含三甲氧苄嗪的细胞外液性停搏液对未成熟兔心肌的作用
作者：梅运清 龙村 程邦昌 温福兴 张燕婉 史世勇
单位：梅运清 龙村 温福兴 张燕婉 史世勇(中国协和医科大学心血管病研究所阜外心血管病医院麻醉体外循环研究室，北京 100037)；程邦昌(湖北医科大学第一附属医院胸心外科，武汉 430060)
关键词：曲美他嗪；药理学；心肌；兔
安徽医科大学学报000405 摘要 目的 探讨两种晶体停搏液中(Modified St. Thomas No 1-MST、Tyers solution)加入细胞保护剂三甲氧苄嗪对未成熟心肌的作用。方法 以离体灌注幼兔心为研究对象，观察两种晶体停搏液在幼兔心14℃缺血2 h后血流动力学、冠脉流出液心肌酶和心肌生化的变化。结果 与对照组相比，三甲氧苄嗪可明显提高晶体停搏液对离体灌注幼兔心功能的恢复，明显减少心肌酶的漏出和氧自由基的生成(P<0.05)，增加高能磷酸盐的储存(P<0.05)。结论 三甲氧苄嗪可明显提高晶体停搏液对未成熟心肌的保护效果。
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中图分类号 R972.3； R972.4； R322.11
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0260-04
Effect of addition of trimetazidine to two crystalloid cardioplegias on immature myocardium during global ischemia
Mei Yunqing, Long Cun,Cheng Bangchang et al
(Anesthesiology and CPB Research Group, Fuwai Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100037)
Abstract Objective To investigate the effect of addition of trimetazidine to two cardioplegias (Modified St. Thomas No 1-MST、 Tyers solution, and final concentration of each solution was 10-6 mol.L-1) on immature myocardium. Methods To observe the change of hemodynamics, myocardial biochemistry of the perfused immature rabbit heart in vitro for two hours of ischemia. Results Compared with the control group, cardioplegias containing trimetazidine could markedly enhance the post-ischemic hemodynamics, tremendously lower the myocardial enzyme leakage and production of oxygen free radical, and improve high-energy phosphates preservation. Conclusion Cytoprotective agent trimetazidine can significantly improve the myocardial protective effect of the two crystalloid cardioplegias on immature heart.
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MeSH trimetazidine/pharmacology; myocardium; rabbits
晶体停搏液对成熟心肌可提供满意的心肌保护效果，但临床上所用的5种晶体停搏液(Modified St. Thomas Hospital No 1-MST、 St. Thomas Hospital No 2-STH、 Tyers、 Bretschneider-HTK和Roe)，对未成熟心肌保护效果均不满意。目前认为，晶体停搏液对未成熟心肌保护效果欠佳的主要原因是适合成熟心肌的停搏液，不适合用于未成熟心肌，其配方(组成)还有待于改进和完善〔1〕。因此，诸多研究均集中在探索较理想的停搏液离子浓度、pH值、渗透压等方面，但结果仍不理想；进而又在停搏液中添加各种成分，以改善心肌的能量代谢，减少再灌注时自由基生成，减轻钙离子超载和组织酸中毒，但仍无定论。而在心脏缺血期间直接用药物的方法改善心肌的代谢，阻断或最大限度的减轻心肌的缺血再灌注损伤，为近年来围体外循环期心肌保护研究的方向之一。为此，本实验以离体灌注幼兔心脏为模型，以常用的两种停搏液(Modified St. Thomas Hospital No 1-MST、Tyers)为研究对象，添加一种在细胞水平发挥作用，能从多个环节提高和改善心肌代谢，减轻心肌缺血再灌注损伤的细胞保护剂三甲氧苄嗪(Tmetazidine，TMZ)，通过观察TMZ对离体灌注幼兔心脏血流动力学、心肌酶和心肌生化的变化，探讨TMZ对未成熟心肌的作用，进而为临床使用提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验仪器与试剂 多导生理记录仪(Macintosh, Quadra 610, Japan)，Stockert血泵(Germany)，混合气(O2：CO2=95%：5%，北京普莱克斯公司)。离体心灌注装置：根据Neely介绍的方法设计改进。心停搏液和Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液试剂均为国产分析纯，三甲氧苄嗪为法国Servier公司产品，药品批号：023006388-5.98。
1.2 动物模型的建立 实验用兔为中国医学科学院、中国协和医科大学实验动物中心提供(纯种新西兰白兔)。幼兔重150～220 g，兔龄7～14天。以戊巴比妥钠腹腔麻醉(50 mg.kg-1)，经股静脉肝素化(150 IU*kg-1)。快速开胸取出心脏，浸入4℃生理盐水，立即连于Langendorff灌注装置开始灌注，初始灌注用通以混合气(O2：CO2=95%:5%)的经改良的Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液，温度37℃，剪开肺动脉根部，结扎肺静脉，上、下腔静脉，剪开左心耳，插入左房灌注管，立即将心脏移入保温缸内。主动脉灌注15 min后，开启左房灌注管，阻断主动脉灌注管，转为工作模型，稳定后同步收集主动脉流量(AF)，冠状动脉引流量(CF)，计算心输出量(CO，CO=AF+CF)，左室最大压力变化速率(±dp/dtmax)，根据心电图计算心率(HR)。做功稳定30 min后，关闭左房灌注管；启动低温恒温器，使恒温器的温度恒定在14℃；经主动脉根部灌注4℃的MST、Tyers停搏液，2 min内灌注完毕；心脏保温缸内置冷生理盐水，心脏停搏120 min。120 min后，灌注装置复温至37℃，从主动脉以Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液灌注15 min，灌注压力同前；收集冠脉回流液，测定心肌酶CK、LDH；15 min后转为做功模型，工作30 min，测定心功能指标(同缺血前，心功能指标以恢复百分比表示)。再灌注毕，快速取下心脏，滤纸吸净心脏表面水分，分析天平称重，置于液氮中保存，用于测定有关的指标。
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1.3 灌注液与停搏液 均用超纯水配制。两种停搏液和Krebs-Henseleit碳酸盐缓冲液(KH)成分见表1。
表1 KH液和两种停搏液的成分与理化特性 组成(mmol.L-1)
MST
KH
Tyers
NaCl
114.0
118.5
88.0
KCl
, 百拇医药 20.0
4.8
5.0
MgCl2
16.0
1.5
CaCl2
2.4
1.8
0.5
NaHCO3
25.0
, 百拇医药
-
KHCO3
20.0
Na acetate
27.0
Na gluconate
23.0
MgSO4 7H2O
1.8
KH2PO4
1.2
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Glucose
11.0
-
pH
7.2
7.4
7.8
Osmolarity(mOsm*L-1)
320
320
332
Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液的pH值在37℃、通以混合气时为7.4。
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1.4 实验分组 将36只幼兔随机分为6组(n=6)，含TMZ停搏液的终浓度为10-6 mol.L-1。
1.5 检测指标与方法
1.5.1 乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK) 采用自动生化分析仪检测。
1.5.2 ATP的测定 采用高效液相色谱技术。采用美国Waters公司高效液相色谱仪，510泵，490E型紫外检测器，4.6 mm×250 mm Spherisorb ODS2柱；5’-ATP钠盐和CP均为美国Sigama公司产品，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，用水为超纯水。称取适量心肌组织(200 mg)，加入1 ml 0.4 mol.L-1 HClO4溶液沉淀，匀浆，冰浴中提取。低速离心，上清液用碱调pH为中性，高速离心，取上清液20 μl进行高效液相色谱仪(HPLC)分析。色谱条件：ODS反相分离柱，流动相为甲醇-KH2PO4缓冲液，流速1.2 ml.min-1，检测波长259 nm。单位μmol.g-1。
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1.5.3 心肌丙二醛的测定 单位μmol.g-1。主要仪器：匀浆器，721分光光度计。主要试剂：10 μmol.L-1 TEP，0.67% TBA，8.1%的SDS，正丁醇。实验步骤：取0.5 g的心肌组织，冰浴中制成10%的组织匀浆；取20 ml的具塞比色管一只，加入匀浆组织0.1～0.2 ml 8.1%的SDS 0.2 ml,摇匀，静置2 min，依次加入20%的醋酸缓冲液(pH为3.5)1.5 ml，0.67%的TBA 1.5 ml，蒸馏水1 ml，摇匀，加塞密封；将比色管放入95℃的水浴中温浴50 min，取出后流水冷却至室温，加蒸馏水1 ml，正丁醇吡啶抽提液5 ml，旋转震荡1 min；混匀的抽提液1 000 g离心15 min，取正丁醇用于测定；制作标准曲线，测定样品管及标准管光密度，比色波长为532 nm；结果以每克组织中所含的MDA的量表示。
1.6 数据处理与统计分析 所测数据以
±s表示，在SPSS统计软件上行均数t检验、ANOVA方差分析。2 结果
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2.1 血流动力学的变化 见表2、3。加入TMZ前，与对照组A0相比，除HR、±dp/dt无明显变化外(P>0.05)，其余各组差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。加入TMZ后，与对照组B0相比和相应组别的A组相比，除HR、AP无明显变化外，其余各组各指标差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。
2.2 心肌酶与心肌生化的改变 见表4。加入TMZ后，B组心肌酶与相应组别的A组相比，各组均差异有显著性(P<0.05)。加入TMZ后，B组心肌生化与相应组别的A组相比，除B1组ATP外，其余各组各指标差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。
3 讨论
与其它抗心绞痛药物相比，TMZ显著特点是在细胞水平发挥抗心肌缺血的功能而无负性肌力，不影响冠脉血流等血流动力学特点，对缺血心肌提供代谢性心肌保护作用〔1〕。其主要作用机制是直接抑制游离脂肪酸的β-氧化，增加葡萄糖的氧化，减少游离脂肪酸因为与葡萄糖的竞争性氧化所致的高氧耗和酸中毒，更有效地调控缺血心肌游离脂肪酸/葡萄糖氧化的供能平衡，减少高能磷酸盐生成过程中对氧的需求，维持ATP的产生，从而维持缺血心肌细胞的能量代谢，避免缺血心肌高能磷酸盐的下降〔2〕；降低细胞内Na+、Ca2+超载；减少心肌细胞内H+的聚集，减轻细胞内酸中毒；减少氧自由基的生成等〔3〕。改良St.Thomas No 1(MST)和Tyers停搏液均属于以高钾为基础的细胞外液性停搏液，对未成熟心肌可提供一定程度的保护效果。本研究发现，上述两种停搏液中加入TMZ后，可显著提高其对未成熟兔心肌的保护效果。
, 百拇医药
3.1 对血流动力学的作用 Mody等对离体工作的鼠心〔1〕、兔心〔4〕、豚鼠〔5〕的研究表明，TMZ不引起明显的血流动力学的改变，但对缺血心肌有明显的保护作用。本研究显示，两种停搏液中加入10-6 mol.L-1 TMZ，离体灌注幼兔心脏缺血120 min后，其血流动力学指标各组均明显改善(P<0.05或P<0.01)，但各组在加入TMZ前后，HR、AP均无明显变化。这与有关TMZ的研究一致。Rahman等〔6〕研究显示，在离体工作鼠心常温下缺血25 min，再灌注30 min，停搏液中加入10-5 mol.L-1的TMZ可明显改善鼠心的主动脉流量或加入10-6 mol.L-1的TMZ的鼠心的心输出量，但鼠心的心率或主动脉压无影响，而10-4 mol.L-1或10-7 mol.L-1的TMZ对心输出量或主动脉流量无明显改变。
, 百拇医药
表2 离体灌注未成熟兔心停搏前的血流动力学变化(±s,n=6) 组别
HR
(beat*min-1)
AF
(ml.min-1)
CF
(mi*min-1)
CO
(ml.min-1)
, 百拇医药
AP
(kPa)
+dp/dtmax
(kPa*s-1)
-dp/dtmin
(kPa*min-1)
SV
(μl/beat)
A0
232.7±11.7
24.4±1.6
, 百拇医药
9.6±0.9
34.0±1.5
11.78±0.96
108.1±3.8
85.0±5.9
146.7±14.4
A1
235.8±9.4
27.7±2.2
9.3±0.5
37.0±2.5
13.42±0.88
, 百拇医药
104.2±2.0
82.9±1.9
157.5±15.8
A2
236.0±10.2
24.8±2.4
9.9±1.5
33.9±1.5
13.80±0.98
102.1±2.6
79.8±4.4
148.4±13.1
, 百拇医药
B0
215.7±15.5
23.3±1.8
9.5±1.9
32.8±2.1
11.31±0.63
106.0±6.0
82.4±1.5
153.1±16.8
B1
214.5±12.2
, 百拇医药 23.9±1.7
10.0±1.3
33.9±2.8
11.98±0.47
107.3±3.9
80.8±1.8
159.1±21.7
B2
210.2±11.6
23.8±3.5
10.4±1.9
34.3±5.3
, 百拇医药
12.24±0.99
99.1±4.1
80.0±3.6
164.0±30.8
表3 离体灌注未成熟兔心再灌注30 min时的血流动力学变化(%，±s,n=6) 组别
HR
(beat*min-1)
AF
(ml.min-1)
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CF
(mi*min-1)
CO
(ml.min-1)
AP
(kPa)
+dp/dtmax
(kPa*s-1)
-dp/dtmin
(kPa*min-1)
, 百拇医药
SV
(μl/beat)
A0
99.06±3.43
78.23±3.45
78.98±1.97
80.43±3.62
74.18±3.32
83.75±2.16
77.04±4.14
79.25±4.32
, 百拇医药 A1
95.95±4.00
85.86±6.22*
83.89±3.28*
85.19±3.12*
74.80±4.89
86.07±1.88
79.78±1.42
87.87±3.42
A2
97.67±5.55
, 百拇医药
69.99±5.74*
71.95±5.15*
70.66±3.48
66.98±3.15
84.10±1.64
79.19±4.17
72.52±4.94*
B0
98.88±5.04
81.70±2.17
83.62±0.85△
, 百拇医药
87.06±0.85△
101.44±3.74
86.30±1.59
82.38±1.47**
88.73±2.36*
B1
99.93±1.62
89.54±3.04*△
95.23±5.29**
91.54±2.55**
, 百拇医药
101.80±4.08
91.45±1.72*△
91.37±1.76△
92.44±2.97**
B2
100.00±1.32
83.78±3.31**
88.68±4.95**
85.99±4.82**
99.22±6.31
, 百拇医药
91.66±1.41**△
88.93±3.05**△
86.64±4.33**
与对照组(A0、B0)相比：*P<0.05，**P<0.01；B与A相应组别相比：△P<0.05表4 离体灌注未成熟兔心再灌注30 min后心肌生化的变化(±s,n=6) 组别/检测指标
LDH(IU*L-1)
CK(IU*L-1)
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ATP(μmol.g-1)
MDA(μmol.g-1)
A0
10.17±1.17
23.00±3.10
1.68±0.11
1.77±0.09
A1
11.50±1.87
19.83±2.14
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1.98±0.54++
1.44±0.12++
A2
11.50±1.85
21.17±2.32
1.35±0.39++
1.62±0.15++
B0
7.00±1.41*
15.67±1.63*
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1.96±0.11*
1.50±0.03*
B1
8.50±1.87*
14.33±1.63*
2.11±0.31
1.02±0.09++*
B2
8.83±2.48*
17.33±2.73*
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2.08±0.18++
1.11±0.22++*
与对照组(A0、B0)相比：++P<0.01；B与A相应组别相比：*P<0.05
3.2 对心肌ATP的影响 缺血再灌注损伤可引起心肌高能磷酸盐储存的明显下降，是导致再灌注后心功能下降的主要原因之一。本研究表明，两种停搏液中加入TMZ后，与相应组别的A组相比，除B1组ATP外，其余各组各指标差异显著(P<0.05或P<0.01)；与对照组B0相比，除B1、B2组ATP无明显变化外，其余各组均变化显著(P<0.01)。这与Larse等〔7〕的研究结果一致。Larse等对鼠心的研究显示，心肌总腺苷酸的浓度的下降，与心功能的恢复下降相平行，认为ATP的降解为心功能恢复下降的原因之一；加入10-6 mol.L-1的TMZ与不加入TMZ相比，ATP的水平升高2倍，心功能恢复明显改善。
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3.3 对心肌酶的影响 缺血再灌注损伤可引起心肌细胞膜完整性与通透性的改变，导致再灌注后心肌酶的大量漏出。本实验显示，TMZ可明显减少离体灌注幼兔心肌酶的漏出，与加入TMZ前相比，加入TMZ后，各组与相应组别的A组相比，差异显著(P<0.05)；与对照组B0相比，各组心肌酶无明显差异(P>0.05)。这与有关的研究结果一致。离体培养的鼠心肌细胞在缺氧的环境中，乳酸脱氢酶的漏出明显增加，但在培养液中加入TMZ后可明显减少该酶的漏出〔8〕。
3.4 对心肌氧自由基的影响 心肌再灌注后可因复氧灌注而生成大量氧自由基，直接影响心功能的恢复。本实验发现，加入TMZ后，与加入前相比，心肌MDA生成量减少(P<0.01)。这与有关研究一致。Guarnieri等〔9〕对离体灌注鼠心的研究表明，TMZ可减少心肌丙二醛的生成，且与剂量有关，10 mmol.L-1的TMZ作用最明显。
, 百拇医药
总之，本研究显示，TMZ可改善离体灌注幼兔心脏的血流动力学，提高心肌的能量储存，减少自由基的产生和心肌酶的漏出，减轻缺血心肌的再灌注损伤。
作者简介：梅运清，男，38岁，博士
参考文献
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5，Hugtenburg JG, Jap TJW, Mathy MJ et al. Cardioprotection effect of trimetazidine and nifedipin in guinea pig hearts subjected to ischemia. Arch Int Pharmacodyn Ther, 1989;300:186
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6，Rahman F, Toshima Y, Kohno H et al. The protection effects of trimetazidine on normothermic ischemic myocardium in rats. JPN J Surg, 1989;19:346
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2000-03-07收稿，2000-06-08修回, 百拇医药
单位：梅运清 龙村 温福兴 张燕婉 史世勇(中国协和医科大学心血管病研究所阜外心血管病医院麻醉体外循环研究室，北京 100037)；程邦昌(湖北医科大学第一附属医院胸心外科，武汉 430060)
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安徽医科大学学报000405 摘要 目的 探讨两种晶体停搏液中(Modified St. Thomas No 1-MST、Tyers solution)加入细胞保护剂三甲氧苄嗪对未成熟心肌的作用。方法 以离体灌注幼兔心为研究对象，观察两种晶体停搏液在幼兔心14℃缺血2 h后血流动力学、冠脉流出液心肌酶和心肌生化的变化。结果 与对照组相比，三甲氧苄嗪可明显提高晶体停搏液对离体灌注幼兔心功能的恢复，明显减少心肌酶的漏出和氧自由基的生成(P<0.05)，增加高能磷酸盐的储存(P<0.05)。结论 三甲氧苄嗪可明显提高晶体停搏液对未成熟心肌的保护效果。
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Abstract Objective To investigate the effect of addition of trimetazidine to two cardioplegias (Modified St. Thomas No 1-MST、 Tyers solution, and final concentration of each solution was 10-6 mol.L-1) on immature myocardium. Methods To observe the change of hemodynamics, myocardial biochemistry of the perfused immature rabbit heart in vitro for two hours of ischemia. Results Compared with the control group, cardioplegias containing trimetazidine could markedly enhance the post-ischemic hemodynamics, tremendously lower the myocardial enzyme leakage and production of oxygen free radical, and improve high-energy phosphates preservation. Conclusion Cytoprotective agent trimetazidine can significantly improve the myocardial protective effect of the two crystalloid cardioplegias on immature heart.
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晶体停搏液对成熟心肌可提供满意的心肌保护效果，但临床上所用的5种晶体停搏液(Modified St. Thomas Hospital No 1-MST、 St. Thomas Hospital No 2-STH、 Tyers、 Bretschneider-HTK和Roe)，对未成熟心肌保护效果均不满意。目前认为，晶体停搏液对未成熟心肌保护效果欠佳的主要原因是适合成熟心肌的停搏液，不适合用于未成熟心肌，其配方(组成)还有待于改进和完善〔1〕。因此，诸多研究均集中在探索较理想的停搏液离子浓度、pH值、渗透压等方面，但结果仍不理想；进而又在停搏液中添加各种成分，以改善心肌的能量代谢，减少再灌注时自由基生成，减轻钙离子超载和组织酸中毒，但仍无定论。而在心脏缺血期间直接用药物的方法改善心肌的代谢，阻断或最大限度的减轻心肌的缺血再灌注损伤，为近年来围体外循环期心肌保护研究的方向之一。为此，本实验以离体灌注幼兔心脏为模型，以常用的两种停搏液(Modified St. Thomas Hospital No 1-MST、Tyers)为研究对象，添加一种在细胞水平发挥作用，能从多个环节提高和改善心肌代谢，减轻心肌缺血再灌注损伤的细胞保护剂三甲氧苄嗪(Tmetazidine，TMZ)，通过观察TMZ对离体灌注幼兔心脏血流动力学、心肌酶和心肌生化的变化，探讨TMZ对未成熟心肌的作用，进而为临床使用提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验仪器与试剂 多导生理记录仪(Macintosh, Quadra 610, Japan)，Stockert血泵(Germany)，混合气(O2：CO2=95%：5%，北京普莱克斯公司)。离体心灌注装置：根据Neely介绍的方法设计改进。心停搏液和Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液试剂均为国产分析纯，三甲氧苄嗪为法国Servier公司产品，药品批号：023006388-5.98。
1.2 动物模型的建立 实验用兔为中国医学科学院、中国协和医科大学实验动物中心提供(纯种新西兰白兔)。幼兔重150～220 g，兔龄7～14天。以戊巴比妥钠腹腔麻醉(50 mg.kg-1)，经股静脉肝素化(150 IU*kg-1)。快速开胸取出心脏，浸入4℃生理盐水，立即连于Langendorff灌注装置开始灌注，初始灌注用通以混合气(O2：CO2=95%:5%)的经改良的Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液，温度37℃，剪开肺动脉根部，结扎肺静脉，上、下腔静脉，剪开左心耳，插入左房灌注管，立即将心脏移入保温缸内。主动脉灌注15 min后，开启左房灌注管，阻断主动脉灌注管，转为工作模型，稳定后同步收集主动脉流量(AF)，冠状动脉引流量(CF)，计算心输出量(CO，CO=AF+CF)，左室最大压力变化速率(±dp/dtmax)，根据心电图计算心率(HR)。做功稳定30 min后，关闭左房灌注管；启动低温恒温器，使恒温器的温度恒定在14℃；经主动脉根部灌注4℃的MST、Tyers停搏液，2 min内灌注完毕；心脏保温缸内置冷生理盐水，心脏停搏120 min。120 min后，灌注装置复温至37℃，从主动脉以Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液灌注15 min，灌注压力同前；收集冠脉回流液，测定心肌酶CK、LDH；15 min后转为做功模型，工作30 min，测定心功能指标(同缺血前，心功能指标以恢复百分比表示)。再灌注毕，快速取下心脏，滤纸吸净心脏表面水分，分析天平称重，置于液氮中保存，用于测定有关的指标。
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1.3 灌注液与停搏液 均用超纯水配制。两种停搏液和Krebs-Henseleit碳酸盐缓冲液(KH)成分见表1。
表1 KH液和两种停搏液的成分与理化特性 组成(mmol.L-1)
MST
KH
Tyers
NaCl
114.0
118.5
88.0
KCl
, 百拇医药 20.0
4.8
5.0
MgCl2
16.0
1.5
CaCl2
2.4
1.8
0.5
NaHCO3
25.0
, 百拇医药
-
KHCO3
20.0
Na acetate
27.0
Na gluconate
23.0
MgSO4 7H2O
1.8
KH2PO4
1.2
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Glucose
11.0
-
pH
7.2
7.4
7.8
Osmolarity(mOsm*L-1)
320
320
332
Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液的pH值在37℃、通以混合气时为7.4。
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1.4 实验分组 将36只幼兔随机分为6组(n=6)，含TMZ停搏液的终浓度为10-6 mol.L-1。
1.5 检测指标与方法
1.5.1 乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK) 采用自动生化分析仪检测。
1.5.2 ATP的测定 采用高效液相色谱技术。采用美国Waters公司高效液相色谱仪，510泵，490E型紫外检测器，4.6 mm×250 mm Spherisorb ODS2柱；5’-ATP钠盐和CP均为美国Sigama公司产品，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，用水为超纯水。称取适量心肌组织(200 mg)，加入1 ml 0.4 mol.L-1 HClO4溶液沉淀，匀浆，冰浴中提取。低速离心，上清液用碱调pH为中性，高速离心，取上清液20 μl进行高效液相色谱仪(HPLC)分析。色谱条件：ODS反相分离柱，流动相为甲醇-KH2PO4缓冲液，流速1.2 ml.min-1，检测波长259 nm。单位μmol.g-1。
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1.5.3 心肌丙二醛的测定 单位μmol.g-1。主要仪器：匀浆器，721分光光度计。主要试剂：10 μmol.L-1 TEP，0.67% TBA，8.1%的SDS，正丁醇。实验步骤：取0.5 g的心肌组织，冰浴中制成10%的组织匀浆；取20 ml的具塞比色管一只，加入匀浆组织0.1～0.2 ml 8.1%的SDS 0.2 ml,摇匀，静置2 min，依次加入20%的醋酸缓冲液(pH为3.5)1.5 ml，0.67%的TBA 1.5 ml，蒸馏水1 ml，摇匀，加塞密封；将比色管放入95℃的水浴中温浴50 min，取出后流水冷却至室温，加蒸馏水1 ml，正丁醇吡啶抽提液5 ml，旋转震荡1 min；混匀的抽提液1 000 g离心15 min，取正丁醇用于测定；制作标准曲线，测定样品管及标准管光密度，比色波长为532 nm；结果以每克组织中所含的MDA的量表示。
1.6 数据处理与统计分析 所测数据以
±s表示，在SPSS统计软件上行均数t检验、ANOVA方差分析。2 结果, http://www.100md.com
2.1 血流动力学的变化 见表2、3。加入TMZ前，与对照组A0相比，除HR、±dp/dt无明显变化外(P>0.05)，其余各组差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。加入TMZ后，与对照组B0相比和相应组别的A组相比，除HR、AP无明显变化外，其余各组各指标差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。
2.2 心肌酶与心肌生化的改变 见表4。加入TMZ后，B组心肌酶与相应组别的A组相比，各组均差异有显著性(P<0.05)。加入TMZ后，B组心肌生化与相应组别的A组相比，除B1组ATP外，其余各组各指标差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。
3 讨论
与其它抗心绞痛药物相比，TMZ显著特点是在细胞水平发挥抗心肌缺血的功能而无负性肌力，不影响冠脉血流等血流动力学特点，对缺血心肌提供代谢性心肌保护作用〔1〕。其主要作用机制是直接抑制游离脂肪酸的β-氧化，增加葡萄糖的氧化，减少游离脂肪酸因为与葡萄糖的竞争性氧化所致的高氧耗和酸中毒，更有效地调控缺血心肌游离脂肪酸/葡萄糖氧化的供能平衡，减少高能磷酸盐生成过程中对氧的需求，维持ATP的产生，从而维持缺血心肌细胞的能量代谢，避免缺血心肌高能磷酸盐的下降〔2〕；降低细胞内Na+、Ca2+超载；减少心肌细胞内H+的聚集，减轻细胞内酸中毒；减少氧自由基的生成等〔3〕。改良St.Thomas No 1(MST)和Tyers停搏液均属于以高钾为基础的细胞外液性停搏液，对未成熟心肌可提供一定程度的保护效果。本研究发现，上述两种停搏液中加入TMZ后，可显著提高其对未成熟兔心肌的保护效果。
, 百拇医药
3.1 对血流动力学的作用 Mody等对离体工作的鼠心〔1〕、兔心〔4〕、豚鼠〔5〕的研究表明，TMZ不引起明显的血流动力学的改变，但对缺血心肌有明显的保护作用。本研究显示，两种停搏液中加入10-6 mol.L-1 TMZ，离体灌注幼兔心脏缺血120 min后，其血流动力学指标各组均明显改善(P<0.05或P<0.01)，但各组在加入TMZ前后，HR、AP均无明显变化。这与有关TMZ的研究一致。Rahman等〔6〕研究显示，在离体工作鼠心常温下缺血25 min，再灌注30 min，停搏液中加入10-5 mol.L-1的TMZ可明显改善鼠心的主动脉流量或加入10-6 mol.L-1的TMZ的鼠心的心输出量，但鼠心的心率或主动脉压无影响，而10-4 mol.L-1或10-7 mol.L-1的TMZ对心输出量或主动脉流量无明显改变。
, 百拇医药
表2 离体灌注未成熟兔心停搏前的血流动力学变化(
±s,n=6) 组别HR
(beat*min-1)
AF
(ml.min-1)
CF
(mi*min-1)
CO
(ml.min-1)
, 百拇医药
AP
(kPa)
+dp/dtmax
(kPa*s-1)
-dp/dtmin
(kPa*min-1)
SV
(μl/beat)
A0
232.7±11.7
24.4±1.6
, 百拇医药
9.6±0.9
34.0±1.5
11.78±0.96
108.1±3.8
85.0±5.9
146.7±14.4
A1
235.8±9.4
27.7±2.2
9.3±0.5
37.0±2.5
13.42±0.88
, 百拇医药
104.2±2.0
82.9±1.9
157.5±15.8
A2
236.0±10.2
24.8±2.4
9.9±1.5
33.9±1.5
13.80±0.98
102.1±2.6
79.8±4.4
148.4±13.1
, 百拇医药
B0
215.7±15.5
23.3±1.8
9.5±1.9
32.8±2.1
11.31±0.63
106.0±6.0
82.4±1.5
153.1±16.8
B1
214.5±12.2
, 百拇医药 23.9±1.7
10.0±1.3
33.9±2.8
11.98±0.47
107.3±3.9
80.8±1.8
159.1±21.7
B2
210.2±11.6
23.8±3.5
10.4±1.9
34.3±5.3
, 百拇医药
12.24±0.99
99.1±4.1
80.0±3.6
164.0±30.8
表3 离体灌注未成熟兔心再灌注30 min时的血流动力学变化(%，
±s,n=6) 组别HR
(beat*min-1)
AF
(ml.min-1)
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CF
(mi*min-1)
CO
(ml.min-1)
AP
(kPa)
+dp/dtmax
(kPa*s-1)
-dp/dtmin
(kPa*min-1)
, 百拇医药
SV
(μl/beat)
A0
99.06±3.43
78.23±3.45
78.98±1.97
80.43±3.62
74.18±3.32
83.75±2.16
77.04±4.14
79.25±4.32
, 百拇医药 A1
95.95±4.00
85.86±6.22*
83.89±3.28*
85.19±3.12*
74.80±4.89
86.07±1.88
79.78±1.42
87.87±3.42
A2
97.67±5.55
, 百拇医药
69.99±5.74*
71.95±5.15*
70.66±3.48
66.98±3.15
84.10±1.64
79.19±4.17
72.52±4.94*
B0
98.88±5.04
81.70±2.17
83.62±0.85△
, 百拇医药
87.06±0.85△
101.44±3.74
86.30±1.59
82.38±1.47**
88.73±2.36*
B1
99.93±1.62
89.54±3.04*△
95.23±5.29**
91.54±2.55**
, 百拇医药
101.80±4.08
91.45±1.72*△
91.37±1.76△
92.44±2.97**
B2
100.00±1.32
83.78±3.31**
88.68±4.95**
85.99±4.82**
99.22±6.31
, 百拇医药
91.66±1.41**△
88.93±3.05**△
86.64±4.33**
与对照组(A0、B0)相比：*P<0.05，**P<0.01；B与A相应组别相比：△P<0.05表4 离体灌注未成熟兔心再灌注30 min后心肌生化的变化(
±s,n=6) 组别/检测指标LDH(IU*L-1)
CK(IU*L-1)
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ATP(μmol.g-1)
MDA(μmol.g-1)
A0
10.17±1.17
23.00±3.10
1.68±0.11
1.77±0.09
A1
11.50±1.87
19.83±2.14
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1.98±0.54++
1.44±0.12++
A2
11.50±1.85
21.17±2.32
1.35±0.39++
1.62±0.15++
B0
7.00±1.41*
15.67±1.63*
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1.96±0.11*
1.50±0.03*
B1
8.50±1.87*
14.33±1.63*
2.11±0.31
1.02±0.09++*
B2
8.83±2.48*
17.33±2.73*
, 百拇医药
2.08±0.18++
1.11±0.22++*
与对照组(A0、B0)相比：++P<0.01；B与A相应组别相比：*P<0.05
3.2 对心肌ATP的影响 缺血再灌注损伤可引起心肌高能磷酸盐储存的明显下降，是导致再灌注后心功能下降的主要原因之一。本研究表明，两种停搏液中加入TMZ后，与相应组别的A组相比，除B1组ATP外，其余各组各指标差异显著(P<0.05或P<0.01)；与对照组B0相比，除B1、B2组ATP无明显变化外，其余各组均变化显著(P<0.01)。这与Larse等〔7〕的研究结果一致。Larse等对鼠心的研究显示，心肌总腺苷酸的浓度的下降，与心功能的恢复下降相平行，认为ATP的降解为心功能恢复下降的原因之一；加入10-6 mol.L-1的TMZ与不加入TMZ相比，ATP的水平升高2倍，心功能恢复明显改善。
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3.3 对心肌酶的影响 缺血再灌注损伤可引起心肌细胞膜完整性与通透性的改变，导致再灌注后心肌酶的大量漏出。本实验显示，TMZ可明显减少离体灌注幼兔心肌酶的漏出，与加入TMZ前相比，加入TMZ后，各组与相应组别的A组相比，差异显著(P<0.05)；与对照组B0相比，各组心肌酶无明显差异(P>0.05)。这与有关的研究结果一致。离体培养的鼠心肌细胞在缺氧的环境中，乳酸脱氢酶的漏出明显增加，但在培养液中加入TMZ后可明显减少该酶的漏出〔8〕。
3.4 对心肌氧自由基的影响 心肌再灌注后可因复氧灌注而生成大量氧自由基，直接影响心功能的恢复。本实验发现，加入TMZ后，与加入前相比，心肌MDA生成量减少(P<0.01)。这与有关研究一致。Guarnieri等〔9〕对离体灌注鼠心的研究表明，TMZ可减少心肌丙二醛的生成，且与剂量有关，10 mmol.L-1的TMZ作用最明显。
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总之，本研究显示，TMZ可改善离体灌注幼兔心脏的血流动力学，提高心肌的能量储存，减少自由基的产生和心肌酶的漏出，减轻缺血心肌的再灌注损伤。
作者简介：梅运清，男，38岁，博士
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2000-03-07收稿，2000-06-08修回, 百拇医药