小儿咽喉乳头状瘤组织人乳头瘤病毒检测及型别分析
作者：陈波蓓 包其郁 张丽芳 张洪勤 项松洁 高金建
单位：陈波蓓 项松洁 高金建(温州医学院附属第二医院耳鼻喉科，325027)；包其郁 张洪勤(温州医学院分子生物学研究中心)；张丽芳(温州医学院微生物教研室)
关键词：乳头状瘤病毒；人乳头状瘤；PCR；核酸斑点杂交
温州医学院学报000116
摘 要：目的：探讨人乳头瘤病毒感染和小儿咽喉乳头状瘤的关系。方法：应用PCR和PCR产物斑点杂交技术检测35例小儿咽喉乳头瘤组织和10例小儿声带小结(对照组)组织HPV6、11、16、18、33五个型别的DNA。结果：乳头瘤组织HPV感染率为91.4%(32/35)，其中HPV6型检出率为54.2%(19/35)，HPV11型感染率为25.7%(9/35)，多重型别HPV6+11感染率为11.4%(4/35)；HPV16、18、33三型均为阴性，对照组各型均阴性。两组对比有高度显著性意义(P<0.001)。结论：小儿咽喉乳头瘤的发生与HPV感染密切相关，以HPV6型感染为主。
, 百拇医药
分类号：R730.231+.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2138-(2000)01-0039-02
Detection and typing of human papilloma viruses in juvenile pharynllaryngeal papillomatosis.
CHEN Bo-bei BAO Qi-yu ZHANG Li-fang
( The Second Hospital Affiliated of Wenzhou Medical Collge 325027)
Abstract：Objective：To study the relationship between infection of human papilloma virus and juvenile pharynlaryngeal papilloma. Methods：Polymerase chain reaction (PCR) and dot blot hybridization were used to detect HpV6、11、16、18、33DNA in 35 samples of pharynlaryngeal papilloma and 10 samples of .vocol nodule. Results：The positive rate of HPV in pharynlaryngeal laryngeed papilloma was 91.4% (30/35) . The positive rate of HPV6 and HPV11 were 54.2% (19/35) and 25.7% (9/35). The positive rate of multiple types of HPV6+11 was 11.4% (4/35).The positive rate of HPV16、18、33 were not significant. The positive rate of HPV in vocol nodule was not significant .Conclusion：It is suggested that infection with HPV,especially with HPV6 is closely associated with the development of juvenile pharynlaryngeal larynged papilloma in Wenzhou area.
, 百拇医药
Key words：human papillomaviruses; juvenile pharynlaryngeal popilloma; polynerase chain reaction; bot blot hybridization.▲
目前有报道认为小儿咽喉乳头状瘤的发病与HPV6、11型感染有关[1]。由于该病毒感染存在较明显的地区差异,鉴于本地区患儿组织中人乳头瘤病毒HPV-DNA检测及分型尚未见报道，我们采用聚合酶链反应(PCR)结合核酸斑点杂交技术对35例小儿咽喉乳头瘤组织进行HPV6、11、16、18、33五个型别的检测,现报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源 本院咽喉手术新鲜标本及门诊活检标本共35例，另取小儿声带小结手术标本10例作为对照组。全部病例均经病理学证实，标本取材后置入-70℃冰箱存放。
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1.2 标本处理 所取标本组织用磷酸盐缓冲液洗涤，组织匀浆后常规蛋白酶K消化，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于TE。
1.3 PCR扩增：HPV6引物(扩增280bp)序列为5′TAGTGGGCCTATGGCTCGTC3′和5′TCCATT-AGCCTCCACGGGTG3′, HPV11引物(扩增360bp)序列为5′ GGAATACATGCGCCATGTGG3′和5′CGAGCAGACGTCCGTCCTCG03′, HPV16引物(扩增152bp)序列为5′TGCTAGTGCTTATGCAGCAA3′和5′ATTTACTGCAACATTGGTAC3′, HPV18引物(扩增216bp)序列为5′AAGGATGCTGCA CCGGCTGA3′和5′CACGCACACGCTTGGCAGGT3′，HPV33引物(扩增455bp)序列为5′ATGATAGATGATGTAACGCC3′和5′GCACACTCCATGCGTATCAG3′， 由中国科学院上海细胞生物学
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研究室合成。试剂用量为每50μL反应体系中，含分型引物50μmo1/L，四种脱氧三磷酸核苷各200μmo1/L，TaqDNA聚合酶1.5单位，模板用量5μL，反应步骤为92℃30秒变性，55℃30秒复性，72℃60秒引物延伸，共进行35个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察结果并照相记录。
1.4 斑点杂交 地高辛(Dig)标记的寡核苷酸探针序列：HPV6为5′Dig-CATTAA-CGCAGGGCCGCCTGAAATTGTGCC3′，HPV11为5′Dig-CGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATA 3′，HPV16为5′Dig-GCA AACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCA3′，HPV18为5′Dig-TGGTTCAGGCTGGATT-GCGTCGCAAGCCCA3′，HPV33为5′Dig-CAAATGCAGGCACAGACTCTAGATGGCCAT 3′，由上海生物工程公司合成。试剂盒用贝灵曼公司(BO EHRINGER MANNHEIM)产品(DIG DNA La beling and Detection Kit，Cat.No. 1093657)，按说明书操作。主要步骤：①乳头瘤组织DNA提取物经PCR扩增为 产物经变性后点样于经10×SSC溶液浸湿的硝酸纤维膜上，80℃烘烤2小时；② 预杂交30分钟；③ 37℃杂交过夜(5×SSC，1%阻断试剂，0.1%十二烷基肌酸钠，0.02%SDS，50%甲酰胺，Dig标记的寡核苷酸探针10ng/ml)；④ 2×SSC，0.1%SDS洗膜2次，0.1×SSC, 0.1%SDS，68℃洗膜2次；⑤抗Dig抗体- 碱性磷酸复合物作用30分钟；⑥ BCIP和NBT显色，阳性标本可见紫色或蓝色斑点出现。
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1.5 数据统计 采用χ2检验。
2 结果
乳头瘤组35例中HPV阳性32例，总阳性率为91.4%，其中HPV6阳性19例(54.2%)、HPV11阳性9例(25.7%)、HPV6+11阳性4例(11.4%)。对照组10例全部阴性，两组差异有极显著意义(P<0.001)。
3 讨论
近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，有关幼年型咽喉乳头瘤的病因及其发病机理的研究取得了很大的进展。越来越多的研究表明，HPVs尤其是HPV6和HPV11是导致喉乳头瘤发病的主要致病因素[1]。但不同地区、不同种族HPV基因组型分布有差异，检测的方法也不同。Gabbatt[2]用PCR方法检测47例199个连续切片的HPV DNA，24例HPV11阳性，19例HPV6阳性，1例HPV11、6均阳性， HPV总阳性率为98%(183/199)。Abramson[3]报道小儿喉乳头瘤(JOP)患者病毒感染以HPV11为主，而生殖器乳头状瘤则以HPV6为主。国内对JOP感染的HPV型别分析，多采用HPV6/11，HPV16/18通用引物进行PCR检测，检出率在70.4%～93.7%[4]。本组总检出率为91.4%(32/35)，其中HPV6、11型的检出率分别为54.2%、25.7%，而HPV16、18、33型均为阴性，初步表明本地区的JOP组织以HPV6型感染为主。本组HPV多重型别检出率为11.4%，主要为HPV6、11型，提示在同一患儿中存在多重型别HPV感染。PCR扩增产物结合斑点杂交技术具有敏感性高、特异性强的优点。虽然核酸杂交法较为繁锁，但使PCR结果得到验证，故本组实验结果较为准确。
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本组患儿就诊年龄最小6个月，最大6岁，追问病史，其母亲在怀孕及分娩时产道均有湿疣病史，其中6例来我院检查时仍有湿疣存在，Quick[5]报道大约60%的患儿母亲妊娠或生产时有生殖器湿疣和乳头状瘤病。也有报告阳性率较低，可能和母亲无症状而有潜在HPV感染的有关。我们曾对温州地区女性尖锐湿疣组织进行HPV检测及分型[6]。结果本地区HPV阳性检出率为85.7%，并以HPV6型为高，占73.8%。其结果和本组结果相近。因此我们认为，HPV-DNA阳性的婴幼儿咽喉乳头状瘤可能就是发生于咽喉部的湿疣。
目前尚无特效方法治疗极易复发的JOP，无论外科治疗还是内科治疗都只能致力解除呼吸道梗阻和减轻疾病的复发。因此防止HPV感染尤为重要，预防HPV感染的重要途径是研制特异性疫苗用于易感人群，使机体获得免疫力[7]。但由于不同型HPV蛋白间的同源性不一致。因而对咽喉乳头瘤组织HPV进行型别分析，可为HPV疫苗的设计及使用提供理论依据。■
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基金项目：温州市科技发展基金课题(S990306A)。
作者简介：陈波蓓，(1962-)，女，浙江温岭人，副主任医师，主要从事人乳头瘤病毒与耳鼻喉疾病的相关性研究。
参考文献：
[1] 费声重，吴正虎.喉癌与人乳头状瘤病毒相关性研究的进展[J].中华耳鼻咽喉杂志，1995,30：115.
[2] Gabbott M，Cossart YE, Kan Ai，et al. Human papillomavirus and hoset Vari ab/es as predictors of cl incol course in patients with ju venile -onset recurrent respirtory papill omatosis[J]. J Clin Micobiol, 1997,35： 3098-3103.
, 百拇医药
[3] Abramson AL, Steinberg BM, Winkler B.Laryngeal papillomatosis： clinic al histopathologic and molecular studies[J]. Laryngoscope, 1987,97：678-685.
[4] 吴正虎，陈怀芳,张世俊.上呼吸道乳头状病HPV DNA的检测[J].耳鼻咽喉-头颈外科杂志,1996,3：141.
[5] Quick CA,Watts SL, Krzyzek RA,et al. Relation ship between codyloma and laryngeal papilloma,clinical and molecular Nirological evidence[J]. Ann Dtol Rhinol Laryngol, 1980,89：467 -471.
[6] 张丽芳，包其郁,郑飞云.温州地区尖锐湿疣组织人乳头瘤病毒检测[J].中国皮肤性病学杂志, 1998,12：71.
[7] Hines JE, Ghim SJ, Schlege R,et al. Prospects for avaccet against human papillomaviruse[J].Obstet Gynecol. 1995,86：858.
收稿日期：1999-10-18
改稿日期：2000-01-03, 百拇医药
单位：陈波蓓 项松洁 高金建(温州医学院附属第二医院耳鼻喉科，325027)；包其郁 张洪勤(温州医学院分子生物学研究中心)；张丽芳(温州医学院微生物教研室)
关键词：乳头状瘤病毒；人乳头状瘤；PCR；核酸斑点杂交
温州医学院学报000116
摘 要：目的：探讨人乳头瘤病毒感染和小儿咽喉乳头状瘤的关系。方法：应用PCR和PCR产物斑点杂交技术检测35例小儿咽喉乳头瘤组织和10例小儿声带小结(对照组)组织HPV6、11、16、18、33五个型别的DNA。结果：乳头瘤组织HPV感染率为91.4%(32/35)，其中HPV6型检出率为54.2%(19/35)，HPV11型感染率为25.7%(9/35)，多重型别HPV6+11感染率为11.4%(4/35)；HPV16、18、33三型均为阴性，对照组各型均阴性。两组对比有高度显著性意义(P<0.001)。结论：小儿咽喉乳头瘤的发生与HPV感染密切相关，以HPV6型感染为主。
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分类号：R730.231+.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2138-(2000)01-0039-02
Detection and typing of human papilloma viruses in juvenile pharynllaryngeal papillomatosis.
CHEN Bo-bei BAO Qi-yu ZHANG Li-fang
( The Second Hospital Affiliated of Wenzhou Medical Collge 325027)
Abstract：Objective：To study the relationship between infection of human papilloma virus and juvenile pharynlaryngeal papilloma. Methods：Polymerase chain reaction (PCR) and dot blot hybridization were used to detect HpV6、11、16、18、33DNA in 35 samples of pharynlaryngeal papilloma and 10 samples of .vocol nodule. Results：The positive rate of HPV in pharynlaryngeal laryngeed papilloma was 91.4% (30/35) . The positive rate of HPV6 and HPV11 were 54.2% (19/35) and 25.7% (9/35). The positive rate of multiple types of HPV6+11 was 11.4% (4/35).The positive rate of HPV16、18、33 were not significant. The positive rate of HPV in vocol nodule was not significant .Conclusion：It is suggested that infection with HPV,especially with HPV6 is closely associated with the development of juvenile pharynlaryngeal larynged papilloma in Wenzhou area.
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Key words：human papillomaviruses; juvenile pharynlaryngeal popilloma; polynerase chain reaction; bot blot hybridization.▲
目前有报道认为小儿咽喉乳头状瘤的发病与HPV6、11型感染有关[1]。由于该病毒感染存在较明显的地区差异,鉴于本地区患儿组织中人乳头瘤病毒HPV-DNA检测及分型尚未见报道，我们采用聚合酶链反应(PCR)结合核酸斑点杂交技术对35例小儿咽喉乳头瘤组织进行HPV6、11、16、18、33五个型别的检测,现报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源 本院咽喉手术新鲜标本及门诊活检标本共35例，另取小儿声带小结手术标本10例作为对照组。全部病例均经病理学证实，标本取材后置入-70℃冰箱存放。
, 百拇医药
1.2 标本处理 所取标本组织用磷酸盐缓冲液洗涤，组织匀浆后常规蛋白酶K消化，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于TE。
1.3 PCR扩增：HPV6引物(扩增280bp)序列为5′TAGTGGGCCTATGGCTCGTC3′和5′TCCATT-AGCCTCCACGGGTG3′, HPV11引物(扩增360bp)序列为5′ GGAATACATGCGCCATGTGG3′和5′CGAGCAGACGTCCGTCCTCG03′, HPV16引物(扩增152bp)序列为5′TGCTAGTGCTTATGCAGCAA3′和5′ATTTACTGCAACATTGGTAC3′, HPV18引物(扩增216bp)序列为5′AAGGATGCTGCA CCGGCTGA3′和5′CACGCACACGCTTGGCAGGT3′，HPV33引物(扩增455bp)序列为5′ATGATAGATGATGTAACGCC3′和5′GCACACTCCATGCGTATCAG3′， 由中国科学院上海细胞生物学
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研究室合成。试剂用量为每50μL反应体系中，含分型引物50μmo1/L，四种脱氧三磷酸核苷各200μmo1/L，TaqDNA聚合酶1.5单位，模板用量5μL，反应步骤为92℃30秒变性，55℃30秒复性，72℃60秒引物延伸，共进行35个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察结果并照相记录。
1.4 斑点杂交 地高辛(Dig)标记的寡核苷酸探针序列：HPV6为5′Dig-CATTAA-CGCAGGGCCGCCTGAAATTGTGCC3′，HPV11为5′Dig-CGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATA 3′，HPV16为5′Dig-GCA AACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCA3′，HPV18为5′Dig-TGGTTCAGGCTGGATT-GCGTCGCAAGCCCA3′，HPV33为5′Dig-CAAATGCAGGCACAGACTCTAGATGGCCAT 3′，由上海生物工程公司合成。试剂盒用贝灵曼公司(BO EHRINGER MANNHEIM)产品(DIG DNA La beling and Detection Kit，Cat.No. 1093657)，按说明书操作。主要步骤：①乳头瘤组织DNA提取物经PCR扩增为 产物经变性后点样于经10×SSC溶液浸湿的硝酸纤维膜上，80℃烘烤2小时；② 预杂交30分钟；③ 37℃杂交过夜(5×SSC，1%阻断试剂，0.1%十二烷基肌酸钠，0.02%SDS，50%甲酰胺，Dig标记的寡核苷酸探针10ng/ml)；④ 2×SSC，0.1%SDS洗膜2次，0.1×SSC, 0.1%SDS，68℃洗膜2次；⑤抗Dig抗体- 碱性磷酸复合物作用30分钟；⑥ BCIP和NBT显色，阳性标本可见紫色或蓝色斑点出现。
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1.5 数据统计 采用χ2检验。
2 结果
乳头瘤组35例中HPV阳性32例，总阳性率为91.4%，其中HPV6阳性19例(54.2%)、HPV11阳性9例(25.7%)、HPV6+11阳性4例(11.4%)。对照组10例全部阴性，两组差异有极显著意义(P<0.001)。
3 讨论
近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，有关幼年型咽喉乳头瘤的病因及其发病机理的研究取得了很大的进展。越来越多的研究表明，HPVs尤其是HPV6和HPV11是导致喉乳头瘤发病的主要致病因素[1]。但不同地区、不同种族HPV基因组型分布有差异，检测的方法也不同。Gabbatt[2]用PCR方法检测47例199个连续切片的HPV DNA，24例HPV11阳性，19例HPV6阳性，1例HPV11、6均阳性， HPV总阳性率为98%(183/199)。Abramson[3]报道小儿喉乳头瘤(JOP)患者病毒感染以HPV11为主，而生殖器乳头状瘤则以HPV6为主。国内对JOP感染的HPV型别分析，多采用HPV6/11，HPV16/18通用引物进行PCR检测，检出率在70.4%～93.7%[4]。本组总检出率为91.4%(32/35)，其中HPV6、11型的检出率分别为54.2%、25.7%，而HPV16、18、33型均为阴性，初步表明本地区的JOP组织以HPV6型感染为主。本组HPV多重型别检出率为11.4%，主要为HPV6、11型，提示在同一患儿中存在多重型别HPV感染。PCR扩增产物结合斑点杂交技术具有敏感性高、特异性强的优点。虽然核酸杂交法较为繁锁，但使PCR结果得到验证，故本组实验结果较为准确。
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本组患儿就诊年龄最小6个月，最大6岁，追问病史，其母亲在怀孕及分娩时产道均有湿疣病史，其中6例来我院检查时仍有湿疣存在，Quick[5]报道大约60%的患儿母亲妊娠或生产时有生殖器湿疣和乳头状瘤病。也有报告阳性率较低，可能和母亲无症状而有潜在HPV感染的有关。我们曾对温州地区女性尖锐湿疣组织进行HPV检测及分型[6]。结果本地区HPV阳性检出率为85.7%，并以HPV6型为高，占73.8%。其结果和本组结果相近。因此我们认为，HPV-DNA阳性的婴幼儿咽喉乳头状瘤可能就是发生于咽喉部的湿疣。
目前尚无特效方法治疗极易复发的JOP，无论外科治疗还是内科治疗都只能致力解除呼吸道梗阻和减轻疾病的复发。因此防止HPV感染尤为重要，预防HPV感染的重要途径是研制特异性疫苗用于易感人群，使机体获得免疫力[7]。但由于不同型HPV蛋白间的同源性不一致。因而对咽喉乳头瘤组织HPV进行型别分析，可为HPV疫苗的设计及使用提供理论依据。■
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基金项目：温州市科技发展基金课题(S990306A)。
作者简介：陈波蓓，(1962-)，女，浙江温岭人，副主任医师，主要从事人乳头瘤病毒与耳鼻喉疾病的相关性研究。
参考文献：
[1] 费声重，吴正虎.喉癌与人乳头状瘤病毒相关性研究的进展[J].中华耳鼻咽喉杂志，1995,30：115.
[2] Gabbott M，Cossart YE, Kan Ai，et al. Human papillomavirus and hoset Vari ab/es as predictors of cl incol course in patients with ju venile -onset recurrent respirtory papill omatosis[J]. J Clin Micobiol, 1997,35： 3098-3103.
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[3] Abramson AL, Steinberg BM, Winkler B.Laryngeal papillomatosis： clinic al histopathologic and molecular studies[J]. Laryngoscope, 1987,97：678-685.
[4] 吴正虎，陈怀芳,张世俊.上呼吸道乳头状病HPV DNA的检测[J].耳鼻咽喉-头颈外科杂志,1996,3：141.
[5] Quick CA,Watts SL, Krzyzek RA,et al. Relation ship between codyloma and laryngeal papilloma,clinical and molecular Nirological evidence[J]. Ann Dtol Rhinol Laryngol, 1980,89：467 -471.
[6] 张丽芳，包其郁,郑飞云.温州地区尖锐湿疣组织人乳头瘤病毒检测[J].中国皮肤性病学杂志, 1998,12：71.
[7] Hines JE, Ghim SJ, Schlege R,et al. Prospects for avaccet against human papillomaviruse[J].Obstet Gynecol. 1995,86：858.
收稿日期：1999-10-18
改稿日期：2000-01-03, 百拇医药