加味温胆汤对亚急性衰老大鼠大脑皮质超微结构改变的影响①
作者：皮明钧 文 彬 吴润秋 陈北阳 陈 力 刘 莺
单位：皮明钧 文 彬 吴润秋 陈北阳 陈 力 刘 莺(湖南中医学院基础课部 长沙410007)
关键词：温胆汤；衰老；大脑皮质神经元；超微结构；大鼠
湖南中医学院学报/990105 提要 在电镜下观察了加味温胆汤对D-半乳糖亚急性衰老大鼠大脑皮质神经元超微结构改变的影响，并对其主要细胞器进行了计量分析。结果表明：模型组脂褐素数量较正常组增多(P<0.05)，线粒体则减少(P<0.05)同时还发现溶酶体、脂褐素大小形态不规则，线粒体肿胀、变性、嵴断裂、空泡样变，核膜内褶断裂，核仁边移等衰老改变，而加味温胆汤则使上述变性程度减轻，从而表明该方能延缓脑衰老，并提示该方可能具有稳定神经细胞生物膜系统作用。
中国图书分类号 R203，R285.5
, http://www.100md.com
本文采用D-半乳糖亚急性衰老模型为研究对象，从形态学角度观察了加味温胆汤对模型衰老大鼠大脑皮质神经元超微结构的改变，并对其主要细胞器进行了形态计量学分析，从而探讨该方延缓脑衰老的机理。
1 材料和方法
1.1 动物
SD系列大鼠30只，体重130～180g，雌雄各半，由湖南省医药工业研究所提供。
1.2 药物
加味温胆汤由法半夏9g，石菖蒲10g，郁金10g，陈皮9g，茯苓15g，枳壳10g，竹茹10g，炙甘草6g组成，药物购自本院杏林门诊部。按常规方法浸泡30分钟，煎煮3次，每次煎煮40分钟，合并滤液，过滤，浓缩至79ml，冰箱冷藏备用。
1.3 方法
, http://www.100md.com
参照文献[1]将SD系大鼠随机分为正常对照组(简称正常组)，D-半乳糖模型组(简称模型
组)，加味温胆汤组(简称中药组)。各组动物在实验前禁食12小时后进行实验，模型组皮下注射0.48% D-半乳糖48mg/kg，同时ig蒸馏水10ml/kg/d，中药组每天皮下注射D-半乳糖并口服加味温胆汤10ml/kg/d，正常组每天灌胃等量蒸馏水和皮下注射等量生理盐水。连续40天，于第41天处死大鼠，迅速取出大脑，取左侧中央回皮质1mm×3mm×3mm小块，经用3%戊二醛(0.1moL/L PBS pH 7.4缓冲液)固定2小时，1%锇酸后固定1小时，梯度丙酮脱水，Epon-812环氧树脂包埋，半薄切片机切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，日立H-600透射电镜观察神经元胞体主要细胞器的变化并进行计量分析。
2 结果
2.1 形态学观察
, http://www.100md.com
神经元胞体的超微形态表明：正常对照大鼠细胞器形态基本正常(附图1，2)，模型组神经元胞体内溶酶体、脂褐素大小和形态不规则，线粒体出现肿胀变性，嵴断裂和空泡样变；细胞核出现核膜内褶断裂和核仁边移；个别细胞还可见到内含条纹状结构的溶酶体(附图3，4)。中药组虽可见到核膜内褶、核仁边移及线粒体肿胀等现象，但程度较模型组明显减轻(附图5，6)。
附图 神经元胞体超微结构电镜图
1、2 神经元超微形态基本正常(×10，000)
3 核膜内褶、断裂，核仁移向核膜(×17，000)
4 神经元胞质内大小，形状不规则的溶酶体和脂褐素，线粒体肿胀、空泡变(×10，000)
, http://www.100md.com 5 神经元胞体，线粒体轻度肿胀(×10，000)
6 神经元胞体内见多个溶酶体、脂褐素、高尔基复合体，线粒体轻度肿胀(×10，000)
2.2 形态计量学分析
透射电镜下，每例样品观察10个神经元胞体截面，对其主要细胞器进行计量观察，结果如下表。
附表 各组神经元细胞器数目比较 (
±s) 组别(n)
脂褐素
线粒体
溶酶体
高尔基复合体
, 百拇医药
正常组(8)
1.05±0.94
7.95±2.11
4.15±2.03
1.95±1.85
模型组(7)
2.65±2.13※
5.40±2.09
6.00±2.96△
1.75±1.12
中药组(8)
, 百拇医药
1.80±1.24
7.00±2.13
3.15±1.46
1.10±0.85
注：与正常组比※P<0.05，与中药组比△P<0.05
结果表明：注射D-半乳糖后，模型组脂褐素明显多于正常组(P<0.05)，线粒体数较正常组减少(P<0.05)，而溶酶体数高于正常组但无统计学意义(P>0.05)；灌胃中药后，中药组溶酶体数量较模型组减少明显(P<0.05)，其余细胞器与模型组及正常组比较差异无显著意义(P>0.05)。
3 讨论
衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果[2]。D-半乳糖亚急性衰老模型是根据衰老的代谢紊乱学说[3]研制而成。既往有研究[1]表明D-半乳糖能提高体内自由基水平。线粒体是机体产生氧化物的场所，也是最易遭受氧化损害的细胞器，国外有人认为[4]线粒体也是细胞内自由基的主要来源之处。而衰老时线粒体DNA易受自由基损伤，损伤后的线粒体DNA缺乏修复能力[5]。因此，我们推测模型组线粒体数目减少及超微结构异常可能与自由基代谢引起的氧化损伤有关。一般认为，脂褐素是人体衰老的重要标志，脂褐素的产生也与体内的自由基损伤有关。如张熙[1]等用体外培养神经元的方法证明了自由基可使脂褐素形成和蓄积。此外，衰老时大脑皮质神经元另一重要变化是核膜内褶，核仁边移，本实验观察结果亦与之相符。至于溶酶体条纹状结构出现的机理，尚待进一步研究。
, 百拇医药
总之，超微形态结果表明，衰老时大脑皮质神经元变化表现以膜系统改变为主要特征。灌服加味温胆汤后，各神经元脂褐素含量、线粒体变性、核膜内褶、核仁边移等现象、程度均较模型组明显减轻，可能与加味温胆汤有稳定神经元细胞膜系统、保持神经元内环境稳定有关。
①湖南省卫生厅中医管理局资助项目 编号 96026
参考文献
[1] 张熙，李文彬，张炳烈.D-半乳糖亚急性中毒大鼠拟衰老生化改变.中国药理学与毒理学杂志，1990，4(4)：309，310
[2] Nohl H.Involement of free radials in ageing:a consequence or cause of senescence.British Medical Bulletin 1993,49(3):653
, http://www.100md.com
[3] 郑集.从代谢观点看衰老机制，中华老年医学杂志，1983，2(1)：52
[4] KowaldA.,Kirkwood T.B.L.Mitochondrial mutations,cellular instability and ageing;modelling the population dynamics of mitochonclria.Mutat Res.1993,295:93
[5] 曾昭惠，张宗玉.自由基对线粒体DNA的氧化损伤与衰老.生物化学与生物物理进展，1995，22(5)：430
(收稿日期 1998-12-18)
, 百拇医药
单位：皮明钧 文 彬 吴润秋 陈北阳 陈 力 刘 莺(湖南中医学院基础课部 长沙410007)
关键词：温胆汤；衰老；大脑皮质神经元；超微结构；大鼠
湖南中医学院学报/990105 提要 在电镜下观察了加味温胆汤对D-半乳糖亚急性衰老大鼠大脑皮质神经元超微结构改变的影响，并对其主要细胞器进行了计量分析。结果表明：模型组脂褐素数量较正常组增多(P<0.05)，线粒体则减少(P<0.05)同时还发现溶酶体、脂褐素大小形态不规则，线粒体肿胀、变性、嵴断裂、空泡样变，核膜内褶断裂，核仁边移等衰老改变，而加味温胆汤则使上述变性程度减轻，从而表明该方能延缓脑衰老，并提示该方可能具有稳定神经细胞生物膜系统作用。
中国图书分类号 R203，R285.5
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本文采用D-半乳糖亚急性衰老模型为研究对象，从形态学角度观察了加味温胆汤对模型衰老大鼠大脑皮质神经元超微结构的改变，并对其主要细胞器进行了形态计量学分析，从而探讨该方延缓脑衰老的机理。
1 材料和方法
1.1 动物
SD系列大鼠30只，体重130～180g，雌雄各半，由湖南省医药工业研究所提供。
1.2 药物
加味温胆汤由法半夏9g，石菖蒲10g，郁金10g，陈皮9g，茯苓15g，枳壳10g，竹茹10g，炙甘草6g组成，药物购自本院杏林门诊部。按常规方法浸泡30分钟，煎煮3次，每次煎煮40分钟，合并滤液，过滤，浓缩至79ml，冰箱冷藏备用。
1.3 方法
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参照文献[1]将SD系大鼠随机分为正常对照组(简称正常组)，D-半乳糖模型组(简称模型
组)，加味温胆汤组(简称中药组)。各组动物在实验前禁食12小时后进行实验，模型组皮下注射0.48% D-半乳糖48mg/kg，同时ig蒸馏水10ml/kg/d，中药组每天皮下注射D-半乳糖并口服加味温胆汤10ml/kg/d，正常组每天灌胃等量蒸馏水和皮下注射等量生理盐水。连续40天，于第41天处死大鼠，迅速取出大脑，取左侧中央回皮质1mm×3mm×3mm小块，经用3%戊二醛(0.1moL/L PBS pH 7.4缓冲液)固定2小时，1%锇酸后固定1小时，梯度丙酮脱水，Epon-812环氧树脂包埋，半薄切片机切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，日立H-600透射电镜观察神经元胞体主要细胞器的变化并进行计量分析。
2 结果
2.1 形态学观察
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神经元胞体的超微形态表明：正常对照大鼠细胞器形态基本正常(附图1，2)，模型组神经元胞体内溶酶体、脂褐素大小和形态不规则，线粒体出现肿胀变性，嵴断裂和空泡样变；细胞核出现核膜内褶断裂和核仁边移；个别细胞还可见到内含条纹状结构的溶酶体(附图3，4)。中药组虽可见到核膜内褶、核仁边移及线粒体肿胀等现象，但程度较模型组明显减轻(附图5，6)。
附图 神经元胞体超微结构电镜图
1、2 神经元超微形态基本正常(×10，000)
3 核膜内褶、断裂，核仁移向核膜(×17，000)
4 神经元胞质内大小，形状不规则的溶酶体和脂褐素，线粒体肿胀、空泡变(×10，000)
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6 神经元胞体内见多个溶酶体、脂褐素、高尔基复合体，线粒体轻度肿胀(×10，000)
2.2 形态计量学分析
透射电镜下，每例样品观察10个神经元胞体截面，对其主要细胞器进行计量观察，结果如下表。
附表 各组神经元细胞器数目比较 (
±s) 组别(n)脂褐素
线粒体
溶酶体
高尔基复合体
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正常组(8)
1.05±0.94
7.95±2.11
4.15±2.03
1.95±1.85
模型组(7)
2.65±2.13※
5.40±2.09
6.00±2.96△
1.75±1.12
中药组(8)
, 百拇医药
1.80±1.24
7.00±2.13
3.15±1.46
1.10±0.85
注：与正常组比※P<0.05，与中药组比△P<0.05
结果表明：注射D-半乳糖后，模型组脂褐素明显多于正常组(P<0.05)，线粒体数较正常组减少(P<0.05)，而溶酶体数高于正常组但无统计学意义(P>0.05)；灌胃中药后，中药组溶酶体数量较模型组减少明显(P<0.05)，其余细胞器与模型组及正常组比较差异无显著意义(P>0.05)。
3 讨论
衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果[2]。D-半乳糖亚急性衰老模型是根据衰老的代谢紊乱学说[3]研制而成。既往有研究[1]表明D-半乳糖能提高体内自由基水平。线粒体是机体产生氧化物的场所，也是最易遭受氧化损害的细胞器，国外有人认为[4]线粒体也是细胞内自由基的主要来源之处。而衰老时线粒体DNA易受自由基损伤，损伤后的线粒体DNA缺乏修复能力[5]。因此，我们推测模型组线粒体数目减少及超微结构异常可能与自由基代谢引起的氧化损伤有关。一般认为，脂褐素是人体衰老的重要标志，脂褐素的产生也与体内的自由基损伤有关。如张熙[1]等用体外培养神经元的方法证明了自由基可使脂褐素形成和蓄积。此外，衰老时大脑皮质神经元另一重要变化是核膜内褶，核仁边移，本实验观察结果亦与之相符。至于溶酶体条纹状结构出现的机理，尚待进一步研究。
, 百拇医药
总之，超微形态结果表明，衰老时大脑皮质神经元变化表现以膜系统改变为主要特征。灌服加味温胆汤后，各神经元脂褐素含量、线粒体变性、核膜内褶、核仁边移等现象、程度均较模型组明显减轻，可能与加味温胆汤有稳定神经元细胞膜系统、保持神经元内环境稳定有关。
①湖南省卫生厅中医管理局资助项目 编号 96026
参考文献
[1] 张熙，李文彬，张炳烈.D-半乳糖亚急性中毒大鼠拟衰老生化改变.中国药理学与毒理学杂志，1990，4(4)：309，310
[2] Nohl H.Involement of free radials in ageing:a consequence or cause of senescence.British Medical Bulletin 1993,49(3):653
, http://www.100md.com
[3] 郑集.从代谢观点看衰老机制，中华老年医学杂志，1983，2(1)：52
[4] KowaldA.,Kirkwood T.B.L.Mitochondrial mutations,cellular instability and ageing;modelling the population dynamics of mitochonclria.Mutat Res.1993,295:93
[5] 曾昭惠，张宗玉.自由基对线粒体DNA的氧化损伤与衰老.生物化学与生物物理进展，1995，22(5)：430
(收稿日期 1998-12-18)
, 百拇医药