p16基因产物在肺癌中的表达研究
作者：马冬春 疏元善 魏大中 范 军 戎保林 吴双正
单位：安徽省立医院胸心外科，合肥 230001
关键词：肺肿瘤；遗传学；基因表达；免疫组织化学
安徽医科大学学报000110
摘要 目的 探讨p16基因产物在肺癌中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组化SP法检测82例肺癌组织中p16基因表达并结合肺癌的临床病理学特征及预后情况进行分析，40例癌旁正常肺组织作对照。结果 肺癌组织中p16基因产物阳性表达率为57.3%，癌旁正常肺组织为92.5%。肺癌组织中存在明显的p16基因表达缺失。肺癌组织中p16基因表达水平与肺癌的细胞分化程度、临床分期及预后有密切关系(P<0.05)。结论 p16基因表达缺失在肺癌发生、发展、分化和转归过程中起重要作用，检测肺癌组织中p16基因表达水平可作为判断肺癌进展和预后的一个重要参考指标。
, 百拇医药
中图分类号 R734.2；R392.31
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0030-03
Study on the expression of p16 gene production in lung cancer
MA Dongchun, Su Yuanshan, Wei Dazhong et al
(Dept of Thoracocardiac Surgery, Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
Abstract Objective To explore the expression of p16 gene product and its clinical significance in lung cancer. Methods 82 lung cancer specimens were examined with SP immunohistochemical staining. They were divided into groups, contrasted and analysed according to their clinicopathologic characteristics and prognosis,40 normal lung tissues as control. Results The positive expression rate of p16 gene was 57.3% in lung cancer, 92.5% in normal lung tissues, and there was obvious down-regulation expression of p16 gene in lung cancer. The expression level of p16 gene was closely related to cell differentiation, progression, and prognosis of lung cancer(P<0.05). Conclusion The deletion of p16 gene protein plays an important role in the tumorgenesis, development, differentiation,and prognosis in lung cancer, The expression level of p16 gene may be regarded as a referential index in judging the progression and prognosis of lung cancer.
, 百拇医药
MeSH lung neoplasms/genetics; gene expression; immunohistochemistry
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率近年来有逐年明显上升趋势，为探讨p16基因在肺癌发生、发展、分化和转归过程中的作用，我们对一组肺癌切除标本中P16基因产物进行免疫组化研究，现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 组织标本 取安徽省立医院胸外科1993年7月到1995年4月间经病理证实的肺癌切除标本82例，其中鳞癌43例，腺癌26例，腺磷癌7例，小细胞癌6例；高分化癌28例，中分化癌31例，低分化癌16例，未分化癌7例；Ⅰ期18例，Ⅱ期32例，Ⅲ期27例，Ⅳ期5例；术后存活时间>3年者32例，<3年者45例，5例失访。全部切除标本经福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续4 μm切片各两张，一张行HE染色复查诊断，另一张用p16基因蛋白免疫组化染色，取癌旁正常肺组织40例为对照。
, 百拇医药
1.2 试剂来源 兔抗人p16多克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶免疫组化染色试剂盒均为福州迈新生物技术开发公司产品。
1.3 实验方法 免疫组化染色方法选用操作简便、敏感性高、特异性强的链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase,SP)，具体染色过程按试剂盒内说明书进行。
1.4 结果判断标准 以细胞呈清晰标色为阳性，p16基因蛋白表达主要定位于胞浆或胞核(见图1)，按照阳性细胞百分比分：(-)阳性细胞<10%；(+)阳性细胞11%～25%；(
)阳性细胞26%～50%；(
)阳性细胞>50%。
1.5 统计学处理方法 实验结果采用卡方检验，全部数据输入586微机，用Epi6软件作统计学处理。
, 百拇医药
图1 低分化鳞癌免疫组化染色结果
阳性部位位于胞浆内，p16(),SP×200
2 结果
2.1 p16基因蛋白在肺癌组织及癌旁正常肺组织中的表达情况 见表1，肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显低于癌旁正常肺组织，两组比较差异有高度显著性(P<0.01)。
表1 p16基因表达与肺癌临床病理特征及预后关系
类别
例数
p16阳性例数
阳性率%
, 百拇医药
P
+
组织来源
肺癌组织
82
33
9
5
57.3
癌旁正常肺组织
40
, 百拇医药
18
16
3
92.5
<0.01
分化程度
中高分化
59
29
7
3
66.1
低未分化
, 百拇医药 23
4
2
2
34.8
<0.05
临床分期
Ⅰ～Ⅱ期
50
24
5
5
68.0
Ⅲ～Ⅳ期
, 百拇医药
32
9
4
0
40.6
<0.05
存活时间
<3年
45
15
2
3
44.4
<0.05
, 百拇医药
>3年
32
17
5
2
75.0
<0.05
注：82例肺癌有5例失访，失访率为6.1%
2.2 p16基因蛋白在不同分化程度肺癌组织中的表达情况 从表1可以看出：随着肺癌分化程度降低，p16基因蛋白表达率逐渐下降，中高分化肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显高于低未分化肺癌组(P<0.05)。
2.3 p16基因蛋白表达与肺癌临床分期的关系 见表1。表明肺癌分期越晚，p16基因蛋白表达缺失越多，Ⅰ～Ⅱ期肺癌与Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 p16基因蛋白表达与肺癌的预后关系 见表1。研究结果表明术后存活时间>3年的肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显高于术后存活时间<3年者(P<0.05)。
3 讨论
肺癌的发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多基因调控异常的过程〔1，2〕，其中癌基因的激活和(或)抑癌基因的突变、失活至关重要。p16基因是一种新型抑癌基因，它定位于9p21染色体上，编码表达分子量为15.8 ku的蛋白，该蛋白直接作用于细胞周期依赖激酶4(cell cyclin-dependent kinase 4,CDK4)，抑制CDK/周期蛋白D复合物的催化活性，阻止细胞由G1期向S期转变，从而抑制细胞增生和恶性转化，此外，p16蛋白还作用于CDK4、cyclin D和p110RB的反馈回路，通过调节p110RB蛋白活性防止细胞增殖，它在细胞周期的许多调节环节起到一个“闸”作用〔3〕，因此，如果p16基因突变、失活，则可引起细胞无限增殖和恶性转化，加之其它因素参与最终导致肿瘤发生。自1994年Kamb〔4〕首次发现并证实p16基因以来已有不少学者研究了p16基因在肺癌中的突变或缺失，Xiao等〔5〕用荧光原位杂交技术及DNA测序法检测18例非小细胞肺癌有15例基因缺失并检测出p16基因第72位密码子无义突变和第75位密码子错义突变。Shimizu等〔6〕用PCR-SSCP技术检测人原发性肺癌p16基因点突变，发现15例肺癌有2例存在点突变。Jim等〔7〕把p16基因导入无p16基因表达的肺癌细胞中，在离体和活体中均显示阻止肿瘤细胞的增殖，本研究应用免疫组化技术检测了一组肺癌组织及癌旁正常肺组织中p16基因蛋白的表达情况，结果发现肺癌组织中p16基因蛋白表达率明显低于癌旁正常肺组织，从蛋白质水平说明了p16基因突变、失活在肺癌的发生中起重要作用。
, http://www.100md.com
研究同时发现在中、高分化肺癌组织中，p16基因蛋白阳性表达率明显高于低未分化肺癌组织，表明p16基因蛋白表达与肺癌细胞分化程度有关，有可能作为判断肺癌恶性程度的标志。p16基因失活导致细胞增殖失控，失去正常分化能力。因此，p16基因缺失的肿瘤细胞其恶性程度高，分化不良。研究还发现Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织中p16基因蛋白表达率显著高于Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织，提示p16基因不仅调控肺癌的细胞分化，而且参与肺癌发展的整个病程，临床分期越晚的肺癌p16基因表达缺少越多，因此，检测肺癌组织中p16基因表达水平可间接反映肺癌的病程。
对77例肺癌患者的术后随访发现p16基因蛋白表达与肺癌的预后有一定联系，术后存活时间>3年的肺癌组织p16基因蛋白表达率明显高于术后存活时间<3年者，因此，肺癌组织中p16基因蛋白的表达水平可作为判断肺癌预后的一个重要参考指标。
作者简介：马冬春，男，32岁，主治医师，硕士；
, http://www.100md.com 疏元善，男，62岁，教授，主任医师，博士生导师，中国肺癌专业委员会委员，安徽省医学会胸心外科学会副主任委员，解放军105医院名誉院长
参考文献
1，Ohira T, Ohe Y, Heike Y et al. Gene therapy for lewis lung carcinoma with tumor necrosis factor and interleukin-2 cDNA cotransfected subline. Gene Ther,1994;1(4):269
2，Fujiwara T, Crimm EA, Mukhopadhyay T et al. Induction of chemosensitivity in human lung cancer cells in vivo by adenovirus mediated transfer of the wild-type p53 gene. Cancer Res,1994;54(9):2287
, 百拇医药
3，纪小龙，施作霖主编.诊断免疫组织化学.北京：军事医学科学出版社，1997：41
4，Kamb A, Gruis NA. Weaver-Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science,1994;264(15):436
5，Xiao S, Li DZ, Corson JM et al. Codeletion p15 and p16 genes in primary non-small cell carcinoma. Cancer Res,1995;55(15):2968
6，Shimizu T, Sexiya T. Loss of heterozygosity at p21 Loci and mutation of the MTS1 and MTS2 genes in human lung cancer. Int J Cancer,1995;63(4):616
7，Jim XM, Nguyen D, Zhang WW et al. Cell cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation by the p16 INK4 gene mediated by an adenovirus vector. Cancer Res,1995;55(1):3250
1999-09-28收稿，1999-12-29修回, http://www.100md.com
单位：安徽省立医院胸心外科，合肥 230001
关键词：肺肿瘤；遗传学；基因表达；免疫组织化学
安徽医科大学学报000110
摘要 目的 探讨p16基因产物在肺癌中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组化SP法检测82例肺癌组织中p16基因表达并结合肺癌的临床病理学特征及预后情况进行分析，40例癌旁正常肺组织作对照。结果 肺癌组织中p16基因产物阳性表达率为57.3%，癌旁正常肺组织为92.5%。肺癌组织中存在明显的p16基因表达缺失。肺癌组织中p16基因表达水平与肺癌的细胞分化程度、临床分期及预后有密切关系(P<0.05)。结论 p16基因表达缺失在肺癌发生、发展、分化和转归过程中起重要作用，检测肺癌组织中p16基因表达水平可作为判断肺癌进展和预后的一个重要参考指标。
, 百拇医药
中图分类号 R734.2；R392.31
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0030-03
Study on the expression of p16 gene production in lung cancer
MA Dongchun, Su Yuanshan, Wei Dazhong et al
(Dept of Thoracocardiac Surgery, Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
Abstract Objective To explore the expression of p16 gene product and its clinical significance in lung cancer. Methods 82 lung cancer specimens were examined with SP immunohistochemical staining. They were divided into groups, contrasted and analysed according to their clinicopathologic characteristics and prognosis,40 normal lung tissues as control. Results The positive expression rate of p16 gene was 57.3% in lung cancer, 92.5% in normal lung tissues, and there was obvious down-regulation expression of p16 gene in lung cancer. The expression level of p16 gene was closely related to cell differentiation, progression, and prognosis of lung cancer(P<0.05). Conclusion The deletion of p16 gene protein plays an important role in the tumorgenesis, development, differentiation,and prognosis in lung cancer, The expression level of p16 gene may be regarded as a referential index in judging the progression and prognosis of lung cancer.
, 百拇医药
MeSH lung neoplasms/genetics; gene expression; immunohistochemistry
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率近年来有逐年明显上升趋势，为探讨p16基因在肺癌发生、发展、分化和转归过程中的作用，我们对一组肺癌切除标本中P16基因产物进行免疫组化研究，现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 组织标本 取安徽省立医院胸外科1993年7月到1995年4月间经病理证实的肺癌切除标本82例，其中鳞癌43例，腺癌26例，腺磷癌7例，小细胞癌6例；高分化癌28例，中分化癌31例，低分化癌16例，未分化癌7例；Ⅰ期18例，Ⅱ期32例，Ⅲ期27例，Ⅳ期5例；术后存活时间>3年者32例，<3年者45例，5例失访。全部切除标本经福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续4 μm切片各两张，一张行HE染色复查诊断，另一张用p16基因蛋白免疫组化染色，取癌旁正常肺组织40例为对照。
, 百拇医药
1.2 试剂来源 兔抗人p16多克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶免疫组化染色试剂盒均为福州迈新生物技术开发公司产品。
1.3 实验方法 免疫组化染色方法选用操作简便、敏感性高、特异性强的链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase,SP)，具体染色过程按试剂盒内说明书进行。
1.4 结果判断标准 以细胞呈清晰标色为阳性，p16基因蛋白表达主要定位于胞浆或胞核(见图1)，按照阳性细胞百分比分：(-)阳性细胞<10%；(+)阳性细胞11%～25%；(
)阳性细胞26%～50%；()阳性细胞>50%。1.5 统计学处理方法 实验结果采用卡方检验，全部数据输入586微机，用Epi6软件作统计学处理。
, 百拇医药
图1 低分化鳞癌免疫组化染色结果
阳性部位位于胞浆内，p16(
),SP×2002 结果
2.1 p16基因蛋白在肺癌组织及癌旁正常肺组织中的表达情况 见表1，肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显低于癌旁正常肺组织，两组比较差异有高度显著性(P<0.01)。
表1 p16基因表达与肺癌临床病理特征及预后关系
类别
例数
p16阳性例数
阳性率%
, 百拇医药
P
+
组织来源
肺癌组织
82
33
9
5
57.3
癌旁正常肺组织
40
, 百拇医药
18
16
3
92.5
<0.01
分化程度
中高分化
59
29
7
3
66.1
低未分化
, 百拇医药 23
4
2
2
34.8
<0.05
临床分期
Ⅰ～Ⅱ期
50
24
5
5
68.0
Ⅲ～Ⅳ期
, 百拇医药
32
9
4
0
40.6
<0.05
存活时间
<3年
45
15
2
3
44.4
<0.05
, 百拇医药
>3年
32
17
5
2
75.0
<0.05
注：82例肺癌有5例失访，失访率为6.1%
2.2 p16基因蛋白在不同分化程度肺癌组织中的表达情况 从表1可以看出：随着肺癌分化程度降低，p16基因蛋白表达率逐渐下降，中高分化肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显高于低未分化肺癌组(P<0.05)。
2.3 p16基因蛋白表达与肺癌临床分期的关系 见表1。表明肺癌分期越晚，p16基因蛋白表达缺失越多，Ⅰ～Ⅱ期肺癌与Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 p16基因蛋白表达与肺癌的预后关系 见表1。研究结果表明术后存活时间>3年的肺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显高于术后存活时间<3年者(P<0.05)。
3 讨论
肺癌的发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多基因调控异常的过程〔1，2〕，其中癌基因的激活和(或)抑癌基因的突变、失活至关重要。p16基因是一种新型抑癌基因，它定位于9p21染色体上，编码表达分子量为15.8 ku的蛋白，该蛋白直接作用于细胞周期依赖激酶4(cell cyclin-dependent kinase 4,CDK4)，抑制CDK/周期蛋白D复合物的催化活性，阻止细胞由G1期向S期转变，从而抑制细胞增生和恶性转化，此外，p16蛋白还作用于CDK4、cyclin D和p110RB的反馈回路，通过调节p110RB蛋白活性防止细胞增殖，它在细胞周期的许多调节环节起到一个“闸”作用〔3〕，因此，如果p16基因突变、失活，则可引起细胞无限增殖和恶性转化，加之其它因素参与最终导致肿瘤发生。自1994年Kamb〔4〕首次发现并证实p16基因以来已有不少学者研究了p16基因在肺癌中的突变或缺失，Xiao等〔5〕用荧光原位杂交技术及DNA测序法检测18例非小细胞肺癌有15例基因缺失并检测出p16基因第72位密码子无义突变和第75位密码子错义突变。Shimizu等〔6〕用PCR-SSCP技术检测人原发性肺癌p16基因点突变，发现15例肺癌有2例存在点突变。Jim等〔7〕把p16基因导入无p16基因表达的肺癌细胞中，在离体和活体中均显示阻止肿瘤细胞的增殖，本研究应用免疫组化技术检测了一组肺癌组织及癌旁正常肺组织中p16基因蛋白的表达情况，结果发现肺癌组织中p16基因蛋白表达率明显低于癌旁正常肺组织，从蛋白质水平说明了p16基因突变、失活在肺癌的发生中起重要作用。
, http://www.100md.com
研究同时发现在中、高分化肺癌组织中，p16基因蛋白阳性表达率明显高于低未分化肺癌组织，表明p16基因蛋白表达与肺癌细胞分化程度有关，有可能作为判断肺癌恶性程度的标志。p16基因失活导致细胞增殖失控，失去正常分化能力。因此，p16基因缺失的肿瘤细胞其恶性程度高，分化不良。研究还发现Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织中p16基因蛋白表达率显著高于Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织，提示p16基因不仅调控肺癌的细胞分化，而且参与肺癌发展的整个病程，临床分期越晚的肺癌p16基因表达缺少越多，因此，检测肺癌组织中p16基因表达水平可间接反映肺癌的病程。
对77例肺癌患者的术后随访发现p16基因蛋白表达与肺癌的预后有一定联系，术后存活时间>3年的肺癌组织p16基因蛋白表达率明显高于术后存活时间<3年者，因此，肺癌组织中p16基因蛋白的表达水平可作为判断肺癌预后的一个重要参考指标。
作者简介：马冬春，男，32岁，主治医师，硕士；
, http://www.100md.com 疏元善，男，62岁，教授，主任医师，博士生导师，中国肺癌专业委员会委员，安徽省医学会胸心外科学会副主任委员，解放军105医院名誉院长
参考文献
1，Ohira T, Ohe Y, Heike Y et al. Gene therapy for lewis lung carcinoma with tumor necrosis factor and interleukin-2 cDNA cotransfected subline. Gene Ther,1994;1(4):269
2，Fujiwara T, Crimm EA, Mukhopadhyay T et al. Induction of chemosensitivity in human lung cancer cells in vivo by adenovirus mediated transfer of the wild-type p53 gene. Cancer Res,1994;54(9):2287
, 百拇医药
3，纪小龙，施作霖主编.诊断免疫组织化学.北京：军事医学科学出版社，1997：41
4，Kamb A, Gruis NA. Weaver-Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science,1994;264(15):436
5，Xiao S, Li DZ, Corson JM et al. Codeletion p15 and p16 genes in primary non-small cell carcinoma. Cancer Res,1995;55(15):2968
6，Shimizu T, Sexiya T. Loss of heterozygosity at p21 Loci and mutation of the MTS1 and MTS2 genes in human lung cancer. Int J Cancer,1995;63(4):616
7，Jim XM, Nguyen D, Zhang WW et al. Cell cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation by the p16 INK4 gene mediated by an adenovirus vector. Cancer Res,1995;55(1):3250
1999-09-28收稿，1999-12-29修回, http://www.100md.com