亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与原发性高血压的关系

http://www.100md.com 《首都医科大学学报》 1999年第4期

     作者：高原原 詹思延 尹香君 胡永华 李立明

    单位：北京医科大学流行病教研室,北京 100083

    关键词：高血压；亚甲基四氢叶酸还原酶☆；限制性片段长度多态性

    北京医科大学学报990326 摘 要 目的：探讨上海社区人群亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因多态性与原发性高血压的关系。方法：用聚合酶链反应-限制性片段的多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术，检测127例原发性高血压及170例正常对照的MTHFR基因多态性。结果：MTHFR基因第677位核苷酸呈多态性，可分为3种类型：C/C、T/T、C/T。 原发性高血压病例组3种基因型频率为： C/C，34.6%； C/T，53.5%； T/T，11.8%。对照组中分别为36.5%；49.4%；14.1%。病例组与对照组T/T基因型频率无显著性差异。结论：在上海社区人群中，MTHFR基因多态性可能不是原发性高血压的危险因素。

    中国图书资料分类法分类号 R544.1

    The relationship between methylenetetrahydrofolate reductase

    polymorphism and risk of essential hypertension

    GAO Yuan-Yuan, ZHAN Si-Yan, YIN Xiang-Jun, HU Yong-Hua， LI Li-Ming

    (Department of Epidemiology, Beijing Medical University, Beijing 100083)

    ABSTRACT Objective: To explore the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) polymorphism and risk of essential hypertension among Shanghai community-based population. Methods: polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was carried out. Results:127 patients with essential hypertension and 170 control subjects were screened to assess the polymorphism in MTHFR. The frequency of three genotypes was C/C ( homozygous normal ), 34.6%; C/T ( heterozygous ), 53.5%; T/T (homozygous mutant ), 11.8% in patients and 36.5%; 49.4%; 14.1% in control subjects. Conclusion: No significant difference of the frequency of homozygous mutant genotype between patients and control subjects was found in this population. MTHFR polymorphism may not be associated with risk of essential hypertension.

    MeSH Hypertension Methylenetetrahydrofolate reductase^☆ Restriction fragment length polymorphism

    研究表明同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)血清浓度增高可能与高血压的发生有关^[1]。Hcy是含巯基氨基酸，它的一种代谢途径为再甲基化生成蛋氨酸，亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahy-drofolate reductase, MTHFR)是Hcy再甲基化的关键酶。近年来，Kang等^[2]报道MTHFR有一种不耐热的变异株，与Hcy血清浓度增高有关。目前，已克隆出MTHFR cDNA，并检出了一种常见的突变，即677位核苷酸C-至-T (丙氨酸-至-缬氨酸)突变。携带该突变等位基因T的纯合子个体，血清Hcy水平显著增高^[3]。这些研究的结果提示，MTHFR基因的突变可能与同型半胱氨酸水平增高及高血压的发生有关。本研究旨在探讨上海城市社区人群中，MTHFR基因多态性与原发性高血压的关系。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象

    对上海南市区某街道所有年龄在35～75岁的居民进行调查，共发现原发性高血压病例一万多人，用单纯随机抽样选取其中三千余例进行药物干预治疗。此次研究的病例是用系统随机抽样法，从以上三千多高血压病例中选取的。病例共127例，年龄(58±10)岁，其中男性67例，女性60例。高血压诊断标准依照1993年美国全国联合会关于高血压检出、评价和治疗的第5次报告，收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒张压≥90 mmHg。对照组为来自同一社区的健康人群，也采用系统随机抽样法选取，共170例，年龄(51±11)岁；其中男性72例，女性98例；经严格体检排除有心、脑血管疾病及糖尿病肾病病史者。样本量根据文献报道的MTHFR T/T基因型频率计算。两组成员均经过基线调查，包括吸烟、饮酒, 并检测体重指数(body mass index,BMI)和血浆总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride, TG) 、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDLC) 和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDLC)。所有研究对象空腹12 h取静脉血5 ml, 静置后离心，-20 ℃保存，供生化检测用；离心后试管内留下的血凝块亦于-20 ℃保存，用于各研究对象基因组DNA的提取。

    1.2 人基因组DNA的提取

    血凝块标本用等体积4%(体积分数)十六烷基三甲基溴化铵及蒸镏水室温处理10 min,各2次，离心后收集沉淀， 用60 μg^.L^-1蛋白酶K 37 ℃消化过夜，次日用常规酚、氯仿法提取DNA。

    1.3 PCR扩增MTHFR基因目的片段

    PCR反应引物由LTI公司合成，序列为

    5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′(exonic)

    5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′(intronic)

    PCR扩增条件: 94 ℃变性4 min后，94 ℃，30 s；62 ℃，45 s；共30个循环。PCR扩增仪为ERICOMP Power Block I，Taq酶购自北京鼎国生物公司。反应完成后，取5 μl，用20 g^.L^-1琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物的扩增情况，若在相应位置有清晰扩增条带，则进行酶切反应。

    1.4 PCR扩增产物限制性片段的长度多态性分析

    PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ 经37 ℃消化过夜后，25 g^.L^-1琼脂糖凝胶电泳检测。

    1.5 统计方法

    组间均数比较用t检验；组间频数比较用χ²检验。

    2 结果

    高血压病例组与对照组的吸烟率、饮酒率、体重指数、血脂水平的比较(表1)：高血压病例组的TC、LDLC水平显著高于对照组(P<0.05)， 其余指标(吸烟率、饮酒率、体重指数、TG、HDLC)的水平, 两组相比，无显著性差异。

    高血压病例组与对照组MTHFR 3种基因型频率及突变等位基因频率的比较：从所有研究对象的血凝块标本中提取模板DNA，用PCR反应成功地扩增出MTHFR基因的目的片段，其长度为198 bp, PCR扩增结果见图1。PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ 37 ℃消化过夜后，经琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外灯下观察到MTHFR基因第677位核甘酸表现多态性，可分为3种类型：仅有198 bp片段的带型，为纯合未突变型(C/C)；仅有175 bp片段的带型(酶切后应产生175 bp和23 bp两个片段，但后者已泳动至胶外)，为纯合突变型(T/T)；有198 bp和175 bp两个片段的带型，为杂合子型(C/T)。RFLP结果如图2。病例组与对照组按不同基因型可分为3组。病例组共127例，其中C/C基因型44例，占34.6%；C/T基因型68例，占53.5%；T/T基因型15例，占11.8%。对照组共170例，分别为62例(36.5%)；84例(49.4%)；24例(14.1%)。T/T基因型频率在病例组与对照组中相似，无显著性差异。突变等位基因T的频率，病例组为38.5%，对照组为31.8%。经χ²检验，P=0.95，说明病例组与对照组突变等位基因频率差异无显著性。

    3 讨论

    本研究结果表明，在上海城市社区人群中，MTHFR基因的杂合和纯合突变是很普遍的。在对照组中，MTHFR 3种基因型的频率分别为(C/C),36.5%;(C/T),49.4%;(T/T),14.1%;突变等位基因频率为31.8%;与Frosst等^[3]报告的114例未经选择的法裔加拿大人的相应基因型频率37%, 51%, 12%一致。本项研究的原发性高血压病例组，MTHFR 的T/T基因型频率与对照组差异无显著性，表明在本研究人群中，MTHFR基因第677位核甘酸的多态性不是原发性高血压的危险因素。

    高血压是冠心病、脑卒中的主要病因。近年来，我国高血压发病率和患病率都呈逐年上升趋势。高血压发病是遗传病因和环境因素相互作用的结果。在高血压高发人群中筛选高血压候选基因，有助于了解人群中具有遗传倾向的高危对象，以采取相应的预防措施。上海市南市区是高血压高发区，已取得该社区人群的基限资料及血标本，可进行高血压候选基因的筛选。

    表1 对照组、高血压病例组及高血压病例组不同基因型的比较(±s)

    Table 1 Comparison between control subjects, hypertension patients and genotype subgroups in patients (±s) Variables

    Smoking rate/%

    Drinking rate/%

    (>100 g/d)

    BMI/kg^.m^-2

    c/mmol^.L^-1

    TC

    TG

    HDLC

    LDLC

    Control

    28.2

    2.9

    24.1±3.0

    5.01±1.00

    1.4±0.9

    1.5±0.3

    2.86±0.85

    Patients

    24.4

    1.6

    24.0±2.7

    5.3±0.9^

    1.6±0.7

    1.4±0.4

    3.20±0.88^

    C/C

    18.2

    2.3

    23.6±2.5

    5.5±0.8

    1.6±0.8

    1.5±0.4

    3.28±0.77

    Patients C/T

    26.5

    1.5

    24.2±2.8

    5.3±1.0

    1.6±0.8

    1.4±0.3

    3.15±0.89

    T/T

    33.3

    0

    23.4±3.0

    5.3±1.2

    1.5±0.5

    1.5±0.4

    3.16±1.17

    ^*P<0.05, compared with control.

    图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

    Figure 1 Agarose electrophoresis for products of PCR amplification

    M: PGEM-3Zf (+)/HaeⅢ markers 1～5: products

    of PCR amplification of samples from No. 1 to No. 5

    图2 MTHFR基因限制性片段长度多态性分析

    Figure 2 Analysis of PCR-RFLP for MTHFR gene

    近年来，对Hcy血浆水平增高、MTHFR基因多态性与心血管疾病关系的研究多有报道，而与高血压发病的关系的研究，尚只见Nishio等^[4]的报道。Nishio等^[4]发现在129例日本中年男性中，MTHFR 3种基因型的频率分别为(C/C), 35%; ( C/T ), 54%; ( T/T ), 11%；高血压病例组与正常对照组相比，突变等位基因频率和3种基因型的频率无差异。我们对上海城市社区人群MTHFR基因多态性与原发性高血压的关系的研究，也有类似结果。

    国外的研究结果发现，当血浆叶酸质量浓度很低时(小于2.23 μg^.L^-1)，MTHFR基因是纯合突变型的，与纯合未突变型及杂合型的相比，Hcy血浆水平显著增高，而叶酸质量浓度高时，Hcy血浆水平则与MTHFR基因型无关。这种结果提示，Hcy血浆水平受遗传及环境(特别是营养因素)的影响，叶酸摄入水平较低时，MTHFR基因突变可导致血浆Hcy水平增高，而体内叶酸质量浓度较高时，MTHFR的这种普遍的遗传变异对血浆Hcy水平影响很小^[5～6]。考虑到高水平同型半胱氨酸可能与高血压发生有关，MTHFR基因多态性可能通过影响血浆Hcy水平，而对高血压的危险因素发生作用。所以，在高血压高发区，对人群MTHFR基因多态性与血浆Hcy水平、血浆叶酸浓度的关系，值得进一步探讨。

    “九五”国家科技攻关项目；

    ☆ 自由词。

    参考文献

    1 Sutton-tyrrell K. High homocysteine levels are independently related to isolated systolic hypertension in older adults. Circulation, 1997:96:1 745-1 749

    2 Kang SS, Passen EL, Ruggie N, et al. Thermolabile defect of methylene tetrahydrofolate reducatse in coronary artery disease. Circulation, 1993,88:1 463-1 480

    3 Frosst P, Blom HJ, Milos R, et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetra-hydrofolate reductase. Nat Genet, 1995,10:111-113

    4 Nishio H, Lee MJ, Fujii M, et al. A common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase gene among the Japanese population. Jpn J Hum Genet, 1996,41:247-251

    5 Ma J, Stampfer MJ, Hennekens CH, et al. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism, plasma folate, homocysteine, and risk of myocardial infarction in US physicians. Circulation, 1996,94:2 410-2 416

    6 Jaques PF, Bostom AG, Williams RR, et al. Relation between folate status, a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase, and plasma homocysteine concentrations. Circulation, 1996,93:7-9

    (1998-07-10收稿)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/29/66/574.htm