舒心口服液对心肌细胞缺糖缺氧损伤的保护作用
作者：徐伟建 张晓星 王汉祥 屈松柏 张道亮
单位：徐伟建(湖北中医学院附属医院 430061)；张晓星(湖北中医学院附属医院 430061)；王汉祥(湖北中医学院附属医院 430061)屈松柏(湖北中医学院附属医院 430061)；张道亮(湖北中医学院附属医院 430061)
关键词：舒心口服液；保护心肌细胞；心肌酶活性
湖北中医学院学报000107
摘要：探讨舒心口服液对缺糖缺氧损伤心肌细胞形态和心肌酶活性影响。结果表明，不同浓度的舒心口服液具有保护缺血性损伤心肌细胞的作用，且呈量效依赖关系。高浓度(500μg/ml)舒心口服液释放的LDH、GOT、CPK，明显低于心得安组，表明舒心口服液的保护作用强于心得安。
中图分类号：R256.2 文献标识码：A 文章编号：1008-987X(2000)01-0016-02
, 百拇医药
Protection of Shuxin Oral Solution on Cardiac-musele
Cell Damaged by Deficiency of Sugar and Oxygen
Xu Jianwei,Zhang Xiaoxing,Wang Hanxiang,et al
(Affiliated Hospital of Hubei college of TCM Wuhan 430061)
Abstract：To probe into effect of shuxin oral solution on appearance and enzymatic activity of damaged cardiac-musele cell.Results:Shuxin oral solution of different concentration had protection of cardiar-musele cell damaged by ischemia,which had dose-effect dependence relationship.LDH,GOT,CPK released by high concentration shuxin oral solution were significantly lower than that of propanolol group.Conclusion:The protection of high concentration of shuxin oral solution to cardiac-musele cell was more powerful than that of propanolol.
, 百拇医药
Key words:Shuxin oral solution Protect cardiac-musele cell Cardiac-musele enzymatic activity
舒心口服液系我院张晓星教授治疗冠心病的经验方，用之临床，颇有效验。本文就舒心口服液对心肌细胞缺糖缺氧损伤的保护作用进行研究，现报道如下。
1 材料
舒心口服液由宜昌民康制药厂生产(批号：960323，每支20ml，含生药30g)；心得安注射液由北京制药厂生产；Eagle培养基；小牛血清；胰蛋白酶(Trypsin)，浓度为1∶250；初生2～3天的SD种大鼠若干只。
2 方法
2.1 细胞培养方法[1，2]
, http://www.100md.com
取出生后2～3天Sprague-Dawlay种大鼠(雌雄不限)，用改良的Harary等方法进行细胞分离。常规消毒后开胸，剖取心室剪成1mm3碎块，经无钙镁的磷酸缓冲液冲洗2次后，用0.06%的胰蛋白酶消化6～7次，用Eagle培养基制成1×106/ml的悬液，加入10%小牛血清，分别接种于细胞培养瓶和试管内，置37°C二氧化碳培养基内培养。
2.2 造模方法[3]
(1)缺糖：用缺糖的Hanks液代替正常培养基。
(2)缺氧：将缺糖的Hanks液先用高纯氮气(99.999%)饱和15分钟。实验时换入这种Hanks液，培养瓶内立即充入氮气(1L/min)30秒，以置换瓶内空气，然后塞紧瓶塞。
正常对照组用正常培养基，不含氮气。
, 百拇医药
2.3 实验分组：
第①组(正常对照组)5管；第②组(缺糖缺氧组5管)；第③组(缺糖缺氧+心得安组5管)，实验时将其稀释为10μg/ml，每管加药50μl；第④组(缺糖缺氧+舒心口服液125μg/ml)6管；第⑤组(缺糖缺氧+舒心口服液250μg/ml)6管；第⑥组(缺糖缺氧+舒心口服液500μg/ml)6管。每管加药50μl。在二氧化碳培养箱内培养3小时后，观察心肌细胞形态及培养基中心肌酶释放。
2.4 观测指标
(1)形态学观察：取培养3小时后实验各组细胞悬液，离心沉淀涂片用姬姆萨染色法，在10×100倍光镜下观察细胞形态。取实验各组心肌细胞悬液沉淀涂片，染色固定在透射电镜下观察其超微结构。
(2)心肌酶活性测定：取培养3小时实验各组细胞悬液离心取上清液，在美国贝克公司生产的Enocore离心式全自动分析仪上测定LDH、GOT、CPK的含量。
, 百拇医药
2.5 统计方法：
两组数据比较均用t检验，各组数据均值以
±S表示。
3 实验结果
3.1 形态学改变
正常培养3小时乳鼠心肌细胞呈圆形或梭形；边界清晰，细胞表面有大量细小微突起，呈皱褶样，胞质均匀。超微结构示心肌细胞各类细胞器形态清晰，核为染色质，均匀分布，未见核固缩现象，胞质内线粒体丰富。
缺糖缺氧损伤3小时心肌细胞形态发生改变：细胞膜破损，表面微突消失，边界不清，细胞呈水肿。有些核畸形呈固缩状改变，核内染色质呈凝集状，不规则分布，线粒体肿胀，嵴短而少，排列不规则，部分线粒体空泡变性，嵴消失，糖原颗粒减少。
, 百拇医药
缺糖缺氧加舒心口服液组乳鼠的心肌细胞形态，与正常组略同，大部分核尚正常，呈圆形或椭圆形。少数核稍有内褶，核内染色质分布均匀，线粒体密集，仅见少量线粒体嵴少。舒心口服液浓度越大，其超微结构损坏越少，空泡亦少。
缺糖缺氧加心得安组的乳鼠的心肌细胞形态改变，与舒心口服液组大致相同。
3.2 心肌酶活性改变 参见表1～表3
表1 舒心口服液对心肌细胞LDH影响(±SD) 组 别
数量(n)
LDH
P
第①组
, 百拇医药
5
57.75±6.5
<0.001
第②组
5
121.20±8.31
第③组
5
92.40±4.81
<0.01
第④组
6
89.83±6.5
, 百拇医药
<0.01
第⑤组
6
87.00±7.77
<0.01
第⑥组
6
79.5±5.31*
<0.01
*第⑥组与第③组比较，P<0.05。
表2 舒心口服液对培养基中GOT影响(±SD) 组 别
, 百拇医药
数量(n)
GOT
P
第①组
5
163.75±28.48
<0.001
第②组
5
262.80±10.18
第③组
5
245.6±8.84
, 百拇医药
<0.01
第④组
6
232.5±20.12
<0.05
第⑤组
6
226.0±23.56
<0.01
第⑥组
6
260.0±9.75*
<0.01
, http://www.100md.com
*第⑥组与第③组比较，P<0.01。
表3 舒心口服液对心肌细胞CPK影响(±SD)
组 别
数量(n)
CPK
P
第①组
5
25.5±2.65
<0.001
第②组
, 百拇医药
5
52.8±4.71
第③组
5
44.8±3.34
<0.01
第④组
6
39.6±5.03
<0.01
第⑤组
6
37.2±2.80
, 百拇医药
<0.01
第⑥组
6
32±3.34*
<0.01
*第⑥组与第③组比较，P<0.05。
4 讨论
培养的心肌细胞因失去了完整心脏中大量存在的非心肌细胞和细胞间质等所形成的屏障，所以对药物敏感性大为提高。这种心肌细胞标本的特性，有些在完整心脏上不易显示出来[4]。目前国内多采用单味中药及有效成分开展对培养心肌细胞影响的研究。笔者试图从复方制剂方面讨论中药对缺糖缺氧损伤心肌细胞影响。本实验结果表明：不同浓度舒心口服液能减轻心肌细胞缺糖缺氧性损伤的形态学改变，减少培养基中LDH、GOT、CPK心肌酶活性释放。随着药物浓度上升，上述改善幅度更大，且呈量效依赖关系。表明舒心口服液对心肌细胞损伤具有保护作用。
, 百拇医药
心肌细胞酶的释放是细胞严重损伤的一个征象，随着酶的释放而出现各种超微结构的改变。同时，在培养心肌细胞“缺血”早期，酶从胞浆中漏出与细胞膜功能受损有关。但这种损伤是可逆的，如再恢复给氧及葡萄糖，心肌细胞各种功能又可恢复。细胞水平对这种损伤的保护作用，是通过稳定细胞膜或增加能量供应(无氧性ATP产生)及降低能量消耗等作用达到的。有人[3]观察到，在细胞水平具有保护缺血心肌细胞损伤的甲基强的松龙进入心肌细胞后，大部分集中在肌膜，少部分集中在溶酶体膜上。笔者推测，舒心口服液的保护作用机制，可能与其稳定心肌细胞膜、增加能量供应、减少能量消耗、加强细胞代谢和补偿能力、减轻线粒体水肿有关。
本实验证实：第③组释放LDH、GOT、CPK明显低于第②组，表明心得安具有保护缺血心肌细胞的作用，与文献报道相符[5]。实验还发现，高浓度(500μg/ml)舒心口服液释放LDH、GOT、CPK明显低于第②组，表明舒心口服液保护作用强于心得安，作用机制尚待研究。
, 百拇医药
徐伟建，男，1965年生，主治医师。
参考文献
1 李连达，李映欧等.野菊花提取物CI-2对体外培养乳鼠心肌细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用[J].中西医结合杂志.1981，1(2)：91
2 Kruse P f et al Tissume Culnre Methods and Application Ac ademic Press 1973.
3 程薇.培养心肌细胞缺血性损伤模型的研究进展[J].西安医科大学学报.1990；11(2)：185～187
4 孙红.体外培养心肌细胞纯化方法及其应用[J].细胞生物学杂志.1988；10(2)：85～87
5 Kloner R.A.et al Observations on experinental myocardial ischenia Cardiouasic Res [M].14:371;1980
(收稿日期：1999-09-06), 百拇医药
单位：徐伟建(湖北中医学院附属医院 430061)；张晓星(湖北中医学院附属医院 430061)；王汉祥(湖北中医学院附属医院 430061)屈松柏(湖北中医学院附属医院 430061)；张道亮(湖北中医学院附属医院 430061)
关键词：舒心口服液；保护心肌细胞；心肌酶活性
湖北中医学院学报000107
摘要：探讨舒心口服液对缺糖缺氧损伤心肌细胞形态和心肌酶活性影响。结果表明，不同浓度的舒心口服液具有保护缺血性损伤心肌细胞的作用，且呈量效依赖关系。高浓度(500μg/ml)舒心口服液释放的LDH、GOT、CPK，明显低于心得安组，表明舒心口服液的保护作用强于心得安。
中图分类号：R256.2 文献标识码：A 文章编号：1008-987X(2000)01-0016-02
, 百拇医药
Protection of Shuxin Oral Solution on Cardiac-musele
Cell Damaged by Deficiency of Sugar and Oxygen
Xu Jianwei,Zhang Xiaoxing,Wang Hanxiang,et al
(Affiliated Hospital of Hubei college of TCM Wuhan 430061)
Abstract：To probe into effect of shuxin oral solution on appearance and enzymatic activity of damaged cardiac-musele cell.Results:Shuxin oral solution of different concentration had protection of cardiar-musele cell damaged by ischemia,which had dose-effect dependence relationship.LDH,GOT,CPK released by high concentration shuxin oral solution were significantly lower than that of propanolol group.Conclusion:The protection of high concentration of shuxin oral solution to cardiac-musele cell was more powerful than that of propanolol.
, 百拇医药
Key words:Shuxin oral solution Protect cardiac-musele cell Cardiac-musele enzymatic activity
舒心口服液系我院张晓星教授治疗冠心病的经验方，用之临床，颇有效验。本文就舒心口服液对心肌细胞缺糖缺氧损伤的保护作用进行研究，现报道如下。
1 材料
舒心口服液由宜昌民康制药厂生产(批号：960323，每支20ml，含生药30g)；心得安注射液由北京制药厂生产；Eagle培养基；小牛血清；胰蛋白酶(Trypsin)，浓度为1∶250；初生2～3天的SD种大鼠若干只。
2 方法
2.1 细胞培养方法[1，2]
, http://www.100md.com
取出生后2～3天Sprague-Dawlay种大鼠(雌雄不限)，用改良的Harary等方法进行细胞分离。常规消毒后开胸，剖取心室剪成1mm3碎块，经无钙镁的磷酸缓冲液冲洗2次后，用0.06%的胰蛋白酶消化6～7次，用Eagle培养基制成1×106/ml的悬液，加入10%小牛血清，分别接种于细胞培养瓶和试管内，置37°C二氧化碳培养基内培养。
2.2 造模方法[3]
(1)缺糖：用缺糖的Hanks液代替正常培养基。
(2)缺氧：将缺糖的Hanks液先用高纯氮气(99.999%)饱和15分钟。实验时换入这种Hanks液，培养瓶内立即充入氮气(1L/min)30秒，以置换瓶内空气，然后塞紧瓶塞。
正常对照组用正常培养基，不含氮气。
, 百拇医药
2.3 实验分组：
第①组(正常对照组)5管；第②组(缺糖缺氧组5管)；第③组(缺糖缺氧+心得安组5管)，实验时将其稀释为10μg/ml，每管加药50μl；第④组(缺糖缺氧+舒心口服液125μg/ml)6管；第⑤组(缺糖缺氧+舒心口服液250μg/ml)6管；第⑥组(缺糖缺氧+舒心口服液500μg/ml)6管。每管加药50μl。在二氧化碳培养箱内培养3小时后，观察心肌细胞形态及培养基中心肌酶释放。
2.4 观测指标
(1)形态学观察：取培养3小时后实验各组细胞悬液，离心沉淀涂片用姬姆萨染色法，在10×100倍光镜下观察细胞形态。取实验各组心肌细胞悬液沉淀涂片，染色固定在透射电镜下观察其超微结构。
(2)心肌酶活性测定：取培养3小时实验各组细胞悬液离心取上清液，在美国贝克公司生产的Enocore离心式全自动分析仪上测定LDH、GOT、CPK的含量。
, 百拇医药
2.5 统计方法：
两组数据比较均用t检验，各组数据均值以
±S表示。3 实验结果
3.1 形态学改变
正常培养3小时乳鼠心肌细胞呈圆形或梭形；边界清晰，细胞表面有大量细小微突起，呈皱褶样，胞质均匀。超微结构示心肌细胞各类细胞器形态清晰，核为染色质，均匀分布，未见核固缩现象，胞质内线粒体丰富。
缺糖缺氧损伤3小时心肌细胞形态发生改变：细胞膜破损，表面微突消失，边界不清，细胞呈水肿。有些核畸形呈固缩状改变，核内染色质呈凝集状，不规则分布，线粒体肿胀，嵴短而少，排列不规则，部分线粒体空泡变性，嵴消失，糖原颗粒减少。
, 百拇医药
缺糖缺氧加舒心口服液组乳鼠的心肌细胞形态，与正常组略同，大部分核尚正常，呈圆形或椭圆形。少数核稍有内褶，核内染色质分布均匀，线粒体密集，仅见少量线粒体嵴少。舒心口服液浓度越大，其超微结构损坏越少，空泡亦少。
缺糖缺氧加心得安组的乳鼠的心肌细胞形态改变，与舒心口服液组大致相同。
3.2 心肌酶活性改变 参见表1～表3
表1 舒心口服液对心肌细胞LDH影响(
±SD) 组 别数量(n)
LDH
P
第①组
, 百拇医药
5
57.75±6.5
<0.001
第②组
5
121.20±8.31
第③组
5
92.40±4.81
<0.01
第④组
6
89.83±6.5
, 百拇医药
<0.01
第⑤组
6
87.00±7.77
<0.01
第⑥组
6
79.5±5.31*
<0.01
*第⑥组与第③组比较，P<0.05。
表2 舒心口服液对培养基中GOT影响(
±SD) 组 别, 百拇医药
数量(n)
GOT
P
第①组
5
163.75±28.48
<0.001
第②组
5
262.80±10.18
第③组
5
245.6±8.84
, 百拇医药
<0.01
第④组
6
232.5±20.12
<0.05
第⑤组
6
226.0±23.56
<0.01
第⑥组
6
260.0±9.75*
<0.01
, http://www.100md.com
*第⑥组与第③组比较，P<0.01。
表3 舒心口服液对心肌细胞CPK影响(
±SD)组 别
数量(n)
CPK
P
第①组
5
25.5±2.65
<0.001
第②组
, 百拇医药
5
52.8±4.71
第③组
5
44.8±3.34
<0.01
第④组
6
39.6±5.03
<0.01
第⑤组
6
37.2±2.80
, 百拇医药
<0.01
第⑥组
6
32±3.34*
<0.01
*第⑥组与第③组比较，P<0.05。
4 讨论
培养的心肌细胞因失去了完整心脏中大量存在的非心肌细胞和细胞间质等所形成的屏障，所以对药物敏感性大为提高。这种心肌细胞标本的特性，有些在完整心脏上不易显示出来[4]。目前国内多采用单味中药及有效成分开展对培养心肌细胞影响的研究。笔者试图从复方制剂方面讨论中药对缺糖缺氧损伤心肌细胞影响。本实验结果表明：不同浓度舒心口服液能减轻心肌细胞缺糖缺氧性损伤的形态学改变，减少培养基中LDH、GOT、CPK心肌酶活性释放。随着药物浓度上升，上述改善幅度更大，且呈量效依赖关系。表明舒心口服液对心肌细胞损伤具有保护作用。
, 百拇医药
心肌细胞酶的释放是细胞严重损伤的一个征象，随着酶的释放而出现各种超微结构的改变。同时，在培养心肌细胞“缺血”早期，酶从胞浆中漏出与细胞膜功能受损有关。但这种损伤是可逆的，如再恢复给氧及葡萄糖，心肌细胞各种功能又可恢复。细胞水平对这种损伤的保护作用，是通过稳定细胞膜或增加能量供应(无氧性ATP产生)及降低能量消耗等作用达到的。有人[3]观察到，在细胞水平具有保护缺血心肌细胞损伤的甲基强的松龙进入心肌细胞后，大部分集中在肌膜，少部分集中在溶酶体膜上。笔者推测，舒心口服液的保护作用机制，可能与其稳定心肌细胞膜、增加能量供应、减少能量消耗、加强细胞代谢和补偿能力、减轻线粒体水肿有关。
本实验证实：第③组释放LDH、GOT、CPK明显低于第②组，表明心得安具有保护缺血心肌细胞的作用，与文献报道相符[5]。实验还发现，高浓度(500μg/ml)舒心口服液释放LDH、GOT、CPK明显低于第②组，表明舒心口服液保护作用强于心得安，作用机制尚待研究。
, 百拇医药
徐伟建，男，1965年生，主治医师。
参考文献
1 李连达，李映欧等.野菊花提取物CI-2对体外培养乳鼠心肌细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用[J].中西医结合杂志.1981，1(2)：91
2 Kruse P f et al Tissume Culnre Methods and Application Ac ademic Press 1973.
3 程薇.培养心肌细胞缺血性损伤模型的研究进展[J].西安医科大学学报.1990；11(2)：185～187
4 孙红.体外培养心肌细胞纯化方法及其应用[J].细胞生物学杂志.1988；10(2)：85～87
5 Kloner R.A.et al Observations on experinental myocardial ischenia Cardiouasic Res [M].14:371;1980
(收稿日期：1999-09-06), 百拇医药