肾小管和内皮素与肾间质纤维化的关系
作者：李 玲 邹万忠
单位：北京医科大学病理学系，北京 100083
关键词：肾小管；分泌；成纤维细胞；生长和发育；内皮缩血管肽类；代谢
北京医科大学学报990107 摘 要 目的：研究肾小管和内皮素与肾间质纤维化的关系。方法：应用肾小管上皮细胞及肾成纤维细胞的体外培养，通过逆转录-多聚酶链反应，免疫组织化学染色，放射免疫测定及双重免疫组织化学染色技术，并测定3H-TdR掺入率，观察肾小管损伤时产生的内皮素-1(endothelin-1 ET-1)与肾成纤维细胞增殖的关系。结果：肾小管上皮细胞既有ET-1 mRNA的表达，又有ET的两种受体(ETA-R mRNA和ETB-R mRNA)的表达，还有ET-1的蛋白合成及分泌。且肾小管损伤及再生过程中，ET-1表达增加。对体外培养的大鼠肾成纤维细胞加入ET-1，3H-TdR掺入率较对照组明显增高。并证明肾成纤维细胞有ET-R mRNA的表达。结论：损伤及再生的肾小管上皮细胞较正常时合成和分泌更多的ET-1，ET-1通过ET-R的作用，促使肾成纤维细胞的增殖，从而促进肾间质纤维化。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R692.33
The relationship between renal tubular epithelial cell,endothelin and renal interstitial fibrosis
LI Ling， ZOU Wan-Zhong
(Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Renal tubule/secret Endothelins/metab Fibroblasts/growth
ABSTRACT Objective: To study the relationship between injured renal tubular epithelial cell, endothelin(ET), and renal tubulointerstitial fibrosis(TIF). Methods: Renal tubular epithelial cell and renal fibroblast were cultured in vitro, and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR), immunohistochemical stain(IMC), radioimmuno-assay (RIA) and double IMC were used, and the ratio of 3H-TdR incorporation was measured to observe the relationship between ET-1 and proliferation of renal fibroblast. Results: There existed the expression of ET-1 mRNA and its receptors (ETA-R mRNA and ETB-R mRNA), and also the synthesis of ET-1 peptide in renal tubular epithelial cell. In the course of damage and regeneration, renal tubular epithelial cell produced more ET-1. The ratio of 3H-TdR incorporation of renal fibroblast was higher than that of control group when ET-1 to was added this cultured cell. There existed the expression of ETB-R mRNA in renal fibroblast. Conclusion: Injured and regenerated renal tubular epithelial cell produced and secreted more ET-1 than in normal kidney. ET-1 contributed to interstitial fibrosis by promoting the proliferation of renal fibroblast through ET-R.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:23-26)
多种慢性肾功能衰竭的肾脏疾病都与肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)密切相关[1]，虽然肾间质纤维化的发生机制尚不完全清楚，但近年研究发现，细胞因子在其中起着重要的介导作用[2]。内皮素(endothelin, ET)是重要的缩血管物质[3]，它有3种异构体：ET-1、ET-2、ET-3，其中ET-1的缩血管作用最强烈而持久，且对多种细胞有促增殖作用[4]。多种肾脏疾病患者血、尿及肾组织中ET-1水平明显高于正常[5]，说明ET-1在肾脏疾病中有重要作用。鉴于肾小管和肾间质在解剖和功能上的密切关系，本文利用肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞的体外培养，通过分子生物学的方法探讨肾小管和ET-1 与TIF的关系。
1 材料与方法
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1.1 肾小管上皮细胞的培养
取雄性Wister大鼠4只，体重140～150g，无菌取肾皮质在80钼网筛上研磨，收集140钼网筛上的肾小管，胶原酶(0.5g.L-1, Sigma公司)37℃消化20min，种入含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养液培养，细胞铺满后经组织化学、免疫组化及电镜观察鉴定为肾小管上皮细胞。
1.2 肾成纤维细胞的培养
取雄性Wister大鼠2只，体重180～200g，无菌取肾髓质，剪碎，胰酶37℃消化2～3min，种入含体积分数为20%小牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)培养，细胞铺满后经组织化学、免疫组化电镜观察及更换替代培养液(其中不含成纤维细胞必需的右旋缬氨酸，使成纤维细胞不能存活)鉴定为肾间质成纤维细胞。
, 百拇医药
1.3 庆大霉素致肾小管损伤模型建立
给Wister大鼠腹腔注射庆大霉素每天每千克体重400 mg,连续4 d，造成肾小管损伤，分别于第1、3、5、7、9、12、15天观察肾损伤形态，可见第1、3天皮质近曲小管灶状坏死，第5天皮质近曲小管弥漫坏死，第7天肾小管上皮再生，第9天再生明显，第12、15天几乎看不见坏死小管，肾小管完全再生。对照组肾小管未见明显病变。
1.4 肾小管上皮细胞与内皮素(ET-1)及内皮素受体(ET-R)的关系
1.4.1 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测ET-1、ET-R在肾小管上皮细胞的基因表达 ET-1及ET-R的引物设计与合成是根据ET-1及其两种受体亚型ETA-R和ETB-R的核苷酸序列，设计并由本系合成了寡核苷酸引物，其上下游引物序列为:
, 百拇医药
ET-1:
5′-CGT TGC TCC TGC TCC TCC TTG ATG-3′
5′-AAG ATC CCG GCC AGC ATG GAG AGC G-3′(154-699nt)
ETA-R：
5′-TAA TCT AAG CAG CCA CGA CCA CGT GGA GGA-3′
5′-AGA AAG CCA CTG CTC TGT ACC TGT-3′(84-568nt)
ETB-R：
5′-GTG TTC GTG CTA GGC ATC ATC G-3′
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5′-AAG GCA GCG ATG GCT AGC G-3′(328-872nt)
经RT-PCR应分别扩增出cDNA片段，长度分别为546bp(ET-1)、485bp(ETA-R )、545bp(ETB-R)。RT-PCR所用试剂均为美国Promega公司产品。
逆转录(reverse transcription， RT)：各取1 μg细胞总RNA,顺序加入一定量的下游引物及必需试剂，于42 ℃反应60 min，95 ℃ 5 min终止反应。
多聚酶链反应(polymerase chain reaction， PCR)：取逆转录产物4 μl依次加入上、下游引物及相应试剂后，进行变性(94 ℃, 40 s)，退火60 s(ET-1 55 ℃,ETA-R和ETB-R均为52 ℃)及延伸(72 ℃， 30 s)，循环35个周期。
, 百拇医药
1.4.2 原位杂交检测ET-1 mRNA在肾小管上皮细胞的表达 对肾小管上皮细胞爬片进行ET-1的原位杂交，BCIP+NBT显色。探针用地高辛标记，特异引物引导下的PCR方法制成，杂交液中不加探针为阴性对照。
1.4.3 ET-1蛋白水平检测 无血清培养细胞24 h后，用放射免疫测定法(RIA)检测培养上清中ET-1的活度。以ET-1兔抗人多克隆抗体(美国Peninsula 公司)为一抗，用SP法对肾小管上皮细胞的爬片及涂片进行免疫组化染色，不加一抗为阴性对照。
1.5 肾小管损伤与ET-1的关系
对庆大霉素造成肾小管损伤模型组及正常Wister大鼠肾组织分别进行ET-1及增殖细胞核抗原(proliferating cellular nucleo antigen, PCNA鼠抗人单抗DAKO公司)的双重免疫组化染色，三抗分别为标有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的链菌素抗生物素蛋白，ET-1用DAB 显色，PCNA用BCIP+NBT显色，不加一抗为阴性对照，用以探讨ET的产生与肾小管损伤的关系。
, 百拇医药
1.6 3H-TdR掺入法观察ET-1对肾成纤维细胞的促增殖作用
将第一代成纤维细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8 h后换体积分数为含1%的小牛血清的DMEM继续培养20 h后，加入ET-1(美国Peninsula公司)，使终质量浓度分别为40 μg*L-1和5 μg*L-1，于第8、24、32、48小时收集细胞，每个时间点每个质量浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，收集细胞前7 h每孔加入3H-TdR 1.85×104 Bq。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(1 g*L-1 2,5二苯基口 恶唑,0.5 g*L-1对苯撑苯口 恶唑)Beckman液闪仪检测。
1.7 肾间质纤维细胞与ET-R的关系
, 百拇医药
取第一代细胞总RNA 1 μg,按上述步骤进行RT-PCR，退火条件为ET-R 62 ℃、50 s。
2 结果
2.1 肾小管上皮细胞有合成和分泌ET-1的功能
用RIA法测得细胞培养上清中ET质量浓度分别为17.42 ng*L-1。以细胞总RNA为模板，在ET-1特异引物引导下，经RT-PCR扩增后，扩增产物为546 bp(图1)。对肾小管上皮细胞爬片进行地高辛标记的ET-1 mRNA原位杂交，结果细胞胞浆中显示明显紫蓝色阳性信号(图2)。以ET-1多克隆抗体为一抗，对培养的肾小管上皮细胞的爬片及涂片进行免疫组织化学染色，结果为强阳性(图3)。ET-1与PCNA双重免疫组化染色结果表明：实验第7、9、12天PCNA阳性的肾小管上皮细胞(即损伤及再生的肾小管上皮细胞)ET-1表达强阳性(图4)，而正常及实验第1、3、5天的大鼠肾小管上皮细胞ET-1呈弱阳性。上述结果说明肾小管上皮细胞有ET-1 mRNA的表达，又有ET-1的蛋白合成与分泌，而且，损伤及再生的肾小管上皮细胞ET-1的合成明显增加。
, 百拇医药
1，ET-1； 2，ETA-R； 3，ETB-R； 4，100 bp marker
图1 肾小管上皮细胞的ET-1及ET-R(RT-PCR)
Figure 1 ET-1 and ET-R in tubular epithelial cells (RT-PCR)
图2 肾小管上皮细胞的ET-1(原位杂交 ×400)
Fgiure 2 ET-1 in tubular epithelial cells (ISH ×400)
, 百拇医药 图3 肾小管上皮细胞的ET-1(免疫组化 ×400)
Figure 3 ET-1 in tubular epithelial cells (Immunohistochemistry ×400)
图4 再生的肾小管上皮细胞ET-1强表达(双重免疫组化 ×400)
Figure 4 ET-1 in regenerated tutular epithelial cells (double immunohistochemistry ×400)
2.2 肾小管上皮细胞具有ET-R
以细胞总RNA为模板，在ETA-R和ETB-R特异引物引导下，经RT-PCR扩增后，扩增产物分别为485 bp(ETA-R)和545 bp(ETB-R，图1)，说明肾小管上皮细胞有2种亚型ET-R的基因表达。
, 百拇医药
2.3 ET-1对肾成纤维细胞的促增殖作用
加入质量浓度为40 μg*L-1和5 μg*l-1 ET-1后，各时间点3H-TdR掺入率均高于对照组(表1)。
表1 不同质量浓度ET-1刺激肾成纤维细胞3H-TdR掺入率(
±s)
Table 1 Growth of fibroblasts stimulated by ET-1
of different concentration (3H-TdR，±s) t/h
, http://www.100md.com
A/Bq☆
a
b
c
8
682±13
785±49
792±56
24
629±17
704±38
714±34
, http://www.100md.com
32
522±62
653±40
688±27
48
485±34
615±43
633±27
2.4 肾成纤维细胞具有ET-R
以细胞总RNA为模板，在ET-R特异引物引导下，经RT-PCR扩增后，产物分别为545 bp(ETB-R)(图5)，说明肾成纤维细胞有ET-R的基因表达。a,0 μg.L-1; b,5 μg.L-1; c,40 μg.L-1; ☆,per 104 cell per min;
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*P<0.05, compared with non-ET-1 group.
1，ETB-R； 2,100 bp marker
图5 成纤维细胞的ETB-R(RT-PCR)
Figure 5 ETB-R in fibroblast(RT-PCR)
3 讨论
大量临床病理资料表明，各种原因引起的慢性肾功能损伤与肾小管间质纤维化病变的严重程度较肾小球病变更为密切[1]。且由于肾小管和肾间质在解剖及功能上的密切关系，肾小管损伤和肾间质纤维化总是伴同或先后发生，它们见于肾小球疾病通过肾单位缺血、大量蛋白尿及某些变态反应导致的肾小管损伤及肾间质病变；各种原因肾小管损伤导致的肾小管间质纤维化；各种间质性肾炎导致的肾间质纤维化和肾小管损伤，所以，对肾小管损伤和肾间质病变之间关系的探讨显得更为关键。
, 百拇医药
在探讨肾小管损伤及肾间质病变的关系中发现，损伤的肾小管上皮细胞产生的细胞因子，通过对肾间质成纤维细胞、肾血管及肾间质炎症细胞的作用，在肾间质纤维化中起重要介导作用[2]，其中研究较多的是血小板源性生长因子和转化生长因子，对ET研究较少，国内尚未见报道。
本研究重点探讨了肾小管和ET-1与间质纤维化的关系，目的在于从一个侧面初步探讨肾小管上皮细胞产生的ET-1在肾间质纤维化中的作用。
本文结果显示，肾小管上皮细胞有ET-1的基因表达及蛋白合成与分泌，说明肾小管上皮细胞是肾内ET-1的重要来源，且肾小管上皮细胞还有ET-R的基因表达，说明ET对肾小管上皮细胞的作用有自分泌和旁分泌两种途径。虽然在正常肾，肾小管上皮细胞产生的ET-1的作用还不清楚，但ET-1和PCNA的双重免疫组织化学染色结果显示,在肾小管上皮细胞损伤及再生过程中，呈现ET-1合成增多现象，说明一方面ET可促进肾小管上皮细胞的增殖与分化，另一方面若肾小管长期慢性损伤，势必导致肾间质长期处在一个高ET的环境中，ET-1可能通过对肾间质成纤维细胞、肾间质血管及炎症细胞的作用参与肾间质纤维化。
, 百拇医药
本实验给大鼠肾间质成纤维细胞加入ET-1后发现，H3-TdR掺入率较对照组明显增高，证明ET-1对肾成纤维细胞具有促增殖作用，这与国外Ong[6]的报道结果一致。本文用RT-PCR方法证明肾间质成纤维细胞具有ET-R的基因表达，证明ET-1对肾成纤维细胞的促增殖作用是通过作用于细胞表面的ET-R实现的。
综上所述，损伤及再生的肾小管上皮细胞合成和分泌的ET-1较正常时增多，ET-1通过促进肾间质成纤维细胞的增殖而促进肾间质纤维化。
* 国家自然科学基金(39770293)资助项目。
参考文献
1 Bohle A,Wehrman M,Bogenschutz O, et al. The long term prognosis of the primary glomerulonephritides. Pathol Res Pract, 1992,188:908-910
, 百拇医药
2 尹 广.肾小管上皮细胞产生的细胞因子在肾间质纤维化中的作用.肾脏病与透析肾移植杂志， 1994，3：309-411
3 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cell. Nature， 1988，232:411-414
4 Jaffer FE, Knaudd TC, Poptic E, et al. Endothelin stimulates PDGF secretion in cultured mesangial cells. Kidney Int， 1990，38:1193-1195
5 Tomitak, Ujiie K, Shohaib S, et al. Plasma endothelin levels in patients with acute renal failure. N Engl J Med， 1989，321:1127-1129
6 Ong ACM, Jowett TP, Firth JD, et al. A new paracrine loop implicated in human tubulointerstitial disease: tubular-derived endothelins modulate renal interstitial fibroblast function. J Am Soc Nephrol， 1993，4:473(abstract)
(1998-04-07收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学病理学系，北京 100083
关键词：肾小管；分泌；成纤维细胞；生长和发育；内皮缩血管肽类；代谢
北京医科大学学报990107 摘 要 目的：研究肾小管和内皮素与肾间质纤维化的关系。方法：应用肾小管上皮细胞及肾成纤维细胞的体外培养，通过逆转录-多聚酶链反应，免疫组织化学染色，放射免疫测定及双重免疫组织化学染色技术，并测定3H-TdR掺入率，观察肾小管损伤时产生的内皮素-1(endothelin-1 ET-1)与肾成纤维细胞增殖的关系。结果：肾小管上皮细胞既有ET-1 mRNA的表达，又有ET的两种受体(ETA-R mRNA和ETB-R mRNA)的表达，还有ET-1的蛋白合成及分泌。且肾小管损伤及再生过程中，ET-1表达增加。对体外培养的大鼠肾成纤维细胞加入ET-1，3H-TdR掺入率较对照组明显增高。并证明肾成纤维细胞有ET-R mRNA的表达。结论：损伤及再生的肾小管上皮细胞较正常时合成和分泌更多的ET-1，ET-1通过ET-R的作用，促使肾成纤维细胞的增殖，从而促进肾间质纤维化。
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中国图书资料分类法分类号 R692.33
The relationship between renal tubular epithelial cell,endothelin and renal interstitial fibrosis
LI Ling， ZOU Wan-Zhong
(Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Renal tubule/secret Endothelins/metab Fibroblasts/growth
ABSTRACT Objective: To study the relationship between injured renal tubular epithelial cell, endothelin(ET), and renal tubulointerstitial fibrosis(TIF). Methods: Renal tubular epithelial cell and renal fibroblast were cultured in vitro, and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR), immunohistochemical stain(IMC), radioimmuno-assay (RIA) and double IMC were used, and the ratio of 3H-TdR incorporation was measured to observe the relationship between ET-1 and proliferation of renal fibroblast. Results: There existed the expression of ET-1 mRNA and its receptors (ETA-R mRNA and ETB-R mRNA), and also the synthesis of ET-1 peptide in renal tubular epithelial cell. In the course of damage and regeneration, renal tubular epithelial cell produced more ET-1. The ratio of 3H-TdR incorporation of renal fibroblast was higher than that of control group when ET-1 to was added this cultured cell. There existed the expression of ETB-R mRNA in renal fibroblast. Conclusion: Injured and regenerated renal tubular epithelial cell produced and secreted more ET-1 than in normal kidney. ET-1 contributed to interstitial fibrosis by promoting the proliferation of renal fibroblast through ET-R.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:23-26)
多种慢性肾功能衰竭的肾脏疾病都与肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)密切相关[1]，虽然肾间质纤维化的发生机制尚不完全清楚，但近年研究发现，细胞因子在其中起着重要的介导作用[2]。内皮素(endothelin, ET)是重要的缩血管物质[3]，它有3种异构体：ET-1、ET-2、ET-3，其中ET-1的缩血管作用最强烈而持久，且对多种细胞有促增殖作用[4]。多种肾脏疾病患者血、尿及肾组织中ET-1水平明显高于正常[5]，说明ET-1在肾脏疾病中有重要作用。鉴于肾小管和肾间质在解剖和功能上的密切关系，本文利用肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞的体外培养，通过分子生物学的方法探讨肾小管和ET-1 与TIF的关系。
1 材料与方法
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1.1 肾小管上皮细胞的培养
取雄性Wister大鼠4只，体重140～150g，无菌取肾皮质在80钼网筛上研磨，收集140钼网筛上的肾小管，胶原酶(0.5g.L-1, Sigma公司)37℃消化20min，种入含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养液培养，细胞铺满后经组织化学、免疫组化及电镜观察鉴定为肾小管上皮细胞。
1.2 肾成纤维细胞的培养
取雄性Wister大鼠2只，体重180～200g，无菌取肾髓质，剪碎，胰酶37℃消化2～3min，种入含体积分数为20%小牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)培养，细胞铺满后经组织化学、免疫组化电镜观察及更换替代培养液(其中不含成纤维细胞必需的右旋缬氨酸，使成纤维细胞不能存活)鉴定为肾间质成纤维细胞。
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1.3 庆大霉素致肾小管损伤模型建立
给Wister大鼠腹腔注射庆大霉素每天每千克体重400 mg,连续4 d，造成肾小管损伤，分别于第1、3、5、7、9、12、15天观察肾损伤形态，可见第1、3天皮质近曲小管灶状坏死，第5天皮质近曲小管弥漫坏死，第7天肾小管上皮再生，第9天再生明显，第12、15天几乎看不见坏死小管，肾小管完全再生。对照组肾小管未见明显病变。
1.4 肾小管上皮细胞与内皮素(ET-1)及内皮素受体(ET-R)的关系
1.4.1 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测ET-1、ET-R在肾小管上皮细胞的基因表达 ET-1及ET-R的引物设计与合成是根据ET-1及其两种受体亚型ETA-R和ETB-R的核苷酸序列，设计并由本系合成了寡核苷酸引物，其上下游引物序列为:
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ET-1:
5′-CGT TGC TCC TGC TCC TCC TTG ATG-3′
5′-AAG ATC CCG GCC AGC ATG GAG AGC G-3′(154-699nt)
ETA-R：
5′-TAA TCT AAG CAG CCA CGA CCA CGT GGA GGA-3′
5′-AGA AAG CCA CTG CTC TGT ACC TGT-3′(84-568nt)
ETB-R：
5′-GTG TTC GTG CTA GGC ATC ATC G-3′
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5′-AAG GCA GCG ATG GCT AGC G-3′(328-872nt)
经RT-PCR应分别扩增出cDNA片段，长度分别为546bp(ET-1)、485bp(ETA-R )、545bp(ETB-R)。RT-PCR所用试剂均为美国Promega公司产品。
逆转录(reverse transcription， RT)：各取1 μg细胞总RNA,顺序加入一定量的下游引物及必需试剂，于42 ℃反应60 min，95 ℃ 5 min终止反应。
多聚酶链反应(polymerase chain reaction， PCR)：取逆转录产物4 μl依次加入上、下游引物及相应试剂后，进行变性(94 ℃, 40 s)，退火60 s(ET-1 55 ℃,ETA-R和ETB-R均为52 ℃)及延伸(72 ℃， 30 s)，循环35个周期。
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1.4.2 原位杂交检测ET-1 mRNA在肾小管上皮细胞的表达 对肾小管上皮细胞爬片进行ET-1的原位杂交，BCIP+NBT显色。探针用地高辛标记，特异引物引导下的PCR方法制成，杂交液中不加探针为阴性对照。
1.4.3 ET-1蛋白水平检测 无血清培养细胞24 h后，用放射免疫测定法(RIA)检测培养上清中ET-1的活度。以ET-1兔抗人多克隆抗体(美国Peninsula 公司)为一抗，用SP法对肾小管上皮细胞的爬片及涂片进行免疫组化染色，不加一抗为阴性对照。
1.5 肾小管损伤与ET-1的关系
对庆大霉素造成肾小管损伤模型组及正常Wister大鼠肾组织分别进行ET-1及增殖细胞核抗原(proliferating cellular nucleo antigen, PCNA鼠抗人单抗DAKO公司)的双重免疫组化染色，三抗分别为标有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的链菌素抗生物素蛋白，ET-1用DAB 显色，PCNA用BCIP+NBT显色，不加一抗为阴性对照，用以探讨ET的产生与肾小管损伤的关系。
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1.6 3H-TdR掺入法观察ET-1对肾成纤维细胞的促增殖作用
将第一代成纤维细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8 h后换体积分数为含1%的小牛血清的DMEM继续培养20 h后，加入ET-1(美国Peninsula公司)，使终质量浓度分别为40 μg*L-1和5 μg*L-1，于第8、24、32、48小时收集细胞，每个时间点每个质量浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，收集细胞前7 h每孔加入3H-TdR 1.85×104 Bq。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(1 g*L-1 2,5二苯基口 恶唑,0.5 g*L-1对苯撑苯口 恶唑)Beckman液闪仪检测。
1.7 肾间质纤维细胞与ET-R的关系
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取第一代细胞总RNA 1 μg,按上述步骤进行RT-PCR，退火条件为ET-R 62 ℃、50 s。
2 结果
2.1 肾小管上皮细胞有合成和分泌ET-1的功能
用RIA法测得细胞培养上清中ET质量浓度分别为17.42 ng*L-1。以细胞总RNA为模板，在ET-1特异引物引导下，经RT-PCR扩增后，扩增产物为546 bp(图1)。对肾小管上皮细胞爬片进行地高辛标记的ET-1 mRNA原位杂交，结果细胞胞浆中显示明显紫蓝色阳性信号(图2)。以ET-1多克隆抗体为一抗，对培养的肾小管上皮细胞的爬片及涂片进行免疫组织化学染色，结果为强阳性(图3)。ET-1与PCNA双重免疫组化染色结果表明：实验第7、9、12天PCNA阳性的肾小管上皮细胞(即损伤及再生的肾小管上皮细胞)ET-1表达强阳性(图4)，而正常及实验第1、3、5天的大鼠肾小管上皮细胞ET-1呈弱阳性。上述结果说明肾小管上皮细胞有ET-1 mRNA的表达，又有ET-1的蛋白合成与分泌，而且，损伤及再生的肾小管上皮细胞ET-1的合成明显增加。
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1，ET-1； 2，ETA-R； 3，ETB-R； 4，100 bp marker
图1 肾小管上皮细胞的ET-1及ET-R(RT-PCR)
Figure 1 ET-1 and ET-R in tubular epithelial cells (RT-PCR)
图2 肾小管上皮细胞的ET-1(原位杂交 ×400)
Fgiure 2 ET-1 in tubular epithelial cells (ISH ×400)
, 百拇医药 图3 肾小管上皮细胞的ET-1(免疫组化 ×400)
Figure 3 ET-1 in tubular epithelial cells (Immunohistochemistry ×400)
图4 再生的肾小管上皮细胞ET-1强表达(双重免疫组化 ×400)
Figure 4 ET-1 in regenerated tutular epithelial cells (double immunohistochemistry ×400)
2.2 肾小管上皮细胞具有ET-R
以细胞总RNA为模板，在ETA-R和ETB-R特异引物引导下，经RT-PCR扩增后，扩增产物分别为485 bp(ETA-R)和545 bp(ETB-R，图1)，说明肾小管上皮细胞有2种亚型ET-R的基因表达。
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2.3 ET-1对肾成纤维细胞的促增殖作用
加入质量浓度为40 μg*L-1和5 μg*l-1 ET-1后，各时间点3H-TdR掺入率均高于对照组(表1)。
表1 不同质量浓度ET-1刺激肾成纤维细胞3H-TdR掺入率(
±s)Table 1 Growth of fibroblasts stimulated by ET-1
of different concentration (3H-TdR，
±s) t/h, http://www.100md.com
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c
8
682±13
785±49
792±56
24
629±17
704±38
714±34
, http://www.100md.com
32
522±62
653±40
688±27
48
485±34
615±43
633±27
2.4 肾成纤维细胞具有ET-R
以细胞总RNA为模板，在ET-R特异引物引导下，经RT-PCR扩增后，产物分别为545 bp(ETB-R)(图5)，说明肾成纤维细胞有ET-R的基因表达。a,0 μg.L-1; b,5 μg.L-1; c,40 μg.L-1; ☆,per 104 cell per min;
, http://www.100md.com
*P<0.05, compared with non-ET-1 group.
1，ETB-R； 2,100 bp marker
图5 成纤维细胞的ETB-R(RT-PCR)
Figure 5 ETB-R in fibroblast(RT-PCR)
3 讨论
大量临床病理资料表明，各种原因引起的慢性肾功能损伤与肾小管间质纤维化病变的严重程度较肾小球病变更为密切[1]。且由于肾小管和肾间质在解剖及功能上的密切关系，肾小管损伤和肾间质纤维化总是伴同或先后发生，它们见于肾小球疾病通过肾单位缺血、大量蛋白尿及某些变态反应导致的肾小管损伤及肾间质病变；各种原因肾小管损伤导致的肾小管间质纤维化；各种间质性肾炎导致的肾间质纤维化和肾小管损伤，所以，对肾小管损伤和肾间质病变之间关系的探讨显得更为关键。
, 百拇医药
在探讨肾小管损伤及肾间质病变的关系中发现，损伤的肾小管上皮细胞产生的细胞因子，通过对肾间质成纤维细胞、肾血管及肾间质炎症细胞的作用，在肾间质纤维化中起重要介导作用[2]，其中研究较多的是血小板源性生长因子和转化生长因子，对ET研究较少，国内尚未见报道。
本研究重点探讨了肾小管和ET-1与间质纤维化的关系，目的在于从一个侧面初步探讨肾小管上皮细胞产生的ET-1在肾间质纤维化中的作用。
本文结果显示，肾小管上皮细胞有ET-1的基因表达及蛋白合成与分泌，说明肾小管上皮细胞是肾内ET-1的重要来源，且肾小管上皮细胞还有ET-R的基因表达，说明ET对肾小管上皮细胞的作用有自分泌和旁分泌两种途径。虽然在正常肾，肾小管上皮细胞产生的ET-1的作用还不清楚，但ET-1和PCNA的双重免疫组织化学染色结果显示,在肾小管上皮细胞损伤及再生过程中，呈现ET-1合成增多现象，说明一方面ET可促进肾小管上皮细胞的增殖与分化，另一方面若肾小管长期慢性损伤，势必导致肾间质长期处在一个高ET的环境中，ET-1可能通过对肾间质成纤维细胞、肾间质血管及炎症细胞的作用参与肾间质纤维化。
, 百拇医药
本实验给大鼠肾间质成纤维细胞加入ET-1后发现，H3-TdR掺入率较对照组明显增高，证明ET-1对肾成纤维细胞具有促增殖作用，这与国外Ong[6]的报道结果一致。本文用RT-PCR方法证明肾间质成纤维细胞具有ET-R的基因表达，证明ET-1对肾成纤维细胞的促增殖作用是通过作用于细胞表面的ET-R实现的。
综上所述，损伤及再生的肾小管上皮细胞合成和分泌的ET-1较正常时增多，ET-1通过促进肾间质成纤维细胞的增殖而促进肾间质纤维化。
* 国家自然科学基金(39770293)资助项目。
参考文献
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6 Ong ACM, Jowett TP, Firth JD, et al. A new paracrine loop implicated in human tubulointerstitial disease: tubular-derived endothelins modulate renal interstitial fibroblast function. J Am Soc Nephrol， 1993，4:473(abstract)
(1998-04-07收稿), http://www.100md.com