p16/MTS1基因缺失在骨髓增生异常综合征发病中作用的研究
作者：汪惠园 刘晓颖 夏瑞祥 汪渊 周青 任立奋 蔡学杰
单位：汪惠园 夏瑞祥 任立奋 蔡学杰(安徽医科大学第一附属医院血液内科，合肥 230022)；刘晓颖 汪渊 周青(安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032)
关键词：骨髓增生异常综合征；基因；抑制；肿瘤
安徽医科大学学报000303 摘要 目的 探讨多肿瘤抑制基因缺失(multiple tumor suppressor gene 1， p16/MTS1)与骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome， MDS)发病的关系。 方法 采用PCR方法，对29例MDS的p16/MTS1基因的缺失情况进行分析，讨论其与疾病发生的关系。结果 29例MDS患者未见有p16基因缺失。结论 p16基因缺失和MDS的发病关系不大。
中图分类号 R733.7
, http://www.100md.com
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0171-03
Deletion of p16/MTS1 gene in myelodysplastic
syndrome(MDS): Correlation with pathogenesis
Wang Huiyuan,Liu Xiaoying,Xia Ruixiang et al
(Dept of Hematology, The First Affiliated Hospital of
Anhui Medical University, Hefei 230022)
Abstract Objective To investigate the relationship between deletions of multiple tumor suppressor gene-p16/MTS1 gene and pathogenesis of MDS. Methods p16 gene was analysed by polymerase chain reaction in 29 MDS and correlated with pathogenesis. Results No p16 gene deletions were found in 29 samples. Conclusion The deletion of p16 gene shows little association with pathogenesis of MDS.
, 百拇医药
MeSH myelodysplastic syndromes; genes, suppressor, tumor
骨髓增生异常综合征(MDS)已明确为造血干细胞异常克隆增殖性疾病。MDS常见的核型异常为染色体的缺失，而不是易位和扩增。这些缺失的染色体区域含有多个肿瘤抑制基因的位点，他们在MDS的发病中可能起着重要作用〔1〕。
细胞周期调控基因的表达在肿瘤发生中常出现变化，其中周期素依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子(CDKI)〔2〕-即多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1, MTS1)编码的蛋白(p16)作为一个负性调节因子参与细胞周期调控。现已发现黑色素瘤、肺癌、脑肿瘤、白血病等恶性肿瘤细胞出现p16基因缺失〔3〕。在急性淋巴细胞白血病(ALL)中p16基因缺失率很高〔4〕，在MDS情况不清楚。本研究探索p16基因缺失在MDS中发生率并讨论它在MDS发病中的作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本选择 安徽医科大学附属医院血液科1997年3月～1998年6月收治的29例MDS住院患者。
1.2 单个核细胞基因组DNA的提取 按常规方法〔5〕抽提单个核细胞DNA，用双蒸水稀释至50 mg*L-1。
1.3 PCR分析 引物的设计参照文献〔2，6〕。p16基因外显子2的引物序列为：上游引物：5′-TGG CTC TGA CCA TTC TGT-3′，下游引物：5′-AGC TTT GGA AGC TCT CAG-3′，产物大小为386bp。CDK4〔7〕：上游引物5′- CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGG-3′，下游引物：5′-GGA GGT CGG TAC CAG AGT G-3′，产物大小为534bp。将100 ng基因组DNA加入PCR反应液(10 mmol*L-1 Tris,50 mmol*L-1 KCl,2 mmol*L-1 MgCl2,200 μmol*L-1 dNTPS,0.5 μmol*L-1引物，体积分数为10%的DMSO和3U Taq DNA聚合酶)中，p16和CDK4为单独反应体系。97℃ 5 min热启动，95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃ 5 min结束反应，取8 μl进行琼脂糖电泳。
, 百拇医药
1.4 Southern印迹试验 取8 μl p16基因特异性扩增产物经20 g*L-1琼脂糖凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜上，然后与地高辛标记的探针杂交，探针为EcoRI、SalI酶切的p16cDNA片段(p16cDNA由美国冷泉港实验室Dr David Beach 惠赠)，杂交后通过酶联免疫与抗地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物结合，在BCIP和NBT存在下由酶催化成色反应，出现条带的为p16基因产物。
2 结果
根据p16基因DNA序列所设计的特异性核苷酸引物经PCR仪扩增后进行琼脂糖电泳，以未出现386bp特异性扩增条带、且出现CDK4扩增条带者为纯合性缺失。为排除污染，每次均设p16正常对照和阳性对照。正常对照为正常人p16基因PCR产物，经Southern 印迹试验证明；阳性对照为无模板DNA的PCR产物。我们用此法检测29例MDS的骨髓标本，包括难治性贫血(RA)7例，难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)15例，难治性贫血伴原始细胞增多-转变型(RAEB-T)8例，发现1例患者有p16基因缺失。电泳结果如图1、2所示。
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图1 p16基因的缺失分析
M：фX174DNA/HaeⅢ Markers；1：正常对照；2：阳性对照；
3～6：MDS标本
图2 p16基因的Southern blot分析
1:正常对照； 2:阳性对照；3～6：MDS标本
3 讨论
我们分析了29例MDS患者包括7例RA,15例RAEB,8例RAEB-T的p16基因缺失情况，未发现1例有缺失。我们的结果与国外〔8〕相似，在急性髓系白血病(AML)和MDS中很少有p16基因缺失,相反髓系白血病细胞系常见p16基因缺失〔9〕。这个现象尚不明确，有两种可能，一是已具有p16缺失的白血病细胞亚群体外选择性生长；另一种可能是在体外培养中获得的，且是细胞永生化所需要。p16基因缺失常见于淋巴细胞白血病〔4〕。因此p16基因缺失与ALL发病相关，与髓系白血病发病关系不大。
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染色体缺失是MDS常见的核型异常，提示这组疾病的发生中肿瘤抑制基因起着一定作用。MDS常见缺失为5、20、7、11、12、13号染色体〔1〕。CDKI不定位于这些染色体。
在肿瘤中，直接参与细胞周期调控的基因常发生改变，这些改变包括p53、Rb、CDKI的缺失、突变和周期素扩增〔10〕。
许多研究显示这些基因在MDS、(AML)发生中关系不大，细胞周期分析中发现AML细胞与髓系正常细胞分裂速度类似〔11〕。MDS和AML细胞的遗传学改变更可能使细胞停止分化，而保持在增生状态。因此我们在分析MDS病因时应研究影响血液细胞正常分化过程的这些基因结构完整性。
基金项目：安徽省教委自然科学研究基金课题(JL-96-077)，安徽医科大学博士基金课题
作者简介：汪惠园，男，34岁，主治医师，硕士研究生
, 百拇医药
参考文献
1，Boultwood J, Fidler C. Chromosomal deletions in myelodysplasia. Leukemia Lymphoma,1995;17(1-2):71～75
2，Surrano M,Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature, 1993; 366(6 456):704～710
3，Nobori T,Miura K,Wu DJ. Deletions of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature, 1994; 368(6473):753～756
, http://www.100md.com
4，Cayuela JM,Hebert J, Sigaux F.Homozygous MTS1(P16 INK4A) deletion in primary tumor cells of 163 leukemia patients. Blood, 1995;85(3):854～861
5，刘 虎, 桂淑玉, 汪 渊等. 聚合酶链反应分析多肿瘤抑癌基因1第二外显子纯合性缺失. 安徽医科大学学报，2000;35(3)：173～175
6，汪惠园,夏瑞祥,汪 渊等. 急性淋巴细胞白血病p16/MTS1基因缺失与临床预后相关性研究. 中华血液学杂志,2000;21(2):99
7，Khatib ZA, Matsusime H, Valentine M et al. Coamplification of the CDK4 gene with MDM2 and GLI in human sarcomas. Cancer Res, 1993;53(22):5 535～5 541
, http://www.100md.com
8，Nakamaki-T, Bartram C, Seriu T. Molecular analysis of the cyclin-dependent kinase inhibitor genes, p15, p16, p18 and p19 in the myelodysplastic syndromes. Leukemia Res, 1997;21(3):235～240
9，Nakamaki T, Kawamata N, Shwaller J et al. Structural integrity of the cyclin-dependent kinase inhibitor gengs,p15,p16and p18 in myeloid leukemia. Br J Haematol, 1995;91(1):139～149
10 Hirama T, Koeffler HP. The role of cyclin-dependent kinase inhibitors in development of cancer. Blood, 1995;86(3):841～847
11 Lampkin BC, Nagao T, Mauer AM. Synchronization and recruitment in acute leukemia. J Clin Invest, 1971；50(99):2 204～2 209
2000-01-24收稿，2000-03-17修回, 百拇医药
单位：汪惠园 夏瑞祥 任立奋 蔡学杰(安徽医科大学第一附属医院血液内科，合肥 230022)；刘晓颖 汪渊 周青(安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032)
关键词：骨髓增生异常综合征；基因；抑制；肿瘤
安徽医科大学学报000303 摘要 目的 探讨多肿瘤抑制基因缺失(multiple tumor suppressor gene 1， p16/MTS1)与骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome， MDS)发病的关系。 方法 采用PCR方法，对29例MDS的p16/MTS1基因的缺失情况进行分析，讨论其与疾病发生的关系。结果 29例MDS患者未见有p16基因缺失。结论 p16基因缺失和MDS的发病关系不大。
中图分类号 R733.7
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文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0171-03
Deletion of p16/MTS1 gene in myelodysplastic
syndrome(MDS): Correlation with pathogenesis
Wang Huiyuan,Liu Xiaoying,Xia Ruixiang et al
(Dept of Hematology, The First Affiliated Hospital of
Anhui Medical University, Hefei 230022)
Abstract Objective To investigate the relationship between deletions of multiple tumor suppressor gene-p16/MTS1 gene and pathogenesis of MDS. Methods p16 gene was analysed by polymerase chain reaction in 29 MDS and correlated with pathogenesis. Results No p16 gene deletions were found in 29 samples. Conclusion The deletion of p16 gene shows little association with pathogenesis of MDS.
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MeSH myelodysplastic syndromes; genes, suppressor, tumor
骨髓增生异常综合征(MDS)已明确为造血干细胞异常克隆增殖性疾病。MDS常见的核型异常为染色体的缺失，而不是易位和扩增。这些缺失的染色体区域含有多个肿瘤抑制基因的位点，他们在MDS的发病中可能起着重要作用〔1〕。
细胞周期调控基因的表达在肿瘤发生中常出现变化，其中周期素依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子(CDKI)〔2〕-即多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1, MTS1)编码的蛋白(p16)作为一个负性调节因子参与细胞周期调控。现已发现黑色素瘤、肺癌、脑肿瘤、白血病等恶性肿瘤细胞出现p16基因缺失〔3〕。在急性淋巴细胞白血病(ALL)中p16基因缺失率很高〔4〕，在MDS情况不清楚。本研究探索p16基因缺失在MDS中发生率并讨论它在MDS发病中的作用。
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1 材料和方法
1.1 标本选择 安徽医科大学附属医院血液科1997年3月～1998年6月收治的29例MDS住院患者。
1.2 单个核细胞基因组DNA的提取 按常规方法〔5〕抽提单个核细胞DNA，用双蒸水稀释至50 mg*L-1。
1.3 PCR分析 引物的设计参照文献〔2，6〕。p16基因外显子2的引物序列为：上游引物：5′-TGG CTC TGA CCA TTC TGT-3′，下游引物：5′-AGC TTT GGA AGC TCT CAG-3′，产物大小为386bp。CDK4〔7〕：上游引物5′- CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGG-3′，下游引物：5′-GGA GGT CGG TAC CAG AGT G-3′，产物大小为534bp。将100 ng基因组DNA加入PCR反应液(10 mmol*L-1 Tris,50 mmol*L-1 KCl,2 mmol*L-1 MgCl2,200 μmol*L-1 dNTPS,0.5 μmol*L-1引物，体积分数为10%的DMSO和3U Taq DNA聚合酶)中，p16和CDK4为单独反应体系。97℃ 5 min热启动，95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃ 5 min结束反应，取8 μl进行琼脂糖电泳。
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1.4 Southern印迹试验 取8 μl p16基因特异性扩增产物经20 g*L-1琼脂糖凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜上，然后与地高辛标记的探针杂交，探针为EcoRI、SalI酶切的p16cDNA片段(p16cDNA由美国冷泉港实验室Dr David Beach 惠赠)，杂交后通过酶联免疫与抗地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物结合，在BCIP和NBT存在下由酶催化成色反应，出现条带的为p16基因产物。
2 结果
根据p16基因DNA序列所设计的特异性核苷酸引物经PCR仪扩增后进行琼脂糖电泳，以未出现386bp特异性扩增条带、且出现CDK4扩增条带者为纯合性缺失。为排除污染，每次均设p16正常对照和阳性对照。正常对照为正常人p16基因PCR产物，经Southern 印迹试验证明；阳性对照为无模板DNA的PCR产物。我们用此法检测29例MDS的骨髓标本，包括难治性贫血(RA)7例，难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)15例，难治性贫血伴原始细胞增多-转变型(RAEB-T)8例，发现1例患者有p16基因缺失。电泳结果如图1、2所示。
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图1 p16基因的缺失分析
M：фX174DNA/HaeⅢ Markers；1：正常对照；2：阳性对照；
3～6：MDS标本
图2 p16基因的Southern blot分析
1:正常对照； 2:阳性对照；3～6：MDS标本
3 讨论
我们分析了29例MDS患者包括7例RA,15例RAEB,8例RAEB-T的p16基因缺失情况，未发现1例有缺失。我们的结果与国外〔8〕相似，在急性髓系白血病(AML)和MDS中很少有p16基因缺失,相反髓系白血病细胞系常见p16基因缺失〔9〕。这个现象尚不明确，有两种可能，一是已具有p16缺失的白血病细胞亚群体外选择性生长；另一种可能是在体外培养中获得的，且是细胞永生化所需要。p16基因缺失常见于淋巴细胞白血病〔4〕。因此p16基因缺失与ALL发病相关，与髓系白血病发病关系不大。
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染色体缺失是MDS常见的核型异常，提示这组疾病的发生中肿瘤抑制基因起着一定作用。MDS常见缺失为5、20、7、11、12、13号染色体〔1〕。CDKI不定位于这些染色体。
在肿瘤中，直接参与细胞周期调控的基因常发生改变，这些改变包括p53、Rb、CDKI的缺失、突变和周期素扩增〔10〕。
许多研究显示这些基因在MDS、(AML)发生中关系不大，细胞周期分析中发现AML细胞与髓系正常细胞分裂速度类似〔11〕。MDS和AML细胞的遗传学改变更可能使细胞停止分化，而保持在增生状态。因此我们在分析MDS病因时应研究影响血液细胞正常分化过程的这些基因结构完整性。
基金项目：安徽省教委自然科学研究基金课题(JL-96-077)，安徽医科大学博士基金课题
作者简介：汪惠园，男，34岁，主治医师，硕士研究生
, 百拇医药
参考文献
1，Boultwood J, Fidler C. Chromosomal deletions in myelodysplasia. Leukemia Lymphoma,1995;17(1-2):71～75
2，Surrano M,Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature, 1993; 366(6 456):704～710
3，Nobori T,Miura K,Wu DJ. Deletions of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature, 1994; 368(6473):753～756
, http://www.100md.com
4，Cayuela JM,Hebert J, Sigaux F.Homozygous MTS1(P16 INK4A) deletion in primary tumor cells of 163 leukemia patients. Blood, 1995;85(3):854～861
5，刘 虎, 桂淑玉, 汪 渊等. 聚合酶链反应分析多肿瘤抑癌基因1第二外显子纯合性缺失. 安徽医科大学学报，2000;35(3)：173～175
6，汪惠园,夏瑞祥,汪 渊等. 急性淋巴细胞白血病p16/MTS1基因缺失与临床预后相关性研究. 中华血液学杂志,2000;21(2):99
7，Khatib ZA, Matsusime H, Valentine M et al. Coamplification of the CDK4 gene with MDM2 and GLI in human sarcomas. Cancer Res, 1993;53(22):5 535～5 541
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8，Nakamaki-T, Bartram C, Seriu T. Molecular analysis of the cyclin-dependent kinase inhibitor genes, p15, p16, p18 and p19 in the myelodysplastic syndromes. Leukemia Res, 1997;21(3):235～240
9，Nakamaki T, Kawamata N, Shwaller J et al. Structural integrity of the cyclin-dependent kinase inhibitor gengs,p15,p16and p18 in myeloid leukemia. Br J Haematol, 1995;91(1):139～149
10 Hirama T, Koeffler HP. The role of cyclin-dependent kinase inhibitors in development of cancer. Blood, 1995;86(3):841～847
11 Lampkin BC, Nagao T, Mauer AM. Synchronization and recruitment in acute leukemia. J Clin Invest, 1971；50(99):2 204～2 209
2000-01-24收稿，2000-03-17修回, 百拇医药