用电解损毁方法制备大鼠的脊髓损伤模型*
作者：唐晓青 万有 黄志华 韩济生
单位：北京医科大学神经科学研究所，北京 100083
关键词：脊髓损伤；电解；大鼠近交HRP；疾病模型；动物
990310 摘要 目的：建立一种简便实用、稳定可靠的脊髓损伤动物模型。方法：采用电解损毁法，主要损伤大鼠第10胸椎节段脊髓双侧皮质脊髓束纤维，在术后不同时间观察受损脊髓组织学变化及大鼠运动功能改变，并用HRP逆行标记技术，以大脑运动皮层标记神经元计数来反映皮质脊髓束受损情况。结果：1 mA, 210 s的损伤电流，可在脊髓后索造成神经组织坏死，形成空腔，使双侧皮质脊髓束纤维受损；术后1周、2周、3周观察，电损毁组大鼠运动功能显著低于假手术组，表现为后肢运动评分下降，Ashworth 肌张力评分增大，斜板实验角度下降；电损毁组运动皮质标记神经元计数也显著低于假手术组。结论：电解损毁在适宜参数下能损伤双侧脊髓皮质脊髓束，引起双后肢的不完全性截瘫，结果稳定可靠，操作简便，为脊髓损伤的实验研究奠定了基础。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R744-332
The electrolytic lesion as a model of spinal cord injury in adult rat
TANG Xiao-Qing, WAN You, Huang Zhi-Hua, HAN Ji-Sheng
( Neuroscience Research Institute, Beijing Medical University, Beijing 100083 )
MeSH Spinal cord injury Electrolysis Rat inbred HRP Disease models, animal
ABSTRACT Objective: To set up a practical and reliable animal model of spinal cord injury. Methods: Electrolytic lesion was made on bilateral corticospinal tract (CST) in rat at the 10th thoracic vertebra level. At different time of post-injury, the histological change of lesioned spinal cord, the behavioral manifestation and the HRP-labeled neuron counts in the motor cortex which reflect the damage of CST was evaluated. Results: Current of 1 mA, 210 s could cause necrosis and cavitation in the dorsal funiculus, resulting in bilateral corticospinal tract injury; rats with electrolytic lesions exhibited declined motor function with decreased Tarlov score, increased Ashworth score and reduced inclined plane angle, the HRP labeled neuron counts in motor cortex were also significantly lower in the lesioned group than sham-operation group. Conclusion: Electrolytic lesion of the bilateral corticospinal tract could cause incomplete paraplegia in the hind limbs. The study has proorded a base for research on spinal cord injury with dependable results.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:226-229)
建立一个适宜的脊髓损伤动物模型，是进行脊髓损伤基础研究的前提。重物下落法是多年来应用较普遍的一种模型，但这种致伤方法影响因素众多，如脊髓固定的程度，引导管垂直的程度等，使得所造成的病理改变和功能障碍变异性大，尤其中等程度的损伤更是如此[1]。如果减小损伤强度，就无法引起一定程度、持续一定时间的形态及功能改变，而加大损伤强度又会带来死亡率高、术后护理要求高、损伤不可逆等问题，这些均不利于进行脊髓损伤后再生修复及功能恢复的研究。
电解损毁方法是脑内神经通路研究的常用手段，具有损伤范围局限、参数可客观定量、重复性好等优点[2，3]，但把它作为脊髓损伤的造模方法尚不多见。Mathers等[4]曾报道，应用阳极电损毁方法，将电极插入一侧脊髓灰质中间带处，通以0.1mA的直流电，持续30s，可引起周围灰质及白质损伤，以及一侧肢体运动功能下降。本实验在借鉴Mathers方法的基础上，探讨了电解损毁大鼠下胸段脊髓双侧皮质脊髓束的适宜参数及术后不同时间的形态学及行为学改变，旨在建立一种简便、可靠的动物模型，为研究脊髓损伤后神经再生及筛选有效治疗手段奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及动物模型制作
实验动物采用体重220～250g的雌性Wistar 大鼠，2.5月龄，由本校动物部供应，自然光照周期，定时添足饲料，饮水不加限制。实验前将动物随机分为假手术组及电损毁组。
腹腔注射100g.L-1的水合氯醛(0.35g.kg-1)麻醉大鼠，在T10胸椎水平行椎板切除术，暴露脊髓。将大鼠固定于立体定位仪上，定位仪上安装两个特制的钢夹，分别夹住T9、T11胸椎棘突，以固定脊髓。上旋钢夹少许，以减少呼吸运动的影响，同时注意保持脊髓处于水平位，并使其长轴与定位仪长轴平行。用26号针头在脊膜上挑一小洞，以便电极能无阻力地刺入脊髓。金属电极用直径约0.3mm的不锈钢针灸针制作，将针尖钳去，断端磨平，表面薄薄镀一层绝缘漆，再用砂纸磨去尖端的绝缘漆，使尖端能够导电。将做好的电极固定于立体定位仪上，一端与电刺激仪(日本光电公司生产，SEN-3201型)输出端的阳极相连，作为损毁电极，阴极则直接夹在创口的肌肉上。调节立体定位仪旋钮，将损毁电极从脊髓中线右侧旁开0.3mm处，斜行30°刺入脊髓，深度为0.86mm[5]。电损毁组大鼠通以直流电，强度1mA，持续210s，通电完毕后抬起电极，创面撒少量青霉素粉，逐层缝合肌肉与皮肤。术后分笼饲养，每2～3天换一次垫料，不需人工排尿。假手术组大鼠插入电极后不通电，210s后即抬起电极，余处理均同电损毁组。
, 百拇医药
1.2 行为学评分
1.2.1 后肢运动评分 采用改良的Tarlov分级评分法[4]。0级：完全瘫痪，不能做任何运动；1级：严重瘫痪，不能支撑身体，可以有轻微的运动，但不能做类似于爬行动作；2级：瘫痪，不能支撑身体，但能够做爬行动作；3级：轻度瘫痪，能够支撑身体，但行走时不稳，有跛行；4级：无瘫痪，行走自如。
1.2.2 Ashworth 肌张力评分[6] 根据肢体被动活动及关节屈伸的自由程度分为5级。0级：无肌张力增高，大鼠活动自如；1级：轻度肌张力增高，在屈伸过程中出现一过性停顿；2级：明显肌张力增高，但肢体尚易屈伸，有轻度共济失调；3级：明显肌张力增高，被动活动困难，有中度共济失调；4级：肢体屈伸受限，有重度共济失调。
以上两项实验中，均对双侧后肢分别进行评分，每只大鼠的评分为双侧评分的均值。
, 百拇医药
1.2.3 斜板实验[7] 总体评估四肢肌力。斜板表面垫以6mm厚的橡胶垫，按大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直的方向放置大鼠，逐渐增加斜板与水平面间的角度，直至大鼠刚好可在板上停留5 s，记录这一角度。每只大鼠测3次，取平均值。
所有行为学评估均在单盲情况下进行。
1.3 形态学方法
1.3.1 HRP逆行示踪技术 HRP可被神经末梢摄取，通过逆向轴浆运输被运送到神经元胞体。如果神经元轴突受损中断，HRP就不能到达胞体[3]。根据这一原理，把HRP注入脊髓腰膨大处(即支配后肢的皮质脊髓束末梢所在部位)，经过一定时间后在运动皮层处观察皮质脊髓束胞体标记情况，可以反映皮质脊髓束纤维损伤的情况。
大鼠经腹腔麻醉，行T13椎板切除术，暴露脊髓腰膨大部。用微量注射器向腰膨大注入400 g.L-1的HRP 4～5μl，速度0.5μl.min-1，留针15min，分层缝合切口(预实验证实这一过程不会引起大鼠运动功能改变)。术后第3天，在深麻下，用40g.L-1多聚甲醛，体积分数为2.5%的戊二醛液做心内灌流固定。随后立即取脑，在同种固定液中重固定2h。根据Donoghue的定位图，支配后肢的皮质脊髓束胞体在前囟前后的体感运动皮层处分布较集中，取前囟前后脑组织做连续冰冻切片，片厚50μm，用TMB法孵育显色[8]。每只大鼠取9张脑片，镜下计数标记神经元总数。
, http://www.100md.com
1.3.2 HE染色 为观察电解损毁引起的脊髓病理变化，分别在损伤后20min、1周、2周、3周时，心内灌流40g.L-1的多聚甲醛固定处死动物，取出受损部脊髓，在40g.L-1的多聚甲醛中后固定24 h，冰冻切片，做常规HE染色。
1.4 数据分析及统计学处理
实验结果用
±
表示。斜板实验及细胞计数结果的比较用ANOVA继以Newman-Keuls检验，运动评分和Ashworth 评分的比较用Mann-Whitney检验(两组间比较)或Kruskal-Wallis检验(多组间比较)。大鼠标记神经元计数与相应的斜板实验角度之间的相关性用线性回归方法分析。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 刺激参数的选择
在预实验中证实，大鼠脊髓损伤的严重程度随着电流强度的增大和通电时间的延长而加重。经过反复摸索，证实1mA210s 的损毁参数，既能较成功地诱导出大部分动物的截瘫，又不会造成严重的尿潴留、全身衰竭等情况，因此在正式实验中选择这一参数进行损伤模型制作。
2.2 脊髓损伤后不同时间的组织学变化
假手术组大鼠术后20min取受损脊髓做HE染色，横断面上可见不同程度的机械性损伤，伴有出血和炎性细胞浸润。损伤围绕在电极插入轨迹周围，电极尖端位于后索腹侧部靠近中线的部位(箭头所示)。术后1周到3周，可见出血逐渐吸收，损伤逐渐修复，至3周时脊髓基本恢复正常。电损毁组术后20min可见后索腹侧部有近似球形的空洞形成，空洞以电极尖端为中心，伴有出血、水肿和炎性细胞浸润；至1周时，脊髓内空洞更加明显，累及背侧索大部，包括双侧皮质脊髓束，出血、水肿有所减轻，整个脊髓体积有所缩小；2周到3周时出现大量胶质细胞增生，填充在空洞部(图1)。
, http://www.100md.com
Pictures a-d were taken from the sham-operation group, and e-h were from the electrolytic lesion group, from the left to the right shows 20 min (a, e), 1 week (b,f ), 2 week (c, g) and 3 week (f, h) of post-injury changes, respectively. Arrows point to the tip of the electrode. HE staining, ×40
图1 大鼠T10胸椎节段脊髓电解损伤后不同时间的组织学改变
Figure 1 The histology of electrolytic lesions
in adult rat spinal cord at the T10 vertebral level
, http://www.100md.com
2.3 脊髓损伤后不同时间行为学评估结果
脊髓损伤后不同时间的运动评分、Ashworth 评分及斜板实验结果如表1。由表中可看出，假手术组与电损毁组术前各项指标比较，无统计学意义。术后1周、2周、3周电损毁组较假手术组运动功能有明显下降，表现为运动评分降低，肌张力评分增高，斜板实验角度下降；各组分别与自身比较，假手术组术后各时间点与术前无统计学意义，电损毁组术后1周、2周、3周运动功能均较术前显著下降，术后各时间点之间的评分也无统计学意义。表1 脊髓损伤后不同时间的运动评分、Ashworth 评分及斜板实验角度
Table 1 The motor score ( M ), Ashworth score ( A ) and inclined plane angle
( I ) at different time of post-injury Time
, 百拇医药
Sham-operation group
Electrolytic-lesioned group
M
A
I
M
A
I
Pre-operation
4.0±0
0.2±0.1
71.6±0.5
, http://www.100md.com
4.0±0
0.2±0.1
71.2±0.6
1w
3.6±0.2
0.5±0.1
69.6±1.6
2.1±0.3**##
1.9±0.1**##
58.6±2.0**##
2w
, 百拇医药
3.8±0.1
0.6±0.2
71.2±1.3
2.6±0.2**##
1.8±0.2**##
60.5±2.0**##
3w
3.9±0.1
0.5±0.2
72.8±1.5
2.6±0.4**#
, 百拇医药
1.8±0.1**##
61.5±2.5**##
**P<0.01， compared with the sham-operation group； #P<0.05， ## P<0.01， compared with pre-operation. n=12～17.
2.4 HRP逆行示踪实验结果
正常大鼠腰膨大部注入HRP，存活3 d后灌注固定，脑片上可见大脑皮质运动区内标记细胞呈条带状分布(图2)。两组术后不同时间大脑运动皮层标记神经元计数结果如图3。由图中可知，电损毁组术后各时间点计数明显低于假手术组；两组分别与自身比较，术后不同时间计数无统计学意义。
, 百拇医药
图2 正常大鼠腰膨大部注入HRP后，大脑皮质运动区切片，示HRP逆行性标记的神经元胞体 ×100
Figure 2 The retrograde labeled neurons in brain motor cortex with HRP
injected in lumbar enlargement in normal rats. ×100
** P<0.01， compared with the sham-operation group.
图3 脊髓损伤后不同时间大脑运动皮层HRP标记细胞数变化
Figure 3 The HRP-labeled neuron counts in brain
, http://www.100md.com
motor cortex after spinal cord injury
2.5 相关分析结果
HRP标记神经元计数与相应的斜板实验角度间相关性不显著(P>0.05)。
3 讨论
脊髓损伤是一种严重创伤，全球每年约有100000新发患者，其典型表现为痉挛性截瘫，其中运动功能的障碍主要是由于皮质脊髓束、红核脊髓束等下行传导束的纤维受损，使得受损平面以下的脊髓运动神经元失去了上位中枢的支配和控制所致。本实验用电解损毁的方法，在T10胸椎节段脊髓处(位于脊髓腰膨大上方)插入损毁电极，电极尖端位于双侧皮质脊髓束之间，通电后由于电流的电解和产热作用，使得位于电极尖端周围的皮质脊髓束受损，造成双侧后肢的痉挛性瘫痪。这一模型可在一定程度上从病理改变和临床表现上模拟人类截瘫的运动系受损情况，为脊髓损伤后促进神经再生、改善运动功能等的研究提供了工具。
, 百拇医药
从本实验的结果可以看出，脊髓电损毁组大鼠的肌力减弱，肌张力增大，运动功能明显下降，且能持续至少3周以上。由于损毁范围相对局限，因此动物死亡率低(约为19%)，一般状况较好，不需特殊的术后护理。而且实验操作比较简便，电流强度和通电时间可由电刺激仪精确控制，减少了主观因素的干扰，克服了重物下落法人为干扰因素多、可重复性差的缺点。因此，模型的实用性及可靠性较强。
本实验所采用的方法与Mathers的电损毁方法有所不同。在Mathers的实验中，电极尖端位于大鼠脊髓一侧灰质中间带处，损毁电流强度0.1mA,持续30s，造成了同侧灰质Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ层的损害；3个月后观察，同侧白质背外侧索明显萎缩，大鼠一侧后肢运动评分降低，但斜板实验角度正常。我们在最初摸索适宜损毁参数时，也曾重复了Mathers的方法，但未能诱导出稳定的痉挛性瘫痪表现，这或许是由于动物的差异、观察时间的不同造成的。
本实验应用HRP逆行标记技术反映皮质脊髓束纤维受损的情况。大鼠皮质脊髓束从大脑皮层锥体细胞发出后，大部分在延髓交叉行于对侧脊髓后索腹侧部，小部分不交叉，行于同侧脊髓前索。如果脊髓皮质脊髓束纤维受损，使轴浆流中断，HRP就不能从末梢运输到胞体，也就无法使大脑运动皮层处的锥体细胞产生标记。
, 百拇医药
用线性回归分析方法发现，动物标记神经元计数与行为学指标(斜板实验角度)之间相关性不显著，分析其原因可能为：(1)实验中电解损毁除损伤了皮质脊髓束外，还累及了邻近传导束，如同样位于后索的薄、楔束等，它们的损伤也对运动功能产生了一定影响；(2)皮质脊髓束受损后，其它下行传导束，如红核脊髓束等的功能有一定的代偿性增强，这也在一定程度上影响了动物的行为学表现。具体机制有待进一步探讨。
* 国家自然科学基金(39600150)资助项目。
参考文献
1 Weirich SD, Cotler HB, Narayana PA, et al. Histopathologic correlation of magnetic resonance imaging signal patterns in a spinal cord injury model. Spine, 1990, 15: 630-638
, 百拇医药
2 周衍椒，赵轶千，王雨若主编. 生理学方法与技术.第1集. 北京：科学出版社，1987. 75-82
3 杜卓民等编译. 神经解剖学和传导束路追踪. 北京：科学出版社, 1987. 28-32,107-118
4 David AM, Robert JF. The electrolytic lesion as a model of spinal cord damage and repair in the adult rat. J Neurosci Meth, 1991, 38: 15-23
5 王平宇主编. 大白鼠中枢神经系统解剖学基础. 人民卫生出版社，1986. 188-192
6 Ashworth B. Preliminary trial of carisoprodal in multiple sclerosis. Practitioner, 1964, 192: 540
7 Nakamura M, Fujimura Y, Yato Y, et al. Changes in choline acetyltransferase activity and distribution following incomplete cervical spinal cord injury in the rat. Neuroscience, 1996, 75: 481-494
8 顾耀铭. 钨酸钠作为稳定剂的新的高灵敏的HRP-TMB法Ⅱ. 神经解剖学杂志，1991，1：124-129
(1999-03-02收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学神经科学研究所，北京 100083
关键词：脊髓损伤；电解；大鼠近交HRP；疾病模型；动物
990310 摘要 目的：建立一种简便实用、稳定可靠的脊髓损伤动物模型。方法：采用电解损毁法，主要损伤大鼠第10胸椎节段脊髓双侧皮质脊髓束纤维，在术后不同时间观察受损脊髓组织学变化及大鼠运动功能改变，并用HRP逆行标记技术，以大脑运动皮层标记神经元计数来反映皮质脊髓束受损情况。结果：1 mA, 210 s的损伤电流，可在脊髓后索造成神经组织坏死，形成空腔，使双侧皮质脊髓束纤维受损；术后1周、2周、3周观察，电损毁组大鼠运动功能显著低于假手术组，表现为后肢运动评分下降，Ashworth 肌张力评分增大，斜板实验角度下降；电损毁组运动皮质标记神经元计数也显著低于假手术组。结论：电解损毁在适宜参数下能损伤双侧脊髓皮质脊髓束，引起双后肢的不完全性截瘫，结果稳定可靠，操作简便，为脊髓损伤的实验研究奠定了基础。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R744-332
The electrolytic lesion as a model of spinal cord injury in adult rat
TANG Xiao-Qing, WAN You, Huang Zhi-Hua, HAN Ji-Sheng
( Neuroscience Research Institute, Beijing Medical University, Beijing 100083 )
MeSH Spinal cord injury Electrolysis Rat inbred HRP Disease models, animal
ABSTRACT Objective: To set up a practical and reliable animal model of spinal cord injury. Methods: Electrolytic lesion was made on bilateral corticospinal tract (CST) in rat at the 10th thoracic vertebra level. At different time of post-injury, the histological change of lesioned spinal cord, the behavioral manifestation and the HRP-labeled neuron counts in the motor cortex which reflect the damage of CST was evaluated. Results: Current of 1 mA, 210 s could cause necrosis and cavitation in the dorsal funiculus, resulting in bilateral corticospinal tract injury; rats with electrolytic lesions exhibited declined motor function with decreased Tarlov score, increased Ashworth score and reduced inclined plane angle, the HRP labeled neuron counts in motor cortex were also significantly lower in the lesioned group than sham-operation group. Conclusion: Electrolytic lesion of the bilateral corticospinal tract could cause incomplete paraplegia in the hind limbs. The study has proorded a base for research on spinal cord injury with dependable results.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:226-229)
建立一个适宜的脊髓损伤动物模型，是进行脊髓损伤基础研究的前提。重物下落法是多年来应用较普遍的一种模型，但这种致伤方法影响因素众多，如脊髓固定的程度，引导管垂直的程度等，使得所造成的病理改变和功能障碍变异性大，尤其中等程度的损伤更是如此[1]。如果减小损伤强度，就无法引起一定程度、持续一定时间的形态及功能改变，而加大损伤强度又会带来死亡率高、术后护理要求高、损伤不可逆等问题，这些均不利于进行脊髓损伤后再生修复及功能恢复的研究。
电解损毁方法是脑内神经通路研究的常用手段，具有损伤范围局限、参数可客观定量、重复性好等优点[2，3]，但把它作为脊髓损伤的造模方法尚不多见。Mathers等[4]曾报道，应用阳极电损毁方法，将电极插入一侧脊髓灰质中间带处，通以0.1mA的直流电，持续30s，可引起周围灰质及白质损伤，以及一侧肢体运动功能下降。本实验在借鉴Mathers方法的基础上，探讨了电解损毁大鼠下胸段脊髓双侧皮质脊髓束的适宜参数及术后不同时间的形态学及行为学改变，旨在建立一种简便、可靠的动物模型，为研究脊髓损伤后神经再生及筛选有效治疗手段奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及动物模型制作
实验动物采用体重220～250g的雌性Wistar 大鼠，2.5月龄，由本校动物部供应，自然光照周期，定时添足饲料，饮水不加限制。实验前将动物随机分为假手术组及电损毁组。
腹腔注射100g.L-1的水合氯醛(0.35g.kg-1)麻醉大鼠，在T10胸椎水平行椎板切除术，暴露脊髓。将大鼠固定于立体定位仪上，定位仪上安装两个特制的钢夹，分别夹住T9、T11胸椎棘突，以固定脊髓。上旋钢夹少许，以减少呼吸运动的影响，同时注意保持脊髓处于水平位，并使其长轴与定位仪长轴平行。用26号针头在脊膜上挑一小洞，以便电极能无阻力地刺入脊髓。金属电极用直径约0.3mm的不锈钢针灸针制作，将针尖钳去，断端磨平，表面薄薄镀一层绝缘漆，再用砂纸磨去尖端的绝缘漆，使尖端能够导电。将做好的电极固定于立体定位仪上，一端与电刺激仪(日本光电公司生产，SEN-3201型)输出端的阳极相连，作为损毁电极，阴极则直接夹在创口的肌肉上。调节立体定位仪旋钮，将损毁电极从脊髓中线右侧旁开0.3mm处，斜行30°刺入脊髓，深度为0.86mm[5]。电损毁组大鼠通以直流电，强度1mA，持续210s，通电完毕后抬起电极，创面撒少量青霉素粉，逐层缝合肌肉与皮肤。术后分笼饲养，每2～3天换一次垫料，不需人工排尿。假手术组大鼠插入电极后不通电，210s后即抬起电极，余处理均同电损毁组。
, 百拇医药
1.2 行为学评分
1.2.1 后肢运动评分 采用改良的Tarlov分级评分法[4]。0级：完全瘫痪，不能做任何运动；1级：严重瘫痪，不能支撑身体，可以有轻微的运动，但不能做类似于爬行动作；2级：瘫痪，不能支撑身体，但能够做爬行动作；3级：轻度瘫痪，能够支撑身体，但行走时不稳，有跛行；4级：无瘫痪，行走自如。
1.2.2 Ashworth 肌张力评分[6] 根据肢体被动活动及关节屈伸的自由程度分为5级。0级：无肌张力增高，大鼠活动自如；1级：轻度肌张力增高，在屈伸过程中出现一过性停顿；2级：明显肌张力增高，但肢体尚易屈伸，有轻度共济失调；3级：明显肌张力增高，被动活动困难，有中度共济失调；4级：肢体屈伸受限，有重度共济失调。
以上两项实验中，均对双侧后肢分别进行评分，每只大鼠的评分为双侧评分的均值。
, 百拇医药
1.2.3 斜板实验[7] 总体评估四肢肌力。斜板表面垫以6mm厚的橡胶垫，按大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直的方向放置大鼠，逐渐增加斜板与水平面间的角度，直至大鼠刚好可在板上停留5 s，记录这一角度。每只大鼠测3次，取平均值。
所有行为学评估均在单盲情况下进行。
1.3 形态学方法
1.3.1 HRP逆行示踪技术 HRP可被神经末梢摄取，通过逆向轴浆运输被运送到神经元胞体。如果神经元轴突受损中断，HRP就不能到达胞体[3]。根据这一原理，把HRP注入脊髓腰膨大处(即支配后肢的皮质脊髓束末梢所在部位)，经过一定时间后在运动皮层处观察皮质脊髓束胞体标记情况，可以反映皮质脊髓束纤维损伤的情况。
大鼠经腹腔麻醉，行T13椎板切除术，暴露脊髓腰膨大部。用微量注射器向腰膨大注入400 g.L-1的HRP 4～5μl，速度0.5μl.min-1，留针15min，分层缝合切口(预实验证实这一过程不会引起大鼠运动功能改变)。术后第3天，在深麻下，用40g.L-1多聚甲醛，体积分数为2.5%的戊二醛液做心内灌流固定。随后立即取脑，在同种固定液中重固定2h。根据Donoghue的定位图，支配后肢的皮质脊髓束胞体在前囟前后的体感运动皮层处分布较集中，取前囟前后脑组织做连续冰冻切片，片厚50μm，用TMB法孵育显色[8]。每只大鼠取9张脑片，镜下计数标记神经元总数。
, http://www.100md.com
1.3.2 HE染色 为观察电解损毁引起的脊髓病理变化，分别在损伤后20min、1周、2周、3周时，心内灌流40g.L-1的多聚甲醛固定处死动物，取出受损部脊髓，在40g.L-1的多聚甲醛中后固定24 h，冰冻切片，做常规HE染色。
1.4 数据分析及统计学处理
实验结果用
±表示。斜板实验及细胞计数结果的比较用ANOVA继以Newman-Keuls检验，运动评分和Ashworth 评分的比较用Mann-Whitney检验(两组间比较)或Kruskal-Wallis检验(多组间比较)。大鼠标记神经元计数与相应的斜板实验角度之间的相关性用线性回归方法分析。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 刺激参数的选择
在预实验中证实，大鼠脊髓损伤的严重程度随着电流强度的增大和通电时间的延长而加重。经过反复摸索，证实1mA210s 的损毁参数，既能较成功地诱导出大部分动物的截瘫，又不会造成严重的尿潴留、全身衰竭等情况，因此在正式实验中选择这一参数进行损伤模型制作。
2.2 脊髓损伤后不同时间的组织学变化
假手术组大鼠术后20min取受损脊髓做HE染色，横断面上可见不同程度的机械性损伤，伴有出血和炎性细胞浸润。损伤围绕在电极插入轨迹周围，电极尖端位于后索腹侧部靠近中线的部位(箭头所示)。术后1周到3周，可见出血逐渐吸收，损伤逐渐修复，至3周时脊髓基本恢复正常。电损毁组术后20min可见后索腹侧部有近似球形的空洞形成，空洞以电极尖端为中心，伴有出血、水肿和炎性细胞浸润；至1周时，脊髓内空洞更加明显，累及背侧索大部，包括双侧皮质脊髓束，出血、水肿有所减轻，整个脊髓体积有所缩小；2周到3周时出现大量胶质细胞增生，填充在空洞部(图1)。
, http://www.100md.com
Pictures a-d were taken from the sham-operation group, and e-h were from the electrolytic lesion group, from the left to the right shows 20 min (a, e), 1 week (b,f ), 2 week (c, g) and 3 week (f, h) of post-injury changes, respectively. Arrows point to the tip of the electrode. HE staining, ×40
图1 大鼠T10胸椎节段脊髓电解损伤后不同时间的组织学改变
Figure 1 The histology of electrolytic lesions
in adult rat spinal cord at the T10 vertebral level
, http://www.100md.com
2.3 脊髓损伤后不同时间行为学评估结果
脊髓损伤后不同时间的运动评分、Ashworth 评分及斜板实验结果如表1。由表中可看出，假手术组与电损毁组术前各项指标比较，无统计学意义。术后1周、2周、3周电损毁组较假手术组运动功能有明显下降，表现为运动评分降低，肌张力评分增高，斜板实验角度下降；各组分别与自身比较，假手术组术后各时间点与术前无统计学意义，电损毁组术后1周、2周、3周运动功能均较术前显著下降，术后各时间点之间的评分也无统计学意义。表1 脊髓损伤后不同时间的运动评分、Ashworth 评分及斜板实验角度
Table 1 The motor score ( M ), Ashworth score ( A ) and inclined plane angle
( I ) at different time of post-injury
Time, 百拇医药
Sham-operation group
Electrolytic-lesioned group
M
A
I
M
A
I
Pre-operation
4.0±0
0.2±0.1
71.6±0.5
, http://www.100md.com
4.0±0
0.2±0.1
71.2±0.6
1w
3.6±0.2
0.5±0.1
69.6±1.6
2.1±0.3**##
1.9±0.1**##
58.6±2.0**##
2w
, 百拇医药
3.8±0.1
0.6±0.2
71.2±1.3
2.6±0.2**##
1.8±0.2**##
60.5±2.0**##
3w
3.9±0.1
0.5±0.2
72.8±1.5
2.6±0.4**#
, 百拇医药
1.8±0.1**##
61.5±2.5**##
**P<0.01， compared with the sham-operation group； #P<0.05， ## P<0.01， compared with pre-operation. n=12～17.
2.4 HRP逆行示踪实验结果
正常大鼠腰膨大部注入HRP，存活3 d后灌注固定，脑片上可见大脑皮质运动区内标记细胞呈条带状分布(图2)。两组术后不同时间大脑运动皮层标记神经元计数结果如图3。由图中可知，电损毁组术后各时间点计数明显低于假手术组；两组分别与自身比较，术后不同时间计数无统计学意义。
, 百拇医药
图2 正常大鼠腰膨大部注入HRP后，大脑皮质运动区切片，示HRP逆行性标记的神经元胞体 ×100
Figure 2 The retrograde labeled neurons in brain motor cortex with HRP
injected in lumbar enlargement in normal rats. ×100
** P<0.01， compared with the sham-operation group.
图3 脊髓损伤后不同时间大脑运动皮层HRP标记细胞数变化
Figure 3 The HRP-labeled neuron counts in brain
, http://www.100md.com
motor cortex after spinal cord injury
2.5 相关分析结果
HRP标记神经元计数与相应的斜板实验角度间相关性不显著(P>0.05)。
3 讨论
脊髓损伤是一种严重创伤，全球每年约有100000新发患者，其典型表现为痉挛性截瘫，其中运动功能的障碍主要是由于皮质脊髓束、红核脊髓束等下行传导束的纤维受损，使得受损平面以下的脊髓运动神经元失去了上位中枢的支配和控制所致。本实验用电解损毁的方法，在T10胸椎节段脊髓处(位于脊髓腰膨大上方)插入损毁电极，电极尖端位于双侧皮质脊髓束之间，通电后由于电流的电解和产热作用，使得位于电极尖端周围的皮质脊髓束受损，造成双侧后肢的痉挛性瘫痪。这一模型可在一定程度上从病理改变和临床表现上模拟人类截瘫的运动系受损情况，为脊髓损伤后促进神经再生、改善运动功能等的研究提供了工具。
, 百拇医药
从本实验的结果可以看出，脊髓电损毁组大鼠的肌力减弱，肌张力增大，运动功能明显下降，且能持续至少3周以上。由于损毁范围相对局限，因此动物死亡率低(约为19%)，一般状况较好，不需特殊的术后护理。而且实验操作比较简便，电流强度和通电时间可由电刺激仪精确控制，减少了主观因素的干扰，克服了重物下落法人为干扰因素多、可重复性差的缺点。因此，模型的实用性及可靠性较强。
本实验所采用的方法与Mathers的电损毁方法有所不同。在Mathers的实验中，电极尖端位于大鼠脊髓一侧灰质中间带处，损毁电流强度0.1mA,持续30s，造成了同侧灰质Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ层的损害；3个月后观察，同侧白质背外侧索明显萎缩，大鼠一侧后肢运动评分降低，但斜板实验角度正常。我们在最初摸索适宜损毁参数时，也曾重复了Mathers的方法，但未能诱导出稳定的痉挛性瘫痪表现，这或许是由于动物的差异、观察时间的不同造成的。
本实验应用HRP逆行标记技术反映皮质脊髓束纤维受损的情况。大鼠皮质脊髓束从大脑皮层锥体细胞发出后，大部分在延髓交叉行于对侧脊髓后索腹侧部，小部分不交叉，行于同侧脊髓前索。如果脊髓皮质脊髓束纤维受损，使轴浆流中断，HRP就不能从末梢运输到胞体，也就无法使大脑运动皮层处的锥体细胞产生标记。
, 百拇医药
用线性回归分析方法发现，动物标记神经元计数与行为学指标(斜板实验角度)之间相关性不显著，分析其原因可能为：(1)实验中电解损毁除损伤了皮质脊髓束外，还累及了邻近传导束，如同样位于后索的薄、楔束等，它们的损伤也对运动功能产生了一定影响；(2)皮质脊髓束受损后，其它下行传导束，如红核脊髓束等的功能有一定的代偿性增强，这也在一定程度上影响了动物的行为学表现。具体机制有待进一步探讨。
* 国家自然科学基金(39600150)资助项目。
参考文献
1 Weirich SD, Cotler HB, Narayana PA, et al. Histopathologic correlation of magnetic resonance imaging signal patterns in a spinal cord injury model. Spine, 1990, 15: 630-638
, 百拇医药
2 周衍椒，赵轶千，王雨若主编. 生理学方法与技术.第1集. 北京：科学出版社，1987. 75-82
3 杜卓民等编译. 神经解剖学和传导束路追踪. 北京：科学出版社, 1987. 28-32,107-118
4 David AM, Robert JF. The electrolytic lesion as a model of spinal cord damage and repair in the adult rat. J Neurosci Meth, 1991, 38: 15-23
5 王平宇主编. 大白鼠中枢神经系统解剖学基础. 人民卫生出版社，1986. 188-192
6 Ashworth B. Preliminary trial of carisoprodal in multiple sclerosis. Practitioner, 1964, 192: 540
7 Nakamura M, Fujimura Y, Yato Y, et al. Changes in choline acetyltransferase activity and distribution following incomplete cervical spinal cord injury in the rat. Neuroscience, 1996, 75: 481-494
8 顾耀铭. 钨酸钠作为稳定剂的新的高灵敏的HRP-TMB法Ⅱ. 神经解剖学杂志，1991，1：124-129
(1999-03-02收稿), 百拇医药