改良二温式PCR法SM7微小卫星标记快速多态分析对多囊肾病家系的基因诊断*
作者：陈怡 俞康 徐玉兰
单位：陈怡 俞康 温州医学院附属第一医院血液科(325000)；徐玉兰 温州医学院附属第一医院肾内科
关键词：
温州医学院学报/990435 常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)是终末期肾衰的主要原因，发病率高达1/1000[1]。其基因突变定位在第16号染色体短臂1区3带的PKD1位点[2]，后来发现ADPKD存在遗传异质性，定位了PKD2、PKD3位点[3]。国际上常用的PKD1位点相邻的微小卫星体DNA SM7为遗传标记[4]。本研究采用改良二温式PCR扩增法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染色对10个ADPKD家系成员进行基因连锁分析，结果表明这是一种快速、简便、有效的ADPKDI基因诊断方法。介绍如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 染色体DNA分离纯化 取静脉血10ml，EDTA(1mg/ml)抗凝，分离白细胞，蛋白酶E水解后，高盐沉淀法提取DNA，用紫光分光光度计测定DNA浓度及纯度，DNA溶于TE溶液100μl(-20℃)保存备用，DNA的纯度A260/A280≥1.7。
1.2 PCR扩增
1.2.1 引物序列：
SM7：(TG)5’-ACATATGTAGTCTTCTGCAGG-3’
(CA)5’-ACAAGAGTGAATCTCTGACAG-3’
引物由上海复旦大学遗传研究所合成。
, 百拇医药 1.2.2 试剂：dATP，dGTP，dCTP，dTTP及TaqDNA多聚酶(附有缓冲液及MgCl2)均购自Promega公司。
1.2.3 PCR反应条件：取模板DNA(80～100ng)，加入引物6pmol,dNTP(每种200μmol/L)，TaqDNA多聚酶(一个单位)，MgCl2(1～4mmol/L)，扩增缓冲液加至总体积25μl，反应液上覆盖液状石蜡2滴，于美国PE公司生产DNA扩增仪上扩增，扩增温度98℃，10分钟预变性后，94℃ 1.5分钟，56℃ 2分钟，72℃ 1.5分钟，循环30次，最后72℃ 10分钟，扩增产物约100～150bp,4℃储藏待鉴定。
1.3 PCR产物鉴定及分析 取8μl扩增产物加载体缓冲液2μl，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压250V，电泳4～5小时(4℃)电泳结束后，按Budowle等方法凝胶Ag+染色，真空干燥后观察结果。
, http://www.100md.com
1.4 研究对象 来自我院ADPKD专家门诊共10个家系，共103个家庭成员，其中包括29个B超确诊的ADPKD患者。选用家系符合以下条件：①20岁以后发病的经B超确诊的双肾多囊的临床先证者；②每个家系至少有两个经B超确诊的患者(两代中每代至少1个或同代有两个以上)；③至少有1个正常成员；④发病符合常染色体显性遗传规律。
2 结果
利用上法对10个ADPKD家系成员进行了基因连锁分析。在103个家庭成员中除29个先证者外，又有9个成员通过ADPKD家系分析得以确诊为ADPKD症前患者。图1显示家系1的遗传关系，图2示家系1的ADPKD凝胶电泳图谱，附家系1基因连锁分析表：此家系的SM7等位片段共5个，从小到大为A1～A5，A5与病变基因连锁关系确切。此谱系中Ⅲ3(R17)携带A5等位片段，故其为PKD1基因携带者，应是症前患者。
, 百拇医药
附表 家系1基因连锁分析表 个体
Ⅱ1(R18)
Ⅱ2(R19)
Ⅱ3(R14)
Ⅲ1(R15)
Ⅲ2(R16)
Ⅲ3(R17)
基因型
A2A5
A1A3
, 百拇医药
A2A4
A2A5
A2A3
A2A5
图1 家系1遗传关系图
图2 家系1ADPKD凝胶电泳结果图
3 讨论
ADPKD是终末期肾衰的主要原因之一，迄今仍缺乏有效的治疗方法，及早对ADPKD家系中有发病风险的成员做出症前基因诊断，有利于尽早对携带致病基因而尚未出现症状的成员定期随访，实施医疗监护。
, http://www.100md.com
1990年Sarris[5]等采用PCR技术及变性梯度凝胶电泳方法，成功对一个ADPKD家系进行基因诊断，取代了RFLP方法，但仍较繁琐。1991年Harris等[6]分离到两个与ADPKDⅠ紧密连锁的微卫星DNA标记SM7和SM5，设计了相应的引物，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及EB染色的方法使ADPKD基因诊断更加简便、快速。目前发现SM7有11个等位片段，多态信息含量(PIC)为0.63，而SM5 PIC为0.19，因此，将SM7用于ADPKD家系的多态连锁分析中，获得满意结果，确定了SM7作为ADPKDⅠ的一个多态遗传性标记的价值。
但是经典的ADPKD多态性家系分析方法还是比较繁琐，且在家系普查的过程中耗时长，消耗较大。由于ADPKD多态分析无特定的致病基因条带，只能通过家系中的先证者进行分析，辨析哪些家系成员是ADPKD基因携带者，同时电泳结果必须清晰可靠。而传统PCR扩增后的非特异性条带较多，造成家系分析过程中的困难，而且容易出现误分析影响整个实验的结果。我们通过反复实验探索条件，通过减少引物量，降低退火温度，使退火和延伸合二为一，改良为二温式PCR。改良后引物使用量大为减少，节约费用，便于普查。尤其重要的是改良后使扩增条带更为清晰，非特异性条带大为减少，使家系分析更为方便可靠，避免误诊，同时也加快了实验速度。其次，我们运用聚丙烯凝胶—银染方法，使用DNA条带的分辨率增高，条带清晰，特异性增强，实验结果可以在凝胶上直接辨读，经干胶后结果可长期保存。
, http://www.100md.com
家系1Ⅲ2(R16)未携带A5等位片段，但不能完全排除症前患者，需考虑所选遗传标记与PKD1发生重组可能。同时，ADPKD存在遗传异质性和PKD1以外的基因位点，故需进一步用PKD2、PKD3位点相邻的遗传标记进行基因定位，才能作出基因诊断。因此本方法只能作为ADPKD的初步诊断，对部分发生重组的病人尚不能作出明确的诊断。
*本课题为浙江省教委科研资助项目
参考文献
1 刘玉春，张宏，钟宏琳等.成人型多囊肾病多器官损害205例临床分析.中华内科杂志，1995，34∶612
2 Readers ST,Breuning MH,Davies KE,et al.A highly ploymouphic DNA markers linked to adult polycystic kidney disease on chromosome 16.Nature,1985,317∶542
, http://www.100md.com
3 Daouet MC,Roynolds DM,Bichet DG,et al.Evidence for a third genetic locus for sutosomal dominant polycystic kidney disease.Genomics,1995,25∶733
4 Turco AE,Padovani EM,Chiaffoni GP,et al.Molccular genetic diagnosis of autosomal dominant polycystic kidney disease in a newborn with bilateral cystic kidneys detected prenatally and multiple skeletal malformations.J Med Genet,1993,30∶419
5 Harris PC,Tomas S,Ratcliffe PJ,et al.Rapid gene analysis of families with polycystic kidney disease l by means of a microsatellite marker.Lancet,1991,338∶1484
6 The intermational polycystic kindey disease consortium.Polycystic kindey disease:the complete structure of the PKD gene and its protein.Cell,1995,81∶289
(收稿：1999-05-12), http://www.100md.com
单位：陈怡 俞康 温州医学院附属第一医院血液科(325000)；徐玉兰 温州医学院附属第一医院肾内科
关键词：
温州医学院学报/990435 常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)是终末期肾衰的主要原因，发病率高达1/1000[1]。其基因突变定位在第16号染色体短臂1区3带的PKD1位点[2]，后来发现ADPKD存在遗传异质性，定位了PKD2、PKD3位点[3]。国际上常用的PKD1位点相邻的微小卫星体DNA SM7为遗传标记[4]。本研究采用改良二温式PCR扩增法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染色对10个ADPKD家系成员进行基因连锁分析，结果表明这是一种快速、简便、有效的ADPKDI基因诊断方法。介绍如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 染色体DNA分离纯化 取静脉血10ml，EDTA(1mg/ml)抗凝，分离白细胞，蛋白酶E水解后，高盐沉淀法提取DNA，用紫光分光光度计测定DNA浓度及纯度，DNA溶于TE溶液100μl(-20℃)保存备用，DNA的纯度A260/A280≥1.7。
1.2 PCR扩增
1.2.1 引物序列：
SM7：(TG)5’-ACATATGTAGTCTTCTGCAGG-3’
(CA)5’-ACAAGAGTGAATCTCTGACAG-3’
引物由上海复旦大学遗传研究所合成。
, 百拇医药 1.2.2 试剂：dATP，dGTP，dCTP，dTTP及TaqDNA多聚酶(附有缓冲液及MgCl2)均购自Promega公司。
1.2.3 PCR反应条件：取模板DNA(80～100ng)，加入引物6pmol,dNTP(每种200μmol/L)，TaqDNA多聚酶(一个单位)，MgCl2(1～4mmol/L)，扩增缓冲液加至总体积25μl，反应液上覆盖液状石蜡2滴，于美国PE公司生产DNA扩增仪上扩增，扩增温度98℃，10分钟预变性后，94℃ 1.5分钟，56℃ 2分钟，72℃ 1.5分钟，循环30次，最后72℃ 10分钟，扩增产物约100～150bp,4℃储藏待鉴定。
1.3 PCR产物鉴定及分析 取8μl扩增产物加载体缓冲液2μl，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压250V，电泳4～5小时(4℃)电泳结束后，按Budowle等方法凝胶Ag+染色，真空干燥后观察结果。
, http://www.100md.com
1.4 研究对象 来自我院ADPKD专家门诊共10个家系，共103个家庭成员，其中包括29个B超确诊的ADPKD患者。选用家系符合以下条件：①20岁以后发病的经B超确诊的双肾多囊的临床先证者；②每个家系至少有两个经B超确诊的患者(两代中每代至少1个或同代有两个以上)；③至少有1个正常成员；④发病符合常染色体显性遗传规律。
2 结果
利用上法对10个ADPKD家系成员进行了基因连锁分析。在103个家庭成员中除29个先证者外，又有9个成员通过ADPKD家系分析得以确诊为ADPKD症前患者。图1显示家系1的遗传关系，图2示家系1的ADPKD凝胶电泳图谱，附家系1基因连锁分析表：此家系的SM7等位片段共5个，从小到大为A1～A5，A5与病变基因连锁关系确切。此谱系中Ⅲ3(R17)携带A5等位片段，故其为PKD1基因携带者，应是症前患者。
, 百拇医药
附表 家系1基因连锁分析表 个体
Ⅱ1(R18)
Ⅱ2(R19)
Ⅱ3(R14)
Ⅲ1(R15)
Ⅲ2(R16)
Ⅲ3(R17)
基因型
A2A5
A1A3
, 百拇医药
A2A4
A2A5
A2A3
A2A5
图1 家系1遗传关系图
图2 家系1ADPKD凝胶电泳结果图
3 讨论
ADPKD是终末期肾衰的主要原因之一，迄今仍缺乏有效的治疗方法，及早对ADPKD家系中有发病风险的成员做出症前基因诊断，有利于尽早对携带致病基因而尚未出现症状的成员定期随访，实施医疗监护。
, http://www.100md.com
1990年Sarris[5]等采用PCR技术及变性梯度凝胶电泳方法，成功对一个ADPKD家系进行基因诊断，取代了RFLP方法，但仍较繁琐。1991年Harris等[6]分离到两个与ADPKDⅠ紧密连锁的微卫星DNA标记SM7和SM5，设计了相应的引物，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及EB染色的方法使ADPKD基因诊断更加简便、快速。目前发现SM7有11个等位片段，多态信息含量(PIC)为0.63，而SM5 PIC为0.19，因此，将SM7用于ADPKD家系的多态连锁分析中，获得满意结果，确定了SM7作为ADPKDⅠ的一个多态遗传性标记的价值。
但是经典的ADPKD多态性家系分析方法还是比较繁琐，且在家系普查的过程中耗时长，消耗较大。由于ADPKD多态分析无特定的致病基因条带，只能通过家系中的先证者进行分析，辨析哪些家系成员是ADPKD基因携带者，同时电泳结果必须清晰可靠。而传统PCR扩增后的非特异性条带较多，造成家系分析过程中的困难，而且容易出现误分析影响整个实验的结果。我们通过反复实验探索条件，通过减少引物量，降低退火温度，使退火和延伸合二为一，改良为二温式PCR。改良后引物使用量大为减少，节约费用，便于普查。尤其重要的是改良后使扩增条带更为清晰，非特异性条带大为减少，使家系分析更为方便可靠，避免误诊，同时也加快了实验速度。其次，我们运用聚丙烯凝胶—银染方法，使用DNA条带的分辨率增高，条带清晰，特异性增强，实验结果可以在凝胶上直接辨读，经干胶后结果可长期保存。
, http://www.100md.com
家系1Ⅲ2(R16)未携带A5等位片段，但不能完全排除症前患者，需考虑所选遗传标记与PKD1发生重组可能。同时，ADPKD存在遗传异质性和PKD1以外的基因位点，故需进一步用PKD2、PKD3位点相邻的遗传标记进行基因定位，才能作出基因诊断。因此本方法只能作为ADPKD的初步诊断，对部分发生重组的病人尚不能作出明确的诊断。
*本课题为浙江省教委科研资助项目
参考文献
1 刘玉春，张宏，钟宏琳等.成人型多囊肾病多器官损害205例临床分析.中华内科杂志，1995，34∶612
2 Readers ST,Breuning MH,Davies KE,et al.A highly ploymouphic DNA markers linked to adult polycystic kidney disease on chromosome 16.Nature,1985,317∶542
, http://www.100md.com
3 Daouet MC,Roynolds DM,Bichet DG,et al.Evidence for a third genetic locus for sutosomal dominant polycystic kidney disease.Genomics,1995,25∶733
4 Turco AE,Padovani EM,Chiaffoni GP,et al.Molccular genetic diagnosis of autosomal dominant polycystic kidney disease in a newborn with bilateral cystic kidneys detected prenatally and multiple skeletal malformations.J Med Genet,1993,30∶419
5 Harris PC,Tomas S,Ratcliffe PJ,et al.Rapid gene analysis of families with polycystic kidney disease l by means of a microsatellite marker.Lancet,1991,338∶1484
6 The intermational polycystic kindey disease consortium.Polycystic kindey disease:the complete structure of the PKD gene and its protein.Cell,1995,81∶289
(收稿：1999-05-12), http://www.100md.com