five serological markers in patients with hepatitis B
Yin Huafa, Lu Jianxi, Gao Zhiliang
(Dept of Infectious Disease, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)
, http://www.100md.com Abstract Objective To study the correlations between quantity of HBV DNA and clinical types, serological markers in patients with both HBsAg and anti-HBs positivity. Methods Quantities of HBV DNA in 26 cases of both HBsAg and anti-HBs positivity were measured by amplisensor assay. Results Quantities of HBV DNA in chronic hepatitis, fulminant hepatitis and cirrhosis were 109.17±1.60, 109.44±1.98 and 108.14±2.27(copy.L-1) respectively. Quantities of HBV DNA in patients with HBeAg positivity, anti-HBe positivity and both HBeAg and anti-HBe negative were 1010.31±0.71, 108.34±2.20 and 108.16±1.49(copy.L-1) respectively. Quantities of HBV DNA in patients whose HBsAg(S/N) titer ≤100 and >100 were 108.26±1.85 and 1010.31±0.93(copy.L-1) respectively. Quantities of HBV DNA in patients whose anti-HBs titer ≤10 and >10 (IU.L-1) were 109.07±1.85 and 109.20±1.91(copy.L-1) respectively. Conclusion There is no significant difference for quantities of HBV DNA in different clinical type of patients with both HBsAg and anti-HBs positivity. Quantity of HBV DNA is directly related to titer of HBsAg and HBeAg in serum samples. But there is no correlation between anti-HBs titer and HBV DNA quantity.
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MeSH hepatitis virus, B; DNA; PCR
乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)是乙型肝炎病毒(HBV)复制最直接和最可靠的指标。
随着聚合酶链反应(PCR)技术的不断发展与进步，HBV DNA的检测技术由定性发展到定量，而且检测的灵敏度越来越高〔1〕。HBV DNA的定量检测在抗病毒药物的疗效评价，病情的活动及预后的判断等方面均有重要意义。HBV感染者可出现多种不同的血清学标志模式，其中有一部分呈HBsAg与抗-HBs同时阳性〔2〕。我们对这种类型的感染者进行了血清HBV DNA的定量检测。并就其与临床类型、血清标志物之间的关系进行了比较分析，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 病例选择 所有病例均来自1998年9月至1999年4月在中山医科大学第三附属医院传染病科门诊或住院部就诊的患者，其中有26例HBV感染者呈HBsAg与抗-HBs的同时阳性；男20例，女6例；年龄2～62岁(29.8岁±13.9岁)；临床类型：慢性肝炎16例(有1例合并肝癌)，重型肝炎7例(亚重肝1例，慢重肝6例)和肝硬变3例(1例合并肝癌)。诊断标准按《病毒性肝炎防治方案》(试行)〔3〕，部分病例系肝穿刺或手术取材病理证实。所有病例在取血标本前均无应用抗病毒或免疫调节药物史。另选择5例乙型肝炎病毒血清标志物(HBV M)阴性，肝功能正常的健康体检者作为对照。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 标本采集 清晨空腹带盖无菌管取静脉血，分离血清后-20℃冰箱分管保存、备检。
1.2.2 HBV 5M的检测 采用美国Abbott公司生产的IMx自动免疫分析仪及其配套的微粒子酶免疫分析法(MEIA)试剂盒，进行HBV 5M(HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc)的检测，其操作过程和结果判断均由IMx仪自动进行。
1.2.3 HBV DNA定量检测 采用美国Biotronics公司首创的Amplisensor法〔4〕及其试剂盒和配套设备进行HBV DNA的定量检测。具体操作按说明书进行，并严格按照Kwok等〔5〕提出的防止PCR污染措施实施。所有标本均在同一条件下同一批检验。其阳性截止值为≥2×106 copy.L-1。
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1.3 统计学处理 各组均数比较采用t检验；相关性采用直线回归分析。
2 结果
2.1 不同临床类型患者HBV DNA的检测 结果见表1。虽然其HBV DNA含量各有不同，但差异无显著性(P>0.2或P>0.5)。
表1 不同临床类型患者HBV DNA检测结果 临床类型
例数
HBV DNA*
P值(与对照组相比)
慢性肝炎
16
9.17±1.60
, 百拇医药
<0.001
重型肝炎
7
9.44±1.98
<0.001
肝硬变
3
8.14±2.27
<0.05
健康对照
5
5.02±0.53
*系对数值2.2 HBeAg、抗-HBe与HBV DNA量的关系及相关分析 将患者按HBeAg、抗-HBe的状况分为HBeAg(+)、抗-HBe(+)和两者均(-)三组，其HBV DNA量见表2。
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表2 HBeAg、抗-HBe与HBV DNA量的关系 组别
例数
HBV DNA*
P值
HBeAg(+)
11△
10.31±0.71
抗-HBe(+)
8△
8.34±2.20
<0.05
, 百拇医药
HBeAg与抗-HBe均(-)
8
8.16±1.49
<0.001
*系对数值，△有1例为HBeAg与抗-HBe同时阳性
从表2可以得知，HBeAg(+)者的HBV DNA量明显高于抗-HBe(+)和两者均(-)组(P<0.05或P<0.001)；而后两组之间，差异无显著性(P>0.5)。
对HBeAg(S/N)值与HBV DNA量间的直线回归分析，得出相关系数r=0.6273，两者间呈正相关(P<0.05)。
2.3 HBsAg、抗-HBs值与HBV DNA量的关系及相关分析 将HBsAg与抗-HBs同时阳性者，按其HBsAg(S/N)值将其分为≤100和>100两组；按其抗-HBs值，再将其分为≤10 IU.L-1 和>10 IU.L-1 两组，测各组HBV DNA的量，见表3。
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表3 HBsAg、抗-HBs值与HBV DNA量的关系 组别
HBsAg(S/N)
抗-HBs(IU.L-1)
合计
≤100
>100
≤10
>10
例数
15
11
12
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14
26
HBV DNA*
8.26±1.85
10.31
±0.93
9.07
±1.85
9.20
±1.91
9.13
±1.86
, 百拇医药 P值
<0.005
>0.5
*系对数值
从表3可以得知，HBsAg(S/N)值>100组，其HBV DNA量明显高于≤100组，差异有显著性(P<0.005)；而抗-HBs值高低组间，HBV DNA量差异不显著(P>0.5)。
对HBsAg(S/N)值与HBV DNA量间的直线回归分析，得出相关系数r=0.5627，两者间存在正相关(P<0.005)。
而对抗-HBs值与HBV DNA量间的直线回归分析，得出相关系数r=0.0511，两者间无相关性(P>0.5)。
3 讨论
, 百拇医药
在HBV感染者中，有一部分呈HBsAg与抗-HBs同时阳性，此类型的感染者，在新加坡高达21%〔2〕。我们采用Abbott试剂及设备检测了我国的HBV感染者，其检出率为9.15%(论文待发表)。出现这种血清学现象的可能原因：一是感染者体内HBV基因(特别是S基因)发生了变异，结果出现了“免疫逃逸”〔6〕；二是不同亚型的HBV重叠感染，结果某一亚型的抗体对另一亚型的HBsAg不起中和抗体作用；三是HBV以外病原感染出现的交叉性的抗体反应〔7〕。
我们对HBsAg与抗-HBs同时阳性患者的血清HBV DNA水平检测发现其病毒含量与常见血清学标志的HBV感染者无明显的差别，其HBeAg(S/N)值与HBV DNA量呈正相关。这与国内报道〔8〕一致。我们在对HBsAg(S/N)值与DNA量的关系研究中还发现，此两者也存在着正相关关系。因此，测定血清中HBsAg和HBeAg值可以间接反映HBV DNA的量，这对临床上抗病毒药物的疗效及疾病的预后判断均有一定的指导意义。
, 百拇医药
至于不同临床类型与HBV DNA量的关系，多数报道认为急性肝炎者较慢性肝炎者为低，但对于慢性肝炎与肝硬变者却有不一致的结果〔9，10〕。本次对HBsAg与抗-HBs同时阳性者的研究发现，重型肝炎者的HBV DNA量并不低于慢性肝炎者，这与董惠卿〔9〕的报道结果不同。本组肝硬变者的病毒含量虽相对较低，但因例数较少，尚无统计学意义，有待于今后进一步的观察。我们认为HBV感染者HBV DNA的量与HBV M的状态存在着密切的关系。
本研究表明，在HBsAg与抗-HBs同时阳性的感染者中，其抗-HBs效价的高低与HBV DNA量无相关性，说明此类感染者体内的抗-HBs对HBV不起识别和清除作用。
基金项目：美国中华医学资金会及卫生部优秀青年人才资金资助(编号：97018)
作者简介：尹华发，男，36岁，副主任医师；
, 百拇医药
高志良，男，37岁，博士，研究员，硕士生导师
参考文献
1，Zaaijer HL, Borg F, Cuypers HTM et al. Comparison of methods for detection of hepatitis B virus DNA. J of Clin Microbio, 1994;32(9):2088～2091
2，Wang YM, Ng WC, Kang TY et al. Serological profiles of hepatitis B carrier patients in Singapore with special reference to the frequency and significance of concurrent presence of HBsAg and anti-HBs. Singapore Med J, 1996;37(2):150～152
, http://www.100md.com
3，病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995；13(4)：241～247
4，Wang CN, Wu KY, Wang HT. Quantitative PCR using the Amplisensor assay. in Dieffenbach CW and Dreksler GS ed. From PCR primer: “A Laboratory Manual.” Cold Spring Harbor laboratory press， 1995:193～202
5，Kwok S, Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature, 1989;339(6221):237～238
6，Yamamoto K, Horikita M, Tsuda F et al. Naturally occurring escape mutants of hepatitis B virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis B surface antigen. J of Virology, 1994;68(4):2671～2676
, http://www.100md.com
7，姚 桢编著.分子乙型肝炎病毒相关病学.北京：中国医药科技出版社，1998：25
8，张复春，吴婉芬，董惠卿等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997；15(1)：24～27
9，董惠卿，张复春，蔡晓莉等.定量聚合酶链反应检测血清乙型肝炎病毒DNA及其意义.广东卫生防疫，1996；22(4)：1～3
10，周 平，张木森，蔡 庆等.定量聚合酶链反应检测HBV感染者血清HBV DNA的临床意义.空军总医院学报，1997；13(4)：193～195
1999-07-02收稿，1999-10-14修回, http://www.100md.com