人视交叉上核加压素基因表达的昼夜节律改变
作者：刘荣玉 周江宁
单位：安徽医科大学第一附属医院老年病科，合肥 230022
关键词：血管升压素类；昼夜节律；视交叉上核；原位杂交
安徽医科大学学报000202
摘要 目的 探讨人视交叉上核加压素mRNA表达与昼夜节律的关系。方法 采用原位杂交和生物图像分析技术定量分析25例受试者，视交叉上核加压素mRNA表达水平。 结果 人视交叉上核加压素mRNA表达呈现明显的昼夜变化，白天加压素mRNA表达水平比夜间高40%。结论 人视交叉上核加压素mRNA的昼夜节律性表达可能是在基因水平调控人体生物节律的重要机制之一。
中图分类号 R392.31
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0088-03
, 百拇医药
The diurnal rhythm of vasopressin mRNA in the human suprachiasmatic nucleus
Liu Rongyu，Zhou Jiangning
(Geriotric Dept, The 1st Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022)
Abstract Objective To investigate whether the daily light-dark cycle would affect the expression of vasopressin mRNA of the human suprachiasmatic nucleus (SCN). Methods The expression of vasopressin mRNA of the SCN in 25 patients were investigated using in situ hybridization and image analysis system. Results The amount of vasopressin mRNA in the SCN fluctuated significantly over the 24 hour period. The amount of vasopressin mRNA was 40% higher during the daytime than during the nighttime. Conclusion The diurnal rhythm of vasopressin mRNA in the SCN is considered as an important molecular mechanism to control human biological rhythm.
, 百拇医药
MeSH vasopressins; circadian rhythm; suprachiasmatic nucleus; in situ hybridization
下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)是哺乳类动物昼夜节律调节系统的中枢结构，产生和调节睡眠—觉醒、激素、代谢和生殖等众多生物节律〔1〕。睡眠障碍、激素和行为的昼夜节律紊乱是老年人常见的症状，SCN的结构和功能改变被认为是上述紊乱的神经生物学基础〔2〕。人体SCN含多种肽能神经元，加压素神经元是其主要的起搏细胞。我们前期的研究观察到：人SCN加压素免疫活
性神经元数目呈明显的昼夜节律变化。为建立研究人体SCN基因调控细胞和分子机制的模型，并进一步研究SCN加压素的分子合成是否亦表现昼夜节律性改变，本研究观察了人SCN加压素mRNA表达与昼夜时间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 受试者和分组 标本来自25例受试者的脑组织。患者均有完整的临床和神经病理学档案，生前无神经、精神疾病病史，死亡后经神经病理学证实无器质性神经系统改变。患者生前均填写了捐献脑组织的志愿书。患者死亡后，按荷兰脑库的程序施行脑病理解剖，根据受试者死亡的时间分为白天组(10：00～22：00)和夜晚组(22：00～10：00)。这种时间分组是根据我们前期工作的基础而设定的〔3〕。
1.2 SCN加压素mRNA的测量 采用组织为福尔马林固定、石蜡包埋标本。切片厚度6 μm。在SCN连续切片每隔300 μm取片一张进行原位杂交。加压素探针(hyp3)由48个寡核苷酸组成，探针的特异性曾在以前的报道〔4〕中详细描述。简述如下：用末端脱氧核苷酸转移酶(boehringer mannheim)和[α-35S]dATP标记探针的3-末端，除去蛋白和脱酯外，组织预处理主要按我们前期报道〔5〕进行。去蛋白过程由蛋白激酶K处理30 min改为15 min。0.1%三甲基苯X-100磷酸缓冲液(PBS)浸泡10 min脱酯。杂交前不再脱水而是用PBS液清洗。每张切片用68 μl杂交液孵育，约含有1×106 cpm的标记探针。42℃孵育一夜后，切片在50℃用1倍SSC漂洗30 min，在50℃用0.1倍SSC漂洗2×30 min，再在室温下用0.1倍SSC漂洗2×30 min。切片在30 mmol*L-1醋酸铵(pH 5.5)和100%乙醇溶液中按下列容积比例依次脱水：1∶1，3∶7，1∶9和0∶1。用β-max高敏胶片(Amersham UK)曝光切片2天以检查放射自显影信号。然后在摄影乳胶液中浸渍切片并曝光17天。切片在15℃ Detol显影液(Sigma)中显影4 min，在Kodak定影液(Sigma)中定影14 min，然后清洗切片去除固定剂并用硫堇复染。
, 百拇医药
1.3 加压素mRNA定量分析 为定量分析SCN内加压素mRNA的杂交信号，将IBAS-KAT图像分析系统连接于配有SONY XL-77CE摄像头的Zeiss显微镜。显微镜同时配有扫描平台。在我们以前的论文〔5〕中曾详细描述了IBAS测量的原理和程序。简述如下：在低倍镜(2.5倍物镜)标出SCN的区域，用网络覆盖该区域；计算机随机选取该网格内50%的区域，存贮40倍物镜下的图像；用颜色标记该图像内的银颗粒，图像分析程序计算标记的银颗粒总数；在完整的SCN内，每隔300 μm一张切片，测算该切片SCN mRNA的表达并存贮结果；最终计算：①在SCN内表达加压素mRNA细胞的总数；②细胞内标记的银颗粒的总量，即加压素mRNA的表达量 (图1)。
1.4 统计学分析 组间差异采用非参数检验(Mann-Whitney U检验)，脑重量、死亡时间与加压素mRNA量之间的相关关系用非参数相关分析Spearman检验。数据用
±s表示。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 原位杂交显示人SCN加压素mRNA表达神经元主要分布于SCN的背内侧部，采用相邻切片免疫组织化学染色证实加压素免疫阳性神经元与表达
图1 SCN加压素mRNA原位杂交信号的定量分析
A.低倍镜(2.5倍物镜)标出SCN的区域，用网络覆盖该区域，计算机随机选取该网格内50%的区域。Ⅲ：第三脑室；OC：视交叉； SON：视上核
B. 40倍物镜下的图像，用颜色标记该图像内的银颗粒
加压素mRNA的神经元为同一细胞群。与夜间组(7 019±1 244)相比，白天组SCN内标记的银颗粒总量，即加压素mRNA的表达量(11 045±1 909)增加40%(P=0.02；)。而两组间SCN内表达加压素mRNA的细胞数差异无显著性(分别为22 526±3 060 和 24 514±2 594；P=0.19),见表1。
, 百拇医药
2.2 SCN加压素mRNA量与年龄(r=0.34，P=0.1)、脑重量(r=0.31，P=0.14)和死后延搁时间(r=0.27；P=0.21)无显著相关。夜间组和白天组间年龄(P=0.98)、脑重量(P=0.67)和死后延搁时间(P=0.28)差异均无显著性。见表1。
3 讨论
从人的出生到死亡，生物节律现象贯穿始终，SCN是哺乳类动物产生和调节昼夜节律的中枢结构。一方面，SCN具有自主性昼夜节律如电生理特性、糖的利用和蛋白质合成等；另一方面，SCN接受整合外环境的光信息，使生物的内在节律与外环境同步。本研究首次采用原位杂交的方法，在福尔马林固定的石蜡切片观察到了人SCN加压素mRNA表达神经元，并进行了定量测量。研究发现SCN加压素mRNA表达呈明显的昼夜节律，即昼高夜低。该结果与动物实验的结果一致。有趣的是，尽管为夜行昼伏类动物，在大鼠和小鼠SCN加压素mRNA水平亦表现为昼高夜低的昼夜节律〔6〕。这一mRNA节律提示加压素合成的昼夜变化可能是SCN调节生理和行为节律的重要机制之一。在哺乳类动物，加压素mRNA昼夜节律的确切生理作用不清。目前的研究提示：SCN加压素合成的节律性决定了脑内和脑脊液内加压素多肽的浓度〔6〕，后者参与调节皮质醇等激素昼夜节律水平〔7〕。因此，加压素基因被认为是“生物钟调控”基因。由于加压素基因在特异性的SCN神经元呈昼夜节律性表达，而这些神经元具有昼夜节律性自动起搏细胞的功能，因此，采用原位杂交的方法观察SCN加压素的基因表达，为研究昼夜节律基因调控的细胞和分子机制提供了一重要的模型。本研究观察到加压素mRNA的昼夜变化与SCN加压素免疫活性神经元数目的昼夜变化一致。我们前期的工作发现：人SCN加压素免疫活性神经元的数目在脑老化、Alzheimer病(AD)患者明显降低。我们近期的研究发现：SCN加压素的基因表达在80岁以上老人显著降低〔2〕。而AD患者加压素的基因表达仅为对照组的1/3。一个有趣的现象是：在抑郁症患者，SCN加压素的mRNA表达仅为对照组的1/2；与之相反，抑郁症患者SCN加压素免疫活性神经元的数目比对照组高1倍。该结果提示同时在蛋白质和基因水平研究加压素的改变是十分重要的，在不同疾病过程中蛋白质和基因的表达水平可能不同。如果仅依赖一个方法，有可能得出不正确的结论。本研究首次观察到了人SCN加压素mRNA昼夜节律性表达，该结果可为研究人体昼夜节律基因调控的细胞和分子机制提供一种研究模型。
, 百拇医药
表1 患者病理学资料和加压素mRNA表达的关系(±s) 组别
数目(个)
年龄(岁)
脑重量(g)
PMD(h)
VPmRNA总量(μm2)
VPmRNA的细胞数(个)
白天
14
68±5
, 百拇医药
1 310±80
23±7
11 045±1 909
24 514±2 594
黑夜
11
70±4
1 279±34
8±1
7 019±1 244
22 526±3 060
P值
, http://www.100md.com
0.98
0.67
0.28
0.02
0.19
PMD：死后延搁时间； VPmRNA：加压素mRNA
基金项目：国家自然科学基金课题(编号：39940004)
作者简介：刘荣玉，女，42岁，副教授
周江宁，男，44岁，教授，博士生导师
参考文献
1，Zhou JN， Swaab DF. Activation and degeneration during aging: A morphometric study of the human hypothalamus. Microsc Res Tech, 1999; 44:36～48
, http://www.100md.com
2，Liu RY, Zhou JN, Hoogendijk WTJ et al. Decreased vasopressin gene expression in the biological clock of Alzheimers disease with and without depression. J Neuropathol Exp Neurol， 2000; 59:50～58
3，Liu RY, Zhou JN, Van Heerkhuize J et al. Decreased melatonin levels in postmortem cerebrospinal fluid in relation to aging, Alzheimers disease and apolipoprotein E-ε 4/4 genotype. J Clin Endocrinol Metab， 1999; 84:323～327
4，Mengod G, Charli JL, Palacios JM. The use of in situ hybridization histochemistry for the study of neuropeptides gene expression in the human brain. Cell Mol Neurobiol， 1990；10: 113～126
, 百拇医药
5，Guldenaar SE, Veldkamp B, Bakker O et al. Thyrotropin-releasing hormone gene expression in the human hypothalamus. Brain Res， 1996；743:93～101
6，Inouye SI, Shibata S. Neurochemical organization of circadion rhythm in the suprachiasmatic nucleus. Neurosci Res, 1994;20:109～130
7，Reppert SM, Schwarz WJ， Uhl GR. Arginine vasopressin: a novel peptide rhythm in cerebrospinal fluid. TINS. 1987;10:76～80
8，Kalsbeek A, Buijs RM, van Heerikhuize JJ et al. Vasopressin-containing neurons of the suprachiasmatic nuclei inhibits corticosterone release. Brain Res，1992；580: 62～67
2000-04-18收稿, 百拇医药
单位：安徽医科大学第一附属医院老年病科，合肥 230022
关键词：血管升压素类；昼夜节律；视交叉上核；原位杂交
安徽医科大学学报000202
摘要 目的 探讨人视交叉上核加压素mRNA表达与昼夜节律的关系。方法 采用原位杂交和生物图像分析技术定量分析25例受试者，视交叉上核加压素mRNA表达水平。 结果 人视交叉上核加压素mRNA表达呈现明显的昼夜变化，白天加压素mRNA表达水平比夜间高40%。结论 人视交叉上核加压素mRNA的昼夜节律性表达可能是在基因水平调控人体生物节律的重要机制之一。
中图分类号 R392.31
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0088-03
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The diurnal rhythm of vasopressin mRNA in the human suprachiasmatic nucleus
Liu Rongyu，Zhou Jiangning
(Geriotric Dept, The 1st Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022)
Abstract Objective To investigate whether the daily light-dark cycle would affect the expression of vasopressin mRNA of the human suprachiasmatic nucleus (SCN). Methods The expression of vasopressin mRNA of the SCN in 25 patients were investigated using in situ hybridization and image analysis system. Results The amount of vasopressin mRNA in the SCN fluctuated significantly over the 24 hour period. The amount of vasopressin mRNA was 40% higher during the daytime than during the nighttime. Conclusion The diurnal rhythm of vasopressin mRNA in the SCN is considered as an important molecular mechanism to control human biological rhythm.
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MeSH vasopressins; circadian rhythm; suprachiasmatic nucleus; in situ hybridization
下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)是哺乳类动物昼夜节律调节系统的中枢结构，产生和调节睡眠—觉醒、激素、代谢和生殖等众多生物节律〔1〕。睡眠障碍、激素和行为的昼夜节律紊乱是老年人常见的症状，SCN的结构和功能改变被认为是上述紊乱的神经生物学基础〔2〕。人体SCN含多种肽能神经元，加压素神经元是其主要的起搏细胞。我们前期的研究观察到：人SCN加压素免疫活
性神经元数目呈明显的昼夜节律变化。为建立研究人体SCN基因调控细胞和分子机制的模型，并进一步研究SCN加压素的分子合成是否亦表现昼夜节律性改变，本研究观察了人SCN加压素mRNA表达与昼夜时间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 受试者和分组 标本来自25例受试者的脑组织。患者均有完整的临床和神经病理学档案，生前无神经、精神疾病病史，死亡后经神经病理学证实无器质性神经系统改变。患者生前均填写了捐献脑组织的志愿书。患者死亡后，按荷兰脑库的程序施行脑病理解剖，根据受试者死亡的时间分为白天组(10：00～22：00)和夜晚组(22：00～10：00)。这种时间分组是根据我们前期工作的基础而设定的〔3〕。
1.2 SCN加压素mRNA的测量 采用组织为福尔马林固定、石蜡包埋标本。切片厚度6 μm。在SCN连续切片每隔300 μm取片一张进行原位杂交。加压素探针(hyp3)由48个寡核苷酸组成，探针的特异性曾在以前的报道〔4〕中详细描述。简述如下：用末端脱氧核苷酸转移酶(boehringer mannheim)和[α-35S]dATP标记探针的3-末端，除去蛋白和脱酯外，组织预处理主要按我们前期报道〔5〕进行。去蛋白过程由蛋白激酶K处理30 min改为15 min。0.1%三甲基苯X-100磷酸缓冲液(PBS)浸泡10 min脱酯。杂交前不再脱水而是用PBS液清洗。每张切片用68 μl杂交液孵育，约含有1×106 cpm的标记探针。42℃孵育一夜后，切片在50℃用1倍SSC漂洗30 min，在50℃用0.1倍SSC漂洗2×30 min，再在室温下用0.1倍SSC漂洗2×30 min。切片在30 mmol*L-1醋酸铵(pH 5.5)和100%乙醇溶液中按下列容积比例依次脱水：1∶1，3∶7，1∶9和0∶1。用β-max高敏胶片(Amersham UK)曝光切片2天以检查放射自显影信号。然后在摄影乳胶液中浸渍切片并曝光17天。切片在15℃ Detol显影液(Sigma)中显影4 min，在Kodak定影液(Sigma)中定影14 min，然后清洗切片去除固定剂并用硫堇复染。
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1.3 加压素mRNA定量分析 为定量分析SCN内加压素mRNA的杂交信号，将IBAS-KAT图像分析系统连接于配有SONY XL-77CE摄像头的Zeiss显微镜。显微镜同时配有扫描平台。在我们以前的论文〔5〕中曾详细描述了IBAS测量的原理和程序。简述如下：在低倍镜(2.5倍物镜)标出SCN的区域，用网络覆盖该区域；计算机随机选取该网格内50%的区域，存贮40倍物镜下的图像；用颜色标记该图像内的银颗粒，图像分析程序计算标记的银颗粒总数；在完整的SCN内，每隔300 μm一张切片，测算该切片SCN mRNA的表达并存贮结果；最终计算：①在SCN内表达加压素mRNA细胞的总数；②细胞内标记的银颗粒的总量，即加压素mRNA的表达量 (图1)。
1.4 统计学分析 组间差异采用非参数检验(Mann-Whitney U检验)，脑重量、死亡时间与加压素mRNA量之间的相关关系用非参数相关分析Spearman检验。数据用
±s表示。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 原位杂交显示人SCN加压素mRNA表达神经元主要分布于SCN的背内侧部，采用相邻切片免疫组织化学染色证实加压素免疫阳性神经元与表达
图1 SCN加压素mRNA原位杂交信号的定量分析
A.低倍镜(2.5倍物镜)标出SCN的区域，用网络覆盖该区域，计算机随机选取该网格内50%的区域。Ⅲ：第三脑室；OC：视交叉； SON：视上核
B. 40倍物镜下的图像，用颜色标记该图像内的银颗粒
加压素mRNA的神经元为同一细胞群。与夜间组(7 019±1 244)相比，白天组SCN内标记的银颗粒总量，即加压素mRNA的表达量(11 045±1 909)增加40%(P=0.02；)。而两组间SCN内表达加压素mRNA的细胞数差异无显著性(分别为22 526±3 060 和 24 514±2 594；P=0.19),见表1。
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2.2 SCN加压素mRNA量与年龄(r=0.34，P=0.1)、脑重量(r=0.31，P=0.14)和死后延搁时间(r=0.27；P=0.21)无显著相关。夜间组和白天组间年龄(P=0.98)、脑重量(P=0.67)和死后延搁时间(P=0.28)差异均无显著性。见表1。
3 讨论
从人的出生到死亡，生物节律现象贯穿始终，SCN是哺乳类动物产生和调节昼夜节律的中枢结构。一方面，SCN具有自主性昼夜节律如电生理特性、糖的利用和蛋白质合成等；另一方面，SCN接受整合外环境的光信息，使生物的内在节律与外环境同步。本研究首次采用原位杂交的方法，在福尔马林固定的石蜡切片观察到了人SCN加压素mRNA表达神经元，并进行了定量测量。研究发现SCN加压素mRNA表达呈明显的昼夜节律，即昼高夜低。该结果与动物实验的结果一致。有趣的是，尽管为夜行昼伏类动物，在大鼠和小鼠SCN加压素mRNA水平亦表现为昼高夜低的昼夜节律〔6〕。这一mRNA节律提示加压素合成的昼夜变化可能是SCN调节生理和行为节律的重要机制之一。在哺乳类动物，加压素mRNA昼夜节律的确切生理作用不清。目前的研究提示：SCN加压素合成的节律性决定了脑内和脑脊液内加压素多肽的浓度〔6〕，后者参与调节皮质醇等激素昼夜节律水平〔7〕。因此，加压素基因被认为是“生物钟调控”基因。由于加压素基因在特异性的SCN神经元呈昼夜节律性表达，而这些神经元具有昼夜节律性自动起搏细胞的功能，因此，采用原位杂交的方法观察SCN加压素的基因表达，为研究昼夜节律基因调控的细胞和分子机制提供了一重要的模型。本研究观察到加压素mRNA的昼夜变化与SCN加压素免疫活性神经元数目的昼夜变化一致。我们前期的工作发现：人SCN加压素免疫活性神经元的数目在脑老化、Alzheimer病(AD)患者明显降低。我们近期的研究发现：SCN加压素的基因表达在80岁以上老人显著降低〔2〕。而AD患者加压素的基因表达仅为对照组的1/3。一个有趣的现象是：在抑郁症患者，SCN加压素的mRNA表达仅为对照组的1/2；与之相反，抑郁症患者SCN加压素免疫活性神经元的数目比对照组高1倍。该结果提示同时在蛋白质和基因水平研究加压素的改变是十分重要的，在不同疾病过程中蛋白质和基因的表达水平可能不同。如果仅依赖一个方法，有可能得出不正确的结论。本研究首次观察到了人SCN加压素mRNA昼夜节律性表达，该结果可为研究人体昼夜节律基因调控的细胞和分子机制提供一种研究模型。
, 百拇医药
表1 患者病理学资料和加压素mRNA表达的关系(
±s) 组别数目(个)
年龄(岁)
脑重量(g)
PMD(h)
VPmRNA总量(μm2)
VPmRNA的细胞数(个)
白天
14
68±5
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1 310±80
23±7
11 045±1 909
24 514±2 594
黑夜
11
70±4
1 279±34
8±1
7 019±1 244
22 526±3 060
P值
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0.98
0.67
0.28
0.02
0.19
PMD：死后延搁时间； VPmRNA：加压素mRNA
基金项目：国家自然科学基金课题(编号：39940004)
作者简介：刘荣玉，女，42岁，副教授
周江宁，男，44岁，教授，博士生导师
参考文献
1，Zhou JN， Swaab DF. Activation and degeneration during aging: A morphometric study of the human hypothalamus. Microsc Res Tech, 1999; 44:36～48
, http://www.100md.com
2，Liu RY, Zhou JN, Hoogendijk WTJ et al. Decreased vasopressin gene expression in the biological clock of Alzheimers disease with and without depression. J Neuropathol Exp Neurol， 2000; 59:50～58
3，Liu RY, Zhou JN, Van Heerkhuize J et al. Decreased melatonin levels in postmortem cerebrospinal fluid in relation to aging, Alzheimers disease and apolipoprotein E-ε 4/4 genotype. J Clin Endocrinol Metab， 1999; 84:323～327
4，Mengod G, Charli JL, Palacios JM. The use of in situ hybridization histochemistry for the study of neuropeptides gene expression in the human brain. Cell Mol Neurobiol， 1990；10: 113～126
, 百拇医药
5，Guldenaar SE, Veldkamp B, Bakker O et al. Thyrotropin-releasing hormone gene expression in the human hypothalamus. Brain Res， 1996；743:93～101
6，Inouye SI, Shibata S. Neurochemical organization of circadion rhythm in the suprachiasmatic nucleus. Neurosci Res, 1994;20:109～130
7，Reppert SM, Schwarz WJ， Uhl GR. Arginine vasopressin: a novel peptide rhythm in cerebrospinal fluid. TINS. 1987;10:76～80
8，Kalsbeek A, Buijs RM, van Heerikhuize JJ et al. Vasopressin-containing neurons of the suprachiasmatic nuclei inhibits corticosterone release. Brain Res，1992；580: 62～67
2000-04-18收稿, 百拇医药