碱性成纤维细胞生长因子对大鼠血管球囊成形术后基质金属蛋白酶表达的影响*
作者：吴永全△ 汪丽蕙 胡大一 王娟玲 张晓菲 唐朝枢
单位：吴永全△ 汪丽蕙 张晓菲 唐朝枢 北京医科大学第一医院心内科，北京 100034；胡大一：北京红十字朝阳医院心脏中心；王娟玲：潍坊市人民医院
关键词：血管成形术；气囊；再狭窄☆；金属蛋白酶类；代谢；成纤维细胞生长因子；碱性；药理学；细胞外基质
北京医科大学学报990110 摘 要 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对基质金属蛋白酶表达的影响及其在球囊术后再狭窄中的作用。方法：24只雄性Wistar大鼠分成对照组、球囊损伤组(14 d)及实验组。正常组不做处理；球囊损伤组行单纯球囊拉伤，术后14 d取材；实验组大鼠胸主动脉球囊成形，术后即刻、3、6、9 d分别尾静脉注射10、5、3、2 μg 碱性成纤维细胞生长因子，14 d处死取材，Northern杂交观察基质金属蛋白酶1、2及9的mRNA的改变。结果：正常对照组，基质金属蛋白酶1、2及9均无明显表达。球囊损伤组，只有基质金属蛋白酶9有较少量表达；实验组基质金属蛋白酶1明显表达，基质金属蛋白酶9表达较球囊损伤组升高，基质金属蛋白酶2仍无明显表达。结论：碱性成纤维细胞生长因子能选择性促进成形术后基质金属蛋白酶的表达，可能在调节细胞外基质的降解、成形术后重塑中起作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R654.3-332
Expression of matrix metalloproteinases mRNA induced by basic fibroblastgrowth factor in the rat artery after balloon angioplasty
WU Yong-Quan#， WANG Li-Hui， HU Da-Yi， WANG Juan-Ling， ZHANG Xiao-Fei， TANG Chao-Shu
(#Department of Cardiology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Balloon, angioplasty Restenosis☆ Metalloproteinases/metab Fibroblast growth factor, basic/pharmacol Extracellular matrix
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on matrix metalloproteinases (MMPs) and restenosis after PTCA. Methods: bFGF was injected through the tail vein at once (10 μg), day 3(5 μg), day 6(3 μg), day 9(2 μg) after balloon injury in the thoracic aorta of rats. The rats were killed and vessels were harvested after two weeks. Northern blot was used to investigate the expression of MMP1, MMP2 and MMP9 mRNA in the thoracic aorta. Results: No MMPs mRNA expression was observed in the normal artery. Expression of MMP9 mRNA was detected two weeks after balloon angioplasty without expression of MMP1, MMP2 mRNA. Significant expression of MMP1 was detected and MMP9 increased much in the rats given bFGF. Conclusion: bFGF can induce expression of MMPs mRNA selectively after balloon angioplasty. It may play a very important role in the degradation of extracellular matrix and remolding after angioplasty.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:35-37)
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族Zn2+及Ca2+依赖的酶家族,对细胞外基质(extracellular matrix, ECM)有特异的降解作用,目前已发现13种,命名为MMP1、MMP2等。MMP1又名胶原酶，对胶原成份如Ⅰ、Ⅲ型胶原有较强的降解作用，能特异地把它们降解成小片段；MMP1、MMP9又名明胶酶A、B，对细胞外基质有广泛作用，能特异降解基膜成份：如纤连蛋白、层粘蛋白、elastin等[1]。细胞外基质在血管成形术后再狭窄过程中起作用，是新生内膜的重要成份及血管重塑的重要因素。MMPs通过降解细胞外基质参与血管再狭窄的过程[1]。目前对MMPs的调节因素了解还不够，basic fibroblast growth factor (bFGF)作为一种有丝分裂素，在平滑肌细胞增殖、迁移及细胞外基质代谢中起作用，但对MMPs的作用还不清楚。本研究在球囊成形模型上，观察bFGF对MMPs的mRNA表达的调节作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
含MMP1、MMP2、MMP9片段的蓝斑质粒由美国华盛顿大学医学院皮肤科Marmer BL教授惠赠，随机引物标记试剂盒为Promega公司产品，Hybond尼龙膜为美国DuPont公司产品，α-P32dCTP为亚辉公司产品，bFGF由唐朝枢教授提供，其它生化试剂购自Sigma公司。
1.2 动物
24只雄性Wistar大鼠，重350 g左右，购自北京医科大学实验动物部。
1.3 动物模型的制备
24只大鼠随机分成3组(n=8)，对照组、球囊损伤组(14d组)、bFGF实验组。对照组不做处理。另两组分别用50 g.L-1戊巴比妥钠0.3 ml腹腔麻醉，常规颈部消毒，剪开皮肤，钝性分离左颈总动脉，用改良的2F Forgarty球囊导管从左颈总动脉插入胸主动脉至膈肌处，以0.5～1.0 ml生理盐水充盈球囊至直径0.5～0.7cm，回拉球囊，反复9次，拔出球囊，缝合伤口，普通喂养。bFGF组于术后即刻、3、6、9d分别从尾静脉注射10、5、3、2μgbFGF。两组均于术后第14天处死取材，快速液氮冻存备用。
, 百拇医药
1.4 探针的制备
质粒的转染、小提鉴定、大提质粒、纯化均参考《分子克隆》的方法[2]。分别以EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ酶切获得1.0 kb MMP1、1.1 kb MMP2、1.8 kb MMP9的探针。
1.5 RNA提取及Northern blot
血管在液氮里研成粉末，然后用异硫氰酸胍法提取血管总RNA[2]，所提取RNA经过质量鉴定，测吸光度(A)估计RNA浓度，甲醛变性电泳、转至尼龙膜上。用放射性同位素α-P32dCTP标记MMP1、MMP2、MMP9及18 S探针，固定在尼龙膜上的RNA先与18 S杂交，洗膜处理后，依次与MMP1、MMP2、MMP9杂交[3]。杂交结果经IBAS 2000分析仪对X光片上的每个杂交结果进行辉度分析，测其A值，结果表示为特异杂交探针的杂交信号的A值与18 S探针杂交信号的A值之比。
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2 结果
图1显示，正常大鼠(C组)MMP1、MMP2、MMP9无阳性杂交带，无明显表达。球囊损伤后第14 d(14 d组)MMP1、MMP2仍无表达，MMP9有较少量表达。术后尾静脉注射bFGF(bFGF组)，MMP1有较强表达。MMP9的表达较14 d组明显升高，MMP2仍无明显表达(未示照片)。
C，control； 14 d，balloon-injuried group； bFGF，bFGF given group.
图1 bFGF对MMP1、MMP9 mRNA表达的影响
Figure 1 The effect of bFGF on the expression of MMP1，MMP9 in the rat thoracic aorta after balloon injury
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3 讨论
MMPs在组织的分化、发育、细胞迁移及损伤后组织重塑过程中起重要的作用。本实验室以前实验中，通过原位杂交方法发现，球囊损伤可以诱发MMP2、MMP9于术后第3天开始表达，MMP2 14 d后无表达，MMP9持续到14 d仍有少量表达。损伤不能诱导MMP1的表达，它们可能在促进平滑肌细胞的迁移、内膜形成中起作用(另文发表)。因此，合理地调节MMPs的作用，在防止再狭窄中有极为重要的作用。bFGF作为一种有丝分裂素、除促进细胞增殖外，还能调节细胞外基质代谢，促进胶原Ⅰ、Ⅲ的降解[4]。但作用机制还不清楚。本实验发现bFGF能选择性地促进MMPs表达，对MMP1有较强的诱表达作用，可能与bFGF的促进胶原代谢作用有关，但bFGF为什么能促进MMP1、MMP9表达，而对MMP2作用不明显，原因不清。Pickering[5]发现bFGF能诱导体外培养平滑肌细胞的表达，与本实验相吻合，但不能诱导MMP9的表达，与本实验不符。可能缘于在体和离体细胞的实验条件不一样。本实验发现bFGF能促进MMPs表达，在成形术后的细胞外基质代谢过程中起着重要作用，是调节细胞外基质及再狭窄过程的重要物质。
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* 高等学校博士学科点专项科研基金(96024014)资助课题；
△ 现在北京红十字朝阳医院心脏中心；
☆ 自由词。
参考文献
1 吴永全，汪丽蕙.基质金属蛋白酶与血管成形术后再狭窄.中国介入心脏病杂志， 1997，5(2)：92-94
2 J.萨姆布鲁克.《分子克隆》实验指南.第2版.金冬雁等译.北京：北京科技出版社，1995.16-392
3 Chomezynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-159
, 百拇医药
4 Majors A, Ehrhart LA. Basic fibroblast growth factor in the extracellular matrix suppress collagen synthesis and type Ⅲ procollagen mRNA levels in arterial smooth muscle cell cultures. Arteroscler and Thromb, 1993,13:680-686
5 Pickering JG, Ford CM. Coordinated effects of fibroblast growth factor-2 on expression of fibrillar collagens, matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases by human vascular smooth muscle cells. Arteroscler Thomb Vasc Biol, 1997,17:475-482
(1998-02-24收稿), 百拇医药
单位：吴永全△ 汪丽蕙 张晓菲 唐朝枢 北京医科大学第一医院心内科，北京 100034；胡大一：北京红十字朝阳医院心脏中心；王娟玲：潍坊市人民医院
关键词：血管成形术；气囊；再狭窄☆；金属蛋白酶类；代谢；成纤维细胞生长因子；碱性；药理学；细胞外基质
北京医科大学学报990110 摘 要 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对基质金属蛋白酶表达的影响及其在球囊术后再狭窄中的作用。方法：24只雄性Wistar大鼠分成对照组、球囊损伤组(14 d)及实验组。正常组不做处理；球囊损伤组行单纯球囊拉伤，术后14 d取材；实验组大鼠胸主动脉球囊成形，术后即刻、3、6、9 d分别尾静脉注射10、5、3、2 μg 碱性成纤维细胞生长因子，14 d处死取材，Northern杂交观察基质金属蛋白酶1、2及9的mRNA的改变。结果：正常对照组，基质金属蛋白酶1、2及9均无明显表达。球囊损伤组，只有基质金属蛋白酶9有较少量表达；实验组基质金属蛋白酶1明显表达，基质金属蛋白酶9表达较球囊损伤组升高，基质金属蛋白酶2仍无明显表达。结论：碱性成纤维细胞生长因子能选择性促进成形术后基质金属蛋白酶的表达，可能在调节细胞外基质的降解、成形术后重塑中起作用。
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中国图书资料分类法分类号 R654.3-332
Expression of matrix metalloproteinases mRNA induced by basic fibroblastgrowth factor in the rat artery after balloon angioplasty
WU Yong-Quan#， WANG Li-Hui， HU Da-Yi， WANG Juan-Ling， ZHANG Xiao-Fei， TANG Chao-Shu
(#Department of Cardiology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Balloon, angioplasty Restenosis☆ Metalloproteinases/metab Fibroblast growth factor, basic/pharmacol Extracellular matrix
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ABSTRACT Objective: To investigate the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on matrix metalloproteinases (MMPs) and restenosis after PTCA. Methods: bFGF was injected through the tail vein at once (10 μg), day 3(5 μg), day 6(3 μg), day 9(2 μg) after balloon injury in the thoracic aorta of rats. The rats were killed and vessels were harvested after two weeks. Northern blot was used to investigate the expression of MMP1, MMP2 and MMP9 mRNA in the thoracic aorta. Results: No MMPs mRNA expression was observed in the normal artery. Expression of MMP9 mRNA was detected two weeks after balloon angioplasty without expression of MMP1, MMP2 mRNA. Significant expression of MMP1 was detected and MMP9 increased much in the rats given bFGF. Conclusion: bFGF can induce expression of MMPs mRNA selectively after balloon angioplasty. It may play a very important role in the degradation of extracellular matrix and remolding after angioplasty.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:35-37)
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族Zn2+及Ca2+依赖的酶家族,对细胞外基质(extracellular matrix, ECM)有特异的降解作用,目前已发现13种,命名为MMP1、MMP2等。MMP1又名胶原酶，对胶原成份如Ⅰ、Ⅲ型胶原有较强的降解作用，能特异地把它们降解成小片段；MMP1、MMP9又名明胶酶A、B，对细胞外基质有广泛作用，能特异降解基膜成份：如纤连蛋白、层粘蛋白、elastin等[1]。细胞外基质在血管成形术后再狭窄过程中起作用，是新生内膜的重要成份及血管重塑的重要因素。MMPs通过降解细胞外基质参与血管再狭窄的过程[1]。目前对MMPs的调节因素了解还不够，basic fibroblast growth factor (bFGF)作为一种有丝分裂素，在平滑肌细胞增殖、迁移及细胞外基质代谢中起作用，但对MMPs的作用还不清楚。本研究在球囊成形模型上，观察bFGF对MMPs的mRNA表达的调节作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
含MMP1、MMP2、MMP9片段的蓝斑质粒由美国华盛顿大学医学院皮肤科Marmer BL教授惠赠，随机引物标记试剂盒为Promega公司产品，Hybond尼龙膜为美国DuPont公司产品，α-P32dCTP为亚辉公司产品，bFGF由唐朝枢教授提供，其它生化试剂购自Sigma公司。
1.2 动物
24只雄性Wistar大鼠，重350 g左右，购自北京医科大学实验动物部。
1.3 动物模型的制备
24只大鼠随机分成3组(n=8)，对照组、球囊损伤组(14d组)、bFGF实验组。对照组不做处理。另两组分别用50 g.L-1戊巴比妥钠0.3 ml腹腔麻醉，常规颈部消毒，剪开皮肤，钝性分离左颈总动脉，用改良的2F Forgarty球囊导管从左颈总动脉插入胸主动脉至膈肌处，以0.5～1.0 ml生理盐水充盈球囊至直径0.5～0.7cm，回拉球囊，反复9次，拔出球囊，缝合伤口，普通喂养。bFGF组于术后即刻、3、6、9d分别从尾静脉注射10、5、3、2μgbFGF。两组均于术后第14天处死取材，快速液氮冻存备用。
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1.4 探针的制备
质粒的转染、小提鉴定、大提质粒、纯化均参考《分子克隆》的方法[2]。分别以EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ酶切获得1.0 kb MMP1、1.1 kb MMP2、1.8 kb MMP9的探针。
1.5 RNA提取及Northern blot
血管在液氮里研成粉末，然后用异硫氰酸胍法提取血管总RNA[2]，所提取RNA经过质量鉴定，测吸光度(A)估计RNA浓度，甲醛变性电泳、转至尼龙膜上。用放射性同位素α-P32dCTP标记MMP1、MMP2、MMP9及18 S探针，固定在尼龙膜上的RNA先与18 S杂交，洗膜处理后，依次与MMP1、MMP2、MMP9杂交[3]。杂交结果经IBAS 2000分析仪对X光片上的每个杂交结果进行辉度分析，测其A值，结果表示为特异杂交探针的杂交信号的A值与18 S探针杂交信号的A值之比。
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2 结果
图1显示，正常大鼠(C组)MMP1、MMP2、MMP9无阳性杂交带，无明显表达。球囊损伤后第14 d(14 d组)MMP1、MMP2仍无表达，MMP9有较少量表达。术后尾静脉注射bFGF(bFGF组)，MMP1有较强表达。MMP9的表达较14 d组明显升高，MMP2仍无明显表达(未示照片)。
C，control； 14 d，balloon-injuried group； bFGF，bFGF given group.
图1 bFGF对MMP1、MMP9 mRNA表达的影响
Figure 1 The effect of bFGF on the expression of MMP1，MMP9 in the rat thoracic aorta after balloon injury
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3 讨论
MMPs在组织的分化、发育、细胞迁移及损伤后组织重塑过程中起重要的作用。本实验室以前实验中，通过原位杂交方法发现，球囊损伤可以诱发MMP2、MMP9于术后第3天开始表达，MMP2 14 d后无表达，MMP9持续到14 d仍有少量表达。损伤不能诱导MMP1的表达，它们可能在促进平滑肌细胞的迁移、内膜形成中起作用(另文发表)。因此，合理地调节MMPs的作用，在防止再狭窄中有极为重要的作用。bFGF作为一种有丝分裂素、除促进细胞增殖外，还能调节细胞外基质代谢，促进胶原Ⅰ、Ⅲ的降解[4]。但作用机制还不清楚。本实验发现bFGF能选择性地促进MMPs表达，对MMP1有较强的诱表达作用，可能与bFGF的促进胶原代谢作用有关，但bFGF为什么能促进MMP1、MMP9表达，而对MMP2作用不明显，原因不清。Pickering[5]发现bFGF能诱导体外培养平滑肌细胞的表达，与本实验相吻合，但不能诱导MMP9的表达，与本实验不符。可能缘于在体和离体细胞的实验条件不一样。本实验发现bFGF能促进MMPs表达，在成形术后的细胞外基质代谢过程中起着重要作用，是调节细胞外基质及再狭窄过程的重要物质。
, http://www.100md.com
* 高等学校博士学科点专项科研基金(96024014)资助课题；
△ 现在北京红十字朝阳医院心脏中心；
☆ 自由词。
参考文献
1 吴永全，汪丽蕙.基质金属蛋白酶与血管成形术后再狭窄.中国介入心脏病杂志， 1997，5(2)：92-94
2 J.萨姆布鲁克.《分子克隆》实验指南.第2版.金冬雁等译.北京：北京科技出版社，1995.16-392
3 Chomezynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-159
, 百拇医药
4 Majors A, Ehrhart LA. Basic fibroblast growth factor in the extracellular matrix suppress collagen synthesis and type Ⅲ procollagen mRNA levels in arterial smooth muscle cell cultures. Arteroscler and Thromb, 1993,13:680-686
5 Pickering JG, Ford CM. Coordinated effects of fibroblast growth factor-2 on expression of fibrillar collagens, matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases by human vascular smooth muscle cells. Arteroscler Thomb Vasc Biol, 1997,17:475-482
(1998-02-24收稿), 百拇医药