弓形虫主要表面抗原p30基因的扩增及克隆载体的构建
作者：游东生 沈继龙 马华 戴克胜 余龙
单位：游东生 马华 戴克胜(蚌埠医学院检验系，蚌埠 233003)；沈继龙(安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032)；余龙(复旦大学遗传所，上海 200433)
关键词：弓形虫属；遗传学；基因扩增；克隆；分子
安徽医科大学学报000105 摘要 目的 扩增弓形虫主要表面抗原p30基因编码序列并构建其多功能克隆载体。方法 设计合成引物，从弓形虫基因组DNA中扩增p30基因编码序列，通过TA连接将其克隆入pGEM-T载体，经两轮PCR筛选，并进行测序验证。结果 从弓形虫基因组DNA中扩增出p30基因编码序列，并成功地构建了序列正确的pGEM-T-p30克隆载体。结论 pGEM-T-p30克隆载体的成功构建，为进一步从基因水平研究p30及选择在不同表达系统中表达p30进行下一步研究创造了条件。
, 百拇医药
中图分类号 R382.5；R394
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0017-03
Amplification and cloning p30 of gene for major surface
antigen of toxoplasma gondii
You Dongsheng，Ma Hua et a
(1Dept of Laboratory Medicine, Bengbu Medical College, Bengbu 233003;
Shen Jilong，(2Dept of Microbiology and Parasitology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
, http://www.100md.com
Abstract Objective To amplify p30 gene and construct a multifunctional cloning vector. Methods p30 gene was amplified from T gondii chromosomal DNA and TA-ligated to pGEM-T. Recombinants were screened by two rounds of PCR and sequencing. Results p30 gene was amplified and a multifunctional cloning vector of pGEM-T-p30 was successfully constructed. Conclusion TA ligated pGEM-T-p30 flanking by 17 restriction enzymes sites and a replication origin can be acted as a convenient beginning point for further investigation on p30 at a DNA or recombinant protein level.
, 百拇医药
MeSH toxoplasma/genetics; gene amplification; cloning, molecular
弓形虫是人和几乎所有动物的有核细胞内的专
一性寄生虫。成人感染后一般为无症状带虫状态，先天性感染能导致流产、畸胎或死胎，恶性肿瘤及艾滋病后继发的弓形虫机会性感染往往是导致死亡的重要原因〔1〕；动物弓形虫病也给畜牧业带来很大经济损失。弓形虫主要表面抗原p30被认为在虫体入侵、虫株毒力及机体保护性免疫方面能发挥重要作用〔2〕。对p30的研究最初是从速殖子中直接提取p30进行，但由于蛋白总量少，操作烦琐，且操作条件对蛋白本身的影响，因而阻碍了蛋白质化学和免疫学方法的深入研究〔3〕。应用分子生物学方法，使p30抗原在其他细胞中进行表达成为可能，并可能进一步从基因水平探讨其作用机制和作用方式。
1 材料及方法
, 百拇医药
1.1 材料
1.1.1 实验动物 弓形虫RH株，上海第二医科大学寄生虫教研室保种；昆明株小鼠，♀♂不限，体重20 g±5 g，本院实验动物科提供(皖医实动准字01号)。
1.1.2 质粒及菌株 质粒pGEM-T，Promega公司产品；DH5α，复旦大学遗传所保种。
1.1.3 主要试剂及仪器 Taq plusⅡ DNA polymerase, Sangon公司产品；TaqDNApolymerase、内切酶SalI、EcoRI、T4 DNA Ligase为Promega公司产品；PCR产物纯化试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒，购于BOEHRINGER MANNHERM公司。DNA ENGINE为MJ RESEARCH产品；生物电泳凝胶成像系统，上海复日公司；377DNA测序仪，PE公司；Mini Sub-Cell，Bio-Rad公司产品。
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1.1.4 引物合成 p30基因扩增引物由上海生化所合成；pGEM-T筛选和测序引物由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 弓形虫速殖子收集、纯化及DNA提取 RH株速殖子复苏后连续在小鼠中传代，感染3天后无菌操作抽取腹水，血性及感染性腹水弃去。取速殖子计数每毫升大于106的腹水用胰酶消化后用生理盐水洗3次。速殖子沉淀与细胞裂解液(1%SDS，10 mmol.L-1 TE，0.1 g.L-1蛋白酶K)于74℃作用1 h，裂解后溶液用酚/氯仿/异戊醇抽提3次，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤后风干，沉淀溶于水后-20℃保存。
1.2.2 体外扩增p30基因 根据文献报道的p30开放阅读框〔4〕设计合成引物：P1：5CCG AAT TCA TGT CGG TTT CGC TGC A 3；P2：5ACA AGC TTT CAC GCG ACA CAA GCT G 3。P1、P2分别带有2个保护性碱基和EcoRI、HindⅢ酶切位点。PCR扩增体系：ddWater，18.9 μl；10×Buffer，2.5 μl；MgCl2，1.0 μl；dNTPs，0.5 μl；primers, 0.4+0.4 μl; template, 1.0 μl; Taq plus Ⅱ DNA polymerase, 0.3 μl。PCR循环方式：94℃变性5 min；94℃ 45 s，62℃ 45 s,72℃ 1 min，共35循环；72℃延伸10 min。PCR产物纯化按试剂盒说明进行。
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1.2.3 质粒pGEM-T与p30基因扩增产物的连接及转化 按文献〔5〕制备感受态细胞DH5α。以5∶1摩尔比将p30基因扩增产物和pEGM-T于4℃连接过夜，将连接反应液转化涂布于LB/AMP/IPTG/X-gal平板，37℃过夜培养。
1.2.4 阳性克隆的筛选 抗生素及颜色筛选后，挑取单个白色菌落，同时进行点种和作为模板加入PCR反应液进行扩增，反应同前。引物为P1、P2及针对pGEM-T序列上的F2、R2。F2位于T突出端5'上游，序列为：5'CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3'；R2位于T突出端3'下游，序列为：5'TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C3'。第一轮筛选用引物F2和R2扩增，第二轮用引物P1和R2扩增，并比较验证2次筛选片段与p30体外扩增产物的大小。
1.2.5 阳性克隆的小规模质粒DNA提取及插入片段的序列测定 质粒DNA提取按试剂盒说明书操作。取浓度大于50 mg.L-1的DNA溶解液10 μl，用引物F2和R2在377 DNA测序仪上样测序。
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2 结果
2.1 p30基因体外扩增 PCR反应液5 μl加样于1%琼脂糖凝胶，150V电泳15 min后观察，可见在1375 bp和947 bp之间出现一特异条带，大小与理论长度1027 bp相符。见图1。
图1 p30基因PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳
1、3、4：扩增的p30基因；2：阴性对照；M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ
2.2 阳性克隆的筛选 引物F2和R2扩增产物经1%琼脂糖凝胶150V电泳15 min后观察，在14个随机挑选的克隆中共筛出4个有插入片段的克隆，片段大小为1268 bp。用引物P1和R2扩增4个有插入片段的克隆，共筛选出3个插入方向正确的克隆，扩增片段大小为1161 bp。取克隆8的3对引物扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电脉，比较其片段大小。见图2
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2.3 克隆载体pGEM-T-p30 DNA插入片段序列测定 p30基因编码序列及引物P1和P2两端的酶切位点的保护性碱基已正确连入pGEM-T，克隆8在1027 bp长的插入片段中有两个碱基改变：630G→A，686A→G；相应密码子改变为UCG→UCU，UAC→UGC，氨基酸在630位为无义突变，在686位由酪氨酸变为半胱氨酸。
3 讨论
p30抗原是弓形虫最主要的抗原物质，在虫体入侵和虫株毒力等方面起重要作用。蛋白质化学和免疫学研究因p30分离困难和方法本身限制而进展缓慢，从基因水平及用基因工程方法研究p30将是最有前途的选择。本文将p30基因编码序列插入载体pGEM-T的MCS内，筛选后经测序得到了确证。pGEM-T-p30转化于DH5α内，能稳定保存，随时使用。已插入的p30完整编码序列便于构建缺失突变体来研究p30内各个片段相应的作用。p30基因两端的共17个限制酶位点可根据不同的表达系统而作相应选择。此克隆载体的另一优点还在于，同时导入一恰当辅助噬菌体，可生成p30基因的单链探针，来筛选与p30有相似作用或相同成分的其它原虫或动物的基因，发现可能的新基因，或者通过基因间相互比较，进行进化史方面研究。
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图2 筛选所用引物扩增所得片段与体外扩增产物片段比较
M：λDNA/HindⅢ；1：引物P1和P2扩增的p30；
2：引物P1和R2的筛选；3：引物F2和R2的筛选
PCR产物的TA克隆方便、快捷。本文所选用的DNA聚合酶为Taq plusⅡ，它是由Taq及Deep两种DNA聚合酶混合而成，理论上Deep DNA聚合酶不能产生A突出端，但实验过程中连接的效率并不低(5/14)。筛出的3个方向正确连接的克隆的测序结果显示，有两个其实不是通过TA连接而成(资料未显示)。因而推测在高效DNA连接酶的作用下，在宿主菌内，无A突出端的扩增产物也能与T载体连接。
p30基因插入片段序列测定结果与Burg等的结果有两个碱基差异〔4〕， 但无陈晓光等报道的碱基变化〔6〕。体外扩增时DNA的错配可能是碱基差异的原因，而不是地理差异引起同一弓形虫株p30基因序列的不同。本文对正确连入的3个克隆都进行了测序，错配位置不完全相同，推测在宿主菌内也发生了少量单个碱基的突变。本研究已进一步选择了此克隆载体上的两个酶，切下p30编码序列进行了融合表达及鉴定，为探索p30抗原的结构及功能及疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础。
, http://www.100md.com
基金项目：中华人民共和国卫生部优秀青年科研基金资助(Q9454)
作者简介：游东生，27岁，男，硕士研究生
沈继龙，46岁，男，博士，教授，硕士生导师
参考资料
1，Keith A, Jean D. Toxoplasma gondii: a protozoan for the nineties. Infect Immun, 1993;61(4):1169～1172
2，沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原研究进展.中国人兽共患病杂志，1990；6(3)：50～53
3，沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原的免疫化学研究.中国人兽共患病杂志，1990；6(4)：14～17
, 百拇医药
4，Burg JL, Perelman D, Kasper LH et al. Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of T gondii. J Immunol, 1988;141(10):3584～3591
5，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:10
6，陈晓光，江静波.应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原的基因及其序列分析测定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1994；12(2)：129～133
1999-10-29收稿，1999-12-06修回, 百拇医药
单位：游东生 马华 戴克胜(蚌埠医学院检验系，蚌埠 233003)；沈继龙(安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032)；余龙(复旦大学遗传所，上海 200433)
关键词：弓形虫属；遗传学；基因扩增；克隆；分子
安徽医科大学学报000105 摘要 目的 扩增弓形虫主要表面抗原p30基因编码序列并构建其多功能克隆载体。方法 设计合成引物，从弓形虫基因组DNA中扩增p30基因编码序列，通过TA连接将其克隆入pGEM-T载体，经两轮PCR筛选，并进行测序验证。结果 从弓形虫基因组DNA中扩增出p30基因编码序列，并成功地构建了序列正确的pGEM-T-p30克隆载体。结论 pGEM-T-p30克隆载体的成功构建，为进一步从基因水平研究p30及选择在不同表达系统中表达p30进行下一步研究创造了条件。
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中图分类号 R382.5；R394
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0017-03
Amplification and cloning p30 of gene for major surface
antigen of toxoplasma gondii
You Dongsheng，Ma Hua et a
(1Dept of Laboratory Medicine, Bengbu Medical College, Bengbu 233003;
Shen Jilong，(2Dept of Microbiology and Parasitology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
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Abstract Objective To amplify p30 gene and construct a multifunctional cloning vector. Methods p30 gene was amplified from T gondii chromosomal DNA and TA-ligated to pGEM-T. Recombinants were screened by two rounds of PCR and sequencing. Results p30 gene was amplified and a multifunctional cloning vector of pGEM-T-p30 was successfully constructed. Conclusion TA ligated pGEM-T-p30 flanking by 17 restriction enzymes sites and a replication origin can be acted as a convenient beginning point for further investigation on p30 at a DNA or recombinant protein level.
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MeSH toxoplasma/genetics; gene amplification; cloning, molecular
弓形虫是人和几乎所有动物的有核细胞内的专
一性寄生虫。成人感染后一般为无症状带虫状态，先天性感染能导致流产、畸胎或死胎，恶性肿瘤及艾滋病后继发的弓形虫机会性感染往往是导致死亡的重要原因〔1〕；动物弓形虫病也给畜牧业带来很大经济损失。弓形虫主要表面抗原p30被认为在虫体入侵、虫株毒力及机体保护性免疫方面能发挥重要作用〔2〕。对p30的研究最初是从速殖子中直接提取p30进行，但由于蛋白总量少，操作烦琐，且操作条件对蛋白本身的影响，因而阻碍了蛋白质化学和免疫学方法的深入研究〔3〕。应用分子生物学方法，使p30抗原在其他细胞中进行表达成为可能，并可能进一步从基因水平探讨其作用机制和作用方式。
1 材料及方法
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1.1 材料
1.1.1 实验动物 弓形虫RH株，上海第二医科大学寄生虫教研室保种；昆明株小鼠，♀♂不限，体重20 g±5 g，本院实验动物科提供(皖医实动准字01号)。
1.1.2 质粒及菌株 质粒pGEM-T，Promega公司产品；DH5α，复旦大学遗传所保种。
1.1.3 主要试剂及仪器 Taq plusⅡ DNA polymerase, Sangon公司产品；TaqDNApolymerase、内切酶SalI、EcoRI、T4 DNA Ligase为Promega公司产品；PCR产物纯化试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒，购于BOEHRINGER MANNHERM公司。DNA ENGINE为MJ RESEARCH产品；生物电泳凝胶成像系统，上海复日公司；377DNA测序仪，PE公司；Mini Sub-Cell，Bio-Rad公司产品。
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1.1.4 引物合成 p30基因扩增引物由上海生化所合成；pGEM-T筛选和测序引物由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 弓形虫速殖子收集、纯化及DNA提取 RH株速殖子复苏后连续在小鼠中传代，感染3天后无菌操作抽取腹水，血性及感染性腹水弃去。取速殖子计数每毫升大于106的腹水用胰酶消化后用生理盐水洗3次。速殖子沉淀与细胞裂解液(1%SDS，10 mmol.L-1 TE，0.1 g.L-1蛋白酶K)于74℃作用1 h，裂解后溶液用酚/氯仿/异戊醇抽提3次，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤后风干，沉淀溶于水后-20℃保存。
1.2.2 体外扩增p30基因 根据文献报道的p30开放阅读框〔4〕设计合成引物：P1：5CCG AAT TCA TGT CGG TTT CGC TGC A 3；P2：5ACA AGC TTT CAC GCG ACA CAA GCT G 3。P1、P2分别带有2个保护性碱基和EcoRI、HindⅢ酶切位点。PCR扩增体系：ddWater，18.9 μl；10×Buffer，2.5 μl；MgCl2，1.0 μl；dNTPs，0.5 μl；primers, 0.4+0.4 μl; template, 1.0 μl; Taq plus Ⅱ DNA polymerase, 0.3 μl。PCR循环方式：94℃变性5 min；94℃ 45 s，62℃ 45 s,72℃ 1 min，共35循环；72℃延伸10 min。PCR产物纯化按试剂盒说明进行。
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1.2.3 质粒pGEM-T与p30基因扩增产物的连接及转化 按文献〔5〕制备感受态细胞DH5α。以5∶1摩尔比将p30基因扩增产物和pEGM-T于4℃连接过夜，将连接反应液转化涂布于LB/AMP/IPTG/X-gal平板，37℃过夜培养。
1.2.4 阳性克隆的筛选 抗生素及颜色筛选后，挑取单个白色菌落，同时进行点种和作为模板加入PCR反应液进行扩增，反应同前。引物为P1、P2及针对pGEM-T序列上的F2、R2。F2位于T突出端5'上游，序列为：5'CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3'；R2位于T突出端3'下游，序列为：5'TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C3'。第一轮筛选用引物F2和R2扩增，第二轮用引物P1和R2扩增，并比较验证2次筛选片段与p30体外扩增产物的大小。
1.2.5 阳性克隆的小规模质粒DNA提取及插入片段的序列测定 质粒DNA提取按试剂盒说明书操作。取浓度大于50 mg.L-1的DNA溶解液10 μl，用引物F2和R2在377 DNA测序仪上样测序。
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2 结果
2.1 p30基因体外扩增 PCR反应液5 μl加样于1%琼脂糖凝胶，150V电泳15 min后观察，可见在1375 bp和947 bp之间出现一特异条带，大小与理论长度1027 bp相符。见图1。
图1 p30基因PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳
1、3、4：扩增的p30基因；2：阴性对照；M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ
2.2 阳性克隆的筛选 引物F2和R2扩增产物经1%琼脂糖凝胶150V电泳15 min后观察，在14个随机挑选的克隆中共筛出4个有插入片段的克隆，片段大小为1268 bp。用引物P1和R2扩增4个有插入片段的克隆，共筛选出3个插入方向正确的克隆，扩增片段大小为1161 bp。取克隆8的3对引物扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电脉，比较其片段大小。见图2
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2.3 克隆载体pGEM-T-p30 DNA插入片段序列测定 p30基因编码序列及引物P1和P2两端的酶切位点的保护性碱基已正确连入pGEM-T，克隆8在1027 bp长的插入片段中有两个碱基改变：630G→A，686A→G；相应密码子改变为UCG→UCU，UAC→UGC，氨基酸在630位为无义突变，在686位由酪氨酸变为半胱氨酸。
3 讨论
p30抗原是弓形虫最主要的抗原物质，在虫体入侵和虫株毒力等方面起重要作用。蛋白质化学和免疫学研究因p30分离困难和方法本身限制而进展缓慢，从基因水平及用基因工程方法研究p30将是最有前途的选择。本文将p30基因编码序列插入载体pGEM-T的MCS内，筛选后经测序得到了确证。pGEM-T-p30转化于DH5α内，能稳定保存，随时使用。已插入的p30完整编码序列便于构建缺失突变体来研究p30内各个片段相应的作用。p30基因两端的共17个限制酶位点可根据不同的表达系统而作相应选择。此克隆载体的另一优点还在于，同时导入一恰当辅助噬菌体，可生成p30基因的单链探针，来筛选与p30有相似作用或相同成分的其它原虫或动物的基因，发现可能的新基因，或者通过基因间相互比较，进行进化史方面研究。
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图2 筛选所用引物扩增所得片段与体外扩增产物片段比较
M：λDNA/HindⅢ；1：引物P1和P2扩增的p30；
2：引物P1和R2的筛选；3：引物F2和R2的筛选
PCR产物的TA克隆方便、快捷。本文所选用的DNA聚合酶为Taq plusⅡ，它是由Taq及Deep两种DNA聚合酶混合而成，理论上Deep DNA聚合酶不能产生A突出端，但实验过程中连接的效率并不低(5/14)。筛出的3个方向正确连接的克隆的测序结果显示，有两个其实不是通过TA连接而成(资料未显示)。因而推测在高效DNA连接酶的作用下，在宿主菌内，无A突出端的扩增产物也能与T载体连接。
p30基因插入片段序列测定结果与Burg等的结果有两个碱基差异〔4〕， 但无陈晓光等报道的碱基变化〔6〕。体外扩增时DNA的错配可能是碱基差异的原因，而不是地理差异引起同一弓形虫株p30基因序列的不同。本文对正确连入的3个克隆都进行了测序，错配位置不完全相同，推测在宿主菌内也发生了少量单个碱基的突变。本研究已进一步选择了此克隆载体上的两个酶，切下p30编码序列进行了融合表达及鉴定，为探索p30抗原的结构及功能及疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础。
, http://www.100md.com
基金项目：中华人民共和国卫生部优秀青年科研基金资助(Q9454)
作者简介：游东生，27岁，男，硕士研究生
沈继龙，46岁，男，博士，教授，硕士生导师
参考资料
1，Keith A, Jean D. Toxoplasma gondii: a protozoan for the nineties. Infect Immun, 1993;61(4):1169～1172
2，沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原研究进展.中国人兽共患病杂志，1990；6(3)：50～53
3，沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原的免疫化学研究.中国人兽共患病杂志，1990；6(4)：14～17
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4，Burg JL, Perelman D, Kasper LH et al. Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of T gondii. J Immunol, 1988;141(10):3584～3591
5，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:10
6，陈晓光，江静波.应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原的基因及其序列分析测定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1994；12(2)：129～133
1999-10-29收稿，1999-12-06修回, 百拇医药