应用流式细胞仪对脐血细胞免疫学特点的检测
作者：何晓东 孙自敏 祝怀平 汪健 翟自敏
单位：安徽省立医院中心实验室，合肥 230001
关键词：流式细胞仪；胎血；细胞学；造血干细胞；免疫学
安徽医科大学学报000418
摘要 目的 研究脐血造血干/祖细胞和淋巴细胞的免疫学特点以及脐血干/祖细胞含量和细胞抗原特征对骨髓重建造血的影响。方法 收集34份脐血，用流式细胞仪双标法同时检测细胞表面的两种不同抗原。结果 34份脐血平均有核细胞数每份为(12.3±4.3)×108个，CD34+的绝对细胞数每份为(1.98±1.30)×107，其中CD34+ CD38+细胞占CD34+细胞的84.6%±9.1%；脐血淋巴样细胞群体中CD3+表达率为60.50%±11.80%，CD4+为38.66%±11.80%；CD8+为21.70%±6.37%，CD4+/CD8+比值是1.93±0.91；CD8+ CD45RA+细胞占CD8+细胞群体的98.93%±0.36%；CD4+ CD45RA+胞细胞占CD4+细胞的90.96%±6.96%。结论 脐血中干/祖细胞数量可以满足正常体重的成人脐血移植对干/祖细胞的需要。脐血中T淋巴细胞多为功能未成熟细胞，具有较小的抗原反应性，这有利于降低移植中移植物抗宿主反应。
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中图分类号 R446.63；R329.2；R714.51
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0294-03
脐血富含优质的造血干/祖细胞，且来源广泛，易于取材，是继骨髓后用于同种异基因干/祖细胞移植的一种新的来源，日益受到人们的关注。据报道，国内外已经成功用脐血移植治疗了近千例各种良、恶性肿瘤患者，但多数应用于儿童。目前，正在探讨单份脐血应用于成人的可能，本文通过测定脐血干/祖细胞以及其免疫细胞的表型，来分析脐血的免疫学特征。
1 材料和方法
1.1 脐血及其有核细胞采集 取自健康、正常足月分娩的胎儿脐血。采用密封式采血法。胎儿分娩出立即断脐，碘酒消毒脐静脉穿刺处，行穿刺，使脐血在重力的作用下流入装有28 ml ACD保存液的200 ml容积的无菌采血袋。采集过程中不停地摇晃血袋，充分混匀。采集后，脐血和无菌的6%羟乙基淀粉氯化钠溶液(Fupont Pharma提供)按4∶1的比例完全混匀，在超净无菌台内静置45 min后，弃去下层红细胞，取上层少许细胞悬液，供实验使用。对照组取自健康献血员静脉血，用4.5×104U*L-1的肝素以1∶9抗凝。
, 百拇医药
1.2 抗体标记 用双色免疫荧光标记法检测细胞膜抗原，取对照管和测定管若干支，每管中加入70 μl脐血，在测定管中分别加入以下组合的抗体各20 μl：CD34-FITC/CD38-PE、CD34-FITC/CD45RA-PE、CD4-FTIC/CD8-PE、CD8-FITC/CD45RA-PE、CD3-PE，以上抗体均为IgG1亚型，故其同型对照管为IgG1-FITC/IgG1-PE；另为CDw90-FITC/CD34-PE测定管中，CD34-PE抗体为IgG1+IgG2a+IgG2b亚型，CDw90-FITC抗体为IgG1亚型，其同型对照管为IgG1-FITC/IgG1+IgG2a+IgG2b-PE。混匀后，室温避光反应20～30 min。反应后每管加0.5 ml红细胞裂解，室温反应10 min后，再加入0.5 ml的pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，静置5 min，离心10 min，沉淀再用PBS洗2次后，并用1 ml PBS悬浮起细胞。以上所有试剂均购自法国Immuntech公司。
1.3 细胞检测 运用流式细胞仪检测，选定所需检测的细胞群体，以荧光强度1界限，大于1者为阳性。首先用同型对照管，将FITC-PE双参数直方图中两者的阳性率都调至2%±0.5%范围内，然后在同样条件下检测相应的测定管。其中CD34-FITC/CD38-PE、CD34-FITC/CD45RA、CD34-PE/CDw90-FITC结果为占全部有核细胞的比例，每管至少检测50 000个细胞。其它各测定管以淋巴样细胞为对象，每管至少检测5 000个细胞。流式细胞仪为美国Coulter公司Epics-XL型。
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1.4 数据分析用System Ⅱ分析软件 结果为
±s形式。如图1，根据细胞的物理学特点，在直方图1中的淋巴样细胞所在的位置A门，直方图2中B门为A门中细胞两种标记物的表达情况，其中B2为两种抗体同时表达的区域。
表2 淋巴细胞样群体中各表型群体的含量
n
CD3+
CD4+
CD8+
CD4/CD8△
, 百拇医药 CD4+CD45RA+
CD8+CD45RA+
脐带血(%)
34
60.50±11.8
38.6±11.8
21.70±6.37
1.93±0.91
90.96±6.96
98.93±0.36
外周血(%)
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20
67.20±3.00*
34.72±2.78
27.12±2.94**
1.29±0.13**
55.67±11.20**
89.27±5.00**
注：*P<0.05，**P<0.01；△此为比值，不是百分比
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图1 双表达细胞数据分析意图
2 结果
2.1 脐血体积 本实验所收集的34份脐血，不计抗凝剂的体积，平均脐血的体积每份为99 ml±22 ml，最大的体积为150 ml，最小的体积为60 ml；平均每份脐血中有核细胞数为(12.3±5.9)×1011*L-1，最高25.9×1011*L-1，最低是6.4×1011*L-1。
2.2 脐血中有核细胞中免疫标记物的结果 CD34+细胞及其各亚型在全部有核细胞中的比例见表1。平均每份脐血中CD34+细胞的绝对数为(1.98±1.30)×107，CD34+CD48-细胞数为(0.27±0.26)×107。
, 百拇医药
2.3 脐血淋巴样细胞群体中各表型的百分比 见表2，平均每份脐血中CD3+细胞绝对数为(96.2±18.8)×107。
表1 脐血中干/祖细胞及其亚型的结果 抗体
均值
(%)
最大值
(%)
最小值
(%)
CD34+
1.61±0.91
, 百拇医药 4.6
0.7
CD34+CD38+*
84.6±9.1
94.6
61.4
CD34+CD45RA+*
63.0±7.5
77.8
49.8
CD34+CDw90+*
, 百拇医药
3.48±2.26
8.4
0.4
注：*所提供百分比均为CD34+细胞的含量3 讨论
脐血干/祖细胞移植已经开始应用于造血和非造血系统有关肿瘤的治疗，它是此类疾病根治的理想方法之一。 在所检测的34份脐血中，CD34+的平均数每份为(1.98±1.30)×107。目前多数学者〔1〕认为用于移植的CD34+不应低于2×105个*kg-1体重，中性粒细胞不应低于1×107*kg-1受者体重。依此计算，所采集单份脐血中CD34+细胞的量能够满足普通体重成人所需。CD34+亚型中CD34+ CD38-浓度为13%±8.6%，平均绝对数每份为(0.27±0.26)×107。CD38是反映细胞活性和成熟程度的抗原，成熟细胞高表达CD38。据报道，在体外培养实验中，CD34+CD38-群体细胞长期培养增殖能力高于CD34+CD38+的细胞群体〔2〕；同时此亚型细胞平均端粒长度长于外周血中相应细胞端粒的长度〔3〕。因此脐血中CD34+CD38-细胞作为分化较早阶段的造血干祖细胞，它的含量高低对受体骨髓的重建较有意义，比单纯用CD34+含量对脐血移植预后的判断更有价值。
, 百拇医药
本实验测了34份脐血和20份成人外周血淋巴细胞的表型，脐血中T淋巴细胞比例明显低于成人(CD3+分别为60.5%±11.8%和67.2%±3.0%，P<0.05)，CD8+T细胞低于外周血，且CD4+CD38RA+和CD8+CD45RA+比例均显著高于外周血(P<0.01)，D’Arena等〔4〕也有相似报道；但脐血的CD4/CD8比值显著高于成人外周血(分别为1.93±0.91和1.29±0.13，P<0.01)，这与D’Arena等报道不同。CD45RA为“裸”细胞标记物，它反映细胞未经抗原刺激，脐血中T淋巴细胞(如CD4和CD8)绝大多数同时表达CD45RA，即它们多为初始型细胞。供体CD8+细胞是移植后发生移植物抗宿主反应(GVHD)的主要效应细胞〔5〕，脐血中CD8+细胞不仅含量低，而且在功能上主要是“裸”细胞，其细胞毒性低；Chipeta等〔6〕研究表明：脐血中T淋巴细胞对抗原刺激和PHA刺激的应答反应较正常人外周血淋巴细胞低；因此移植后GVHD发生率低于骨髓和外周血，甚至HLA有部分位点不合的供者和受者间亦可进行脐血干/祖细胞的移植。
, 百拇医药
基金项目：安徽省“九五”攻关项目(基金编号：961007)
作者简介：何晓东，男，28岁，检验师
参考文献
1，Rubinstein P, Carrier C, Scaradavou A et al. Outcomes among 562 recipients of placentablood transplants from unrelated donors. N Engl-J-Med, 1998;339(22):1 565～1 577
2，De Wynter EA, Nadali G, Coutinho LH et al. Extensive amplification of single cells from CD34+ subpopulations in umbilical cord blood and identification of long-term cultureinitiating cells present in two subsets. Stem Cells, 1996;14(5):566～576
, 百拇医药
3，Pauw ES, Verwoed NP, Duinkerken N et al. Assessment of telomere length in hematopoietic interphase cells using in situ hybridization and digital fluorescence microscopy. Cytometry, 1998;32(3):163～169
4，D’Arena G, Musto P, Cascavilla N et al. Flow cytometric characterization of human umbilical cord blood lymphocytes: immunophenotypic features. Haematologica, 1998;83(3):197～203
5，D’Arena G, Cascavilla N, Carotenuto M et al. Blastogenic response of activated human umbilical cord blood T-lymphocytes. Heamatologica, 1998;83(11):1 048～1 050
6，Chipeta J, Komeda Y, yang XL et al. Intracellular cytokine profiler of cord and adult blood lyphcytes. Blood, 1999;93(3):1 120～1 122
2000-03-30收稿，2000-06-15修回, http://www.100md.com
单位：安徽省立医院中心实验室，合肥 230001
关键词：流式细胞仪；胎血；细胞学；造血干细胞；免疫学
安徽医科大学学报000418
摘要 目的 研究脐血造血干/祖细胞和淋巴细胞的免疫学特点以及脐血干/祖细胞含量和细胞抗原特征对骨髓重建造血的影响。方法 收集34份脐血，用流式细胞仪双标法同时检测细胞表面的两种不同抗原。结果 34份脐血平均有核细胞数每份为(12.3±4.3)×108个，CD34+的绝对细胞数每份为(1.98±1.30)×107，其中CD34+ CD38+细胞占CD34+细胞的84.6%±9.1%；脐血淋巴样细胞群体中CD3+表达率为60.50%±11.80%，CD4+为38.66%±11.80%；CD8+为21.70%±6.37%，CD4+/CD8+比值是1.93±0.91；CD8+ CD45RA+细胞占CD8+细胞群体的98.93%±0.36%；CD4+ CD45RA+胞细胞占CD4+细胞的90.96%±6.96%。结论 脐血中干/祖细胞数量可以满足正常体重的成人脐血移植对干/祖细胞的需要。脐血中T淋巴细胞多为功能未成熟细胞，具有较小的抗原反应性，这有利于降低移植中移植物抗宿主反应。
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中图分类号 R446.63；R329.2；R714.51
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0294-03
脐血富含优质的造血干/祖细胞，且来源广泛，易于取材，是继骨髓后用于同种异基因干/祖细胞移植的一种新的来源，日益受到人们的关注。据报道，国内外已经成功用脐血移植治疗了近千例各种良、恶性肿瘤患者，但多数应用于儿童。目前，正在探讨单份脐血应用于成人的可能，本文通过测定脐血干/祖细胞以及其免疫细胞的表型，来分析脐血的免疫学特征。
1 材料和方法
1.1 脐血及其有核细胞采集 取自健康、正常足月分娩的胎儿脐血。采用密封式采血法。胎儿分娩出立即断脐，碘酒消毒脐静脉穿刺处，行穿刺，使脐血在重力的作用下流入装有28 ml ACD保存液的200 ml容积的无菌采血袋。采集过程中不停地摇晃血袋，充分混匀。采集后，脐血和无菌的6%羟乙基淀粉氯化钠溶液(Fupont Pharma提供)按4∶1的比例完全混匀，在超净无菌台内静置45 min后，弃去下层红细胞，取上层少许细胞悬液，供实验使用。对照组取自健康献血员静脉血，用4.5×104U*L-1的肝素以1∶9抗凝。
, 百拇医药
1.2 抗体标记 用双色免疫荧光标记法检测细胞膜抗原，取对照管和测定管若干支，每管中加入70 μl脐血，在测定管中分别加入以下组合的抗体各20 μl：CD34-FITC/CD38-PE、CD34-FITC/CD45RA-PE、CD4-FTIC/CD8-PE、CD8-FITC/CD45RA-PE、CD3-PE，以上抗体均为IgG1亚型，故其同型对照管为IgG1-FITC/IgG1-PE；另为CDw90-FITC/CD34-PE测定管中，CD34-PE抗体为IgG1+IgG2a+IgG2b亚型，CDw90-FITC抗体为IgG1亚型，其同型对照管为IgG1-FITC/IgG1+IgG2a+IgG2b-PE。混匀后，室温避光反应20～30 min。反应后每管加0.5 ml红细胞裂解，室温反应10 min后，再加入0.5 ml的pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，静置5 min，离心10 min，沉淀再用PBS洗2次后，并用1 ml PBS悬浮起细胞。以上所有试剂均购自法国Immuntech公司。
1.3 细胞检测 运用流式细胞仪检测，选定所需检测的细胞群体，以荧光强度1界限，大于1者为阳性。首先用同型对照管，将FITC-PE双参数直方图中两者的阳性率都调至2%±0.5%范围内，然后在同样条件下检测相应的测定管。其中CD34-FITC/CD38-PE、CD34-FITC/CD45RA、CD34-PE/CDw90-FITC结果为占全部有核细胞的比例，每管至少检测50 000个细胞。其它各测定管以淋巴样细胞为对象，每管至少检测5 000个细胞。流式细胞仪为美国Coulter公司Epics-XL型。
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1.4 数据分析用System Ⅱ分析软件 结果为
±s形式。如图1，根据细胞的物理学特点，在直方图1中的淋巴样细胞所在的位置A门，直方图2中B门为A门中细胞两种标记物的表达情况，其中B2为两种抗体同时表达的区域。表2 淋巴细胞样群体中各表型群体的含量
n
CD3+
CD4+
CD8+
CD4/CD8△
, 百拇医药 CD4+CD45RA+
CD8+CD45RA+
脐带血(%)
34
60.50±11.8
38.6±11.8
21.70±6.37
1.93±0.91
90.96±6.96
98.93±0.36
外周血(%)
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20
67.20±3.00*
34.72±2.78
27.12±2.94**
1.29±0.13**
55.67±11.20**
89.27±5.00**
注：*P<0.05，**P<0.01；△此为比值，不是百分比
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图1 双表达细胞数据分析意图
2 结果
2.1 脐血体积 本实验所收集的34份脐血，不计抗凝剂的体积，平均脐血的体积每份为99 ml±22 ml，最大的体积为150 ml，最小的体积为60 ml；平均每份脐血中有核细胞数为(12.3±5.9)×1011*L-1，最高25.9×1011*L-1，最低是6.4×1011*L-1。
2.2 脐血中有核细胞中免疫标记物的结果 CD34+细胞及其各亚型在全部有核细胞中的比例见表1。平均每份脐血中CD34+细胞的绝对数为(1.98±1.30)×107，CD34+CD48-细胞数为(0.27±0.26)×107。
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2.3 脐血淋巴样细胞群体中各表型的百分比 见表2，平均每份脐血中CD3+细胞绝对数为(96.2±18.8)×107。
表1 脐血中干/祖细胞及其亚型的结果 抗体
均值
(%)
最大值
(%)
最小值
(%)
CD34+
1.61±0.91
, 百拇医药 4.6
0.7
CD34+CD38+*
84.6±9.1
94.6
61.4
CD34+CD45RA+*
63.0±7.5
77.8
49.8
CD34+CDw90+*
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3.48±2.26
8.4
0.4
注：*所提供百分比均为CD34+细胞的含量3 讨论
脐血干/祖细胞移植已经开始应用于造血和非造血系统有关肿瘤的治疗，它是此类疾病根治的理想方法之一。 在所检测的34份脐血中，CD34+的平均数每份为(1.98±1.30)×107。目前多数学者〔1〕认为用于移植的CD34+不应低于2×105个*kg-1体重，中性粒细胞不应低于1×107*kg-1受者体重。依此计算，所采集单份脐血中CD34+细胞的量能够满足普通体重成人所需。CD34+亚型中CD34+ CD38-浓度为13%±8.6%，平均绝对数每份为(0.27±0.26)×107。CD38是反映细胞活性和成熟程度的抗原，成熟细胞高表达CD38。据报道，在体外培养实验中，CD34+CD38-群体细胞长期培养增殖能力高于CD34+CD38+的细胞群体〔2〕；同时此亚型细胞平均端粒长度长于外周血中相应细胞端粒的长度〔3〕。因此脐血中CD34+CD38-细胞作为分化较早阶段的造血干祖细胞，它的含量高低对受体骨髓的重建较有意义，比单纯用CD34+含量对脐血移植预后的判断更有价值。
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本实验测了34份脐血和20份成人外周血淋巴细胞的表型，脐血中T淋巴细胞比例明显低于成人(CD3+分别为60.5%±11.8%和67.2%±3.0%，P<0.05)，CD8+T细胞低于外周血，且CD4+CD38RA+和CD8+CD45RA+比例均显著高于外周血(P<0.01)，D’Arena等〔4〕也有相似报道；但脐血的CD4/CD8比值显著高于成人外周血(分别为1.93±0.91和1.29±0.13，P<0.01)，这与D’Arena等报道不同。CD45RA为“裸”细胞标记物，它反映细胞未经抗原刺激，脐血中T淋巴细胞(如CD4和CD8)绝大多数同时表达CD45RA，即它们多为初始型细胞。供体CD8+细胞是移植后发生移植物抗宿主反应(GVHD)的主要效应细胞〔5〕，脐血中CD8+细胞不仅含量低，而且在功能上主要是“裸”细胞，其细胞毒性低；Chipeta等〔6〕研究表明：脐血中T淋巴细胞对抗原刺激和PHA刺激的应答反应较正常人外周血淋巴细胞低；因此移植后GVHD发生率低于骨髓和外周血，甚至HLA有部分位点不合的供者和受者间亦可进行脐血干/祖细胞的移植。
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基金项目：安徽省“九五”攻关项目(基金编号：961007)
作者简介：何晓东，男，28岁，检验师
参考文献
1，Rubinstein P, Carrier C, Scaradavou A et al. Outcomes among 562 recipients of placentablood transplants from unrelated donors. N Engl-J-Med, 1998;339(22):1 565～1 577
2，De Wynter EA, Nadali G, Coutinho LH et al. Extensive amplification of single cells from CD34+ subpopulations in umbilical cord blood and identification of long-term cultureinitiating cells present in two subsets. Stem Cells, 1996;14(5):566～576
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3，Pauw ES, Verwoed NP, Duinkerken N et al. Assessment of telomere length in hematopoietic interphase cells using in situ hybridization and digital fluorescence microscopy. Cytometry, 1998;32(3):163～169
4，D’Arena G, Musto P, Cascavilla N et al. Flow cytometric characterization of human umbilical cord blood lymphocytes: immunophenotypic features. Haematologica, 1998;83(3):197～203
5，D’Arena G, Cascavilla N, Carotenuto M et al. Blastogenic response of activated human umbilical cord blood T-lymphocytes. Heamatologica, 1998;83(11):1 048～1 050
6，Chipeta J, Komeda Y, yang XL et al. Intracellular cytokine profiler of cord and adult blood lyphcytes. Blood, 1999;93(3):1 120～1 122
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