K-ras 基因第1外显子点突变与37例子宫内膜癌临床情况的关系
作者：周 蓉 桂黎明 魏丽惠 郭彩霞 富 琪 虞 幸
单位：北京医科大学人民医院妇科,北京 100044
关键词：子宫内膜肿瘤；遗传学；K-ras☆；点突变；基因；ras
北京医科大学学报990419 摘 要 目的：研究中国子宫内膜癌患者的瘤组织中K-ras基因第1外显子(含第12，13密码子)的突变率，以及突变与子宫内膜癌临床情况的关系，探讨K-ras基因突变在子宫内膜癌发生中的作用。方法：37例子宫内膜癌的石蜡和部分冰冻标本行PCR扩增K-ras基因第1外显子(含第12，13密码子)，经PCR-SSCP银染法检测突变。结果：37例子宫内膜癌患者中有12例存在K-ras基因突变，突变率为32.4%(12/37例)。FIGO分期Ⅲ期、组织类型为腺鳞癌的患者突变率较高，在细胞低分化、侵肌1/2以上和绝经后的患者中突变比例也较高。石蜡和冰冻组织标本结果一致。结论：K-ras基因突变率在日、美两国内膜癌患者中不同。该组患者中的突变率与日本相似，高于美国。说明此种差异不仅存在于日本和美国患者之间，可能也存在于亚洲人与北美洲人之间。不同的基因背景，生活条件及内源性和外源性雌激素作用可能对K-ras基因突变率有影响，并引起了不同的临床表现。
中国图书资料分类法分类号 R737.33
Relationships between the mutation of K-ras gene exon 1
and the clinical conditions of endometrial carcinoma
ZHOU Rong, GUI Li-Ming, WEI Li-Hui, GUO Cai-Xia, FU Qi, YU Xing
(Department of Gynecology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
ABSTRACT Objectives:To detect the mutation rate of exon 1 of the K-ras gene (including codons 12 and 13) and clinical significance of such mutations in Chinese patients suffering from endometrial carcinoma, to disclose the relationships between the mutation and the clinical history, the clinical states, as well as the prognosis. Methods: Surgical treatments were given to 37 cases of endometrial carcinoma. DNA's were extracted from the formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections (6 of them had frozen sections simultaneously) and then amplified by polymerase chain reaction (PCR) for K-ras gene exon 1 (including codons 12 and 13). Single strand conformation polymorphism (SSCP) with silver staining was taken to analyze the mutation. Results: 12 cases of endometrial carcinoma were found to have exon 1 mutation of K-ras with the mutant rate being 32.4%. There were statistically higher mutation rates in stage Ⅲ or adenosquamous type, and more cases were in low grade, myometrial invasion (over 1/2), and menopause. Similar results were obtained in paraffin-embedded and frozen sections. Conclusion: The mutation rates of K-ras oncogene in the Japanese and American were different as reported before. The mutation rate was similar to that of the Japanese and was more frequent than that of the American. It suggests: (1)Such difference may also exist between the Asian and American. (2)Different genetic background, living conditions and endogenous or exogenous estrogen may affect the mutation rate of K-ras oncogene, which possibly influence the different clinical and pathological conditions.
MeSH Endometrial neoplasms/genet K-ras☆ Point mutation Genes, ras
子宫内膜癌的发病率在全球范围内均有增高趋势，严重威胁广大妇女的健康。随着分子生物学技术的发展，90年代以来国外一些学者开始研究K-ras基因与子宫内膜癌的关系，并且发现日本和美国患者在该基因的突变率和突变特征上均有明显差异，而在基因与临床表现的关系上说法不一。本研究旨在了解我国子宫内膜癌患者中该基因的突变率及其与临床表现的关系，并与日、美两国患者比较。
1 材料与方法
1.1 临床资料
标本取自1993年9月～1997年8月于本院手术治疗的子宫内膜癌患者37例。
一般情况：平均发病年龄55.9岁(38～77岁)，16人未绝经。2例于术前接受双侧髂内动脉灌注化疗和腔内照射放疗2次。
组织类型：腺癌27例，腺鳞癌7例，腺棘癌2例，浆乳癌1例。
细胞分级：G111例，G213例，G313例。
侵肌深度：侵肌低于1/2的19例，侵肌1/2及以上18例。
手术分期(1988年FIGO)：Ⅰ期23例，Ⅱ期6例，Ⅲ期8例。术后根据病情常规放疗和激素治疗，随访4～21个月。
1.2 实验方法
子宫离体后制备石蜡标本37例，其中3例同时制备冰冻标本。
石蜡标本脱石蜡，加入DNA提取液Ⅱ[Tris.Cl (pH 7.6)10 mmol.L-1, 6.5 g.L-1 NP40，氯化钠150 mmol.L-1,氯化镁1.5 mmol.L-1]和蛋白酶K(200 mg.L-1)，裂解消化后得裂解液；冰冻标本加入RNA酶，DNA提取液Ⅰ[Tris.Cl (pH 8.0) 10 mmol.L-1，EDTA (pH 8.0) 0.1 mmol.L-1, 5 g.L-1 SDS，RNase A 20 mg.L-1]和蛋白酶K裂解消化后，酚/氯仿抽提得模板DNA。
聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段：在30 μl体系中，两个引物各1 μmol.L-1(上游5′ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT，下游5′CAAAGAATGGTCCTGGACCA，dNTP 80 μmol.L-1)，镁离子1.5 mmol.L-1，Taq DNA 聚合酶0.3 U，模板DNA 1 μl(或c-K-ras野生型基因探针0.025 μg)，预变性95 ℃，5 min。按变性94 ℃，45 s；退火50 ℃，45 s；延伸72 ℃，20 s，循环30次后，取5 μl扩增产物和1 μl上样缓冲液，80 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色鉴定产物(图1)。扩增片段156 bp，含K-ras基因第1外显子中第2～37密码子的碱基序列。必要时行二次扩增，条件同前。以上每次扩增均同时有1管不加模板的阴性对照。
1, the frozen section of No. 14; 2, the paraffin embedded section of No.14; 3, the control; 4, c-K-ras probe; M, marker PBR/Hae Ⅲ.
图1 K-ras基因第1外显子(含第12，13密码子)扩增基因片段
Figure 1 Screening for PCR products of exon 1
(including coden 12 and 13) of K-ras
单链构像多态性(SSCP)分析点突变：取PCR扩增产物20 μl，等体积加入变性载样缓冲液。加热变性10 min，快速置于冰上冷却60 min，稍离心，快速加样。80 g.L-1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，4 ℃恒温，100 V电压，4～6 h，以溴酚蓝到达阳极底边为止。银染显色(图2)。与野生型c-K-ras基因泳动条带不同者为阳性。
1,6, and 9 are the positive samples (the arrows showing the difference); 2,7, and 10 are the negative samples; 3,4, and 5 are the unsatisfied image for the low products of the amplification; 8 is the c-K-ras probe; M is the marker PBR/Hae Ⅲ.
图2 K-ras基因第1外显子(含第12，13密码子)
点突变检测结果(SSCP-银染)
Figure 2 The mutation of exon 1(including coden 12 and 13)
of K-ras (SSCP-silver stained)
1.3 统计分析
检测结果与临床资料(包括组织类型，细胞分化，临床分期，侵肌深度，绝经以及口服避孕药物等)进行χ2检验。
2 结果
37例子宫内膜癌中12例有c-K-ras基因第1外显子的点突变，突变率为32.4%。早期(Ⅰ，Ⅱ期)突变患者有8例，Ⅲ期突变患者有4例，P<0.05。
突变患者中腺癌5例(5/27, 18.5%)，腺鳞癌5例(5/7, 71.4%)，P<0.05。
在G3患者中突变率为46.2%(6/13例)，而G1～2患者中为16.7% (4/24例)。
侵肌深度在1/2及以上者有7例患者(7/18，38.9%)发生突变；小于1/2者有5例患者(5/19，26.3%)发生突变。
7例绝经患者(7/21，33.3%)检测出突变，3例未绝经患者(3/16，18.8%)检出突变。
在随访的4～21个月中，1例失访，其余全部存活。12例突变阳性患者中1例7个月后复发。
3 讨论
3.1 子宫内膜癌的发病现状
在过去20年里，子宫内膜癌的发病率持续上升。一般认为，子宫内膜癌的发病率以北美和北欧地区为高，而亚洲、中南美洲地区较低[1]。
我国目前尚缺乏此类病变的流行病学调查结果，根据中国医学科学院肿瘤医院和华西医科大学的调查资料，其发病趋势及与子宫颈癌的发病比例的改变与欧美一致[1]。
3.2 K-ras基因与子宫内膜癌的关系
3.2.1 K-ras基因突变在种族和地区的差异 在子宫内膜癌发病的高危因素上，绝经晚、无雌激素服用史者预后差。Parazzini[2]提到，美国的子宫内膜癌患者多数是围绝经期妇女，有激素应用史，病程中有内膜增生阶段，预后较好；而日本患者一般年龄偏大(≥60岁)，无激素使用史，预后差。我国北京协和医院统计108例患者，年龄范围为26～71岁，平均发病年龄53.3岁[1]。我院曾总结75例子宫内膜癌患者的统计资料显示，平均发病年龄54.7岁。一般认为它的平均发病年龄在55岁上下。本组病例平均发病年龄为56.1岁(38～77岁)。52岁或52岁以后绝经者患子宫内膜癌的危险比49岁以前绝经者增加5倍。绝经晚的妇女的后几年多半并无排卵，而只表明延长了雌激素作用的时间。这种非外源性雌激素所致内膜癌的5年生存率为84%，肿瘤分化差，恶性度高，预后不好；而外源性雌激素所致内膜癌则预后较好，分化好，分期早，侵肌浅，常合并增生，5年生存率较高，为94%[1]。K-ras基因是ras基因家族成员之一。到目前为止，鲜有文献报道K-ras基因突变与子宫内膜癌关系。国内尚未见有报道，国外有关研究是90年代以来主要由日本和美国科学家来完成的。一般认为K-ras基因突变只发生在瘤组织和增生组织中，正常组织中没有，且突变热点在第12密码子[3]。日本患者的K-ras基因突变率高于美国患者，二者突变率分别为21%～46%[4，5]和10%～15%[6，7，8]，有意思的是：两国患者不仅在突变率上存在差异，在突变特征上也有不同[4]。临床上日本患者多发病年龄大，无激素服用史，预后差；而美国患者多发病于围绝经期，有激素服用史，预后较好。两国患者在发病率，临床经过及预后存在差异，而他们之间K-ras基因突变特点不同似乎可从分子水平部分解释了这种差异。本文对37例子宫内膜癌目的基因片段的点突变进行分析。结果显示突变率为32.4%(12/37)。与Fujimoto等[4]得出的突变率22.2%大体一致，他们曾对日本的45例患者进行突变检测。而Caduff等[9]和Duggan[6]先后检测了112例和60例美国患者的突变情况，突变率分别为11.6%和15%。故本组实验检出的我国患者的突变率与日本患者相仿，而高出美国患者。
3.2.2 K-ras基因与子宫内膜癌临床情况的关系 一些研究表明K-ras基因突变与FIGO手术分期、细胞分化、侵肌深度无关[3，6，9]。在本组实验中FIGO手术分期为Ⅲ期、组织类型为腺鳞癌的患者突变率高，与早期患者及其它组织类型相比有统计学差异(P<0.05)。而且在突变人数的比例上，绝经后者(33.3%)高于未绝经者(18.8%)，细胞低分化者(46.2%)高于高、中分化者(16.7%)，侵肌深者(38.9%)高于侵肌浅者(26.3%)均无统计学差异，可能与样本量较小有关。在临床上分期晚，细胞分级差，侵肌深者一般预后不良。而这些患者在我们的实验中表现为K-ras基因突变率高，提示存在突变者预后较差，这与Mizuuchi等[8]对日本患者的检测结果一致，与Duggan等[6]对美国患者的检测不同。初步可以认为，不仅日、美两国子宫内膜癌患者存在差异，亚洲人种与北美人种之间似乎也存在这种差异。这种不同是否提示内源性雌激素和外源性雌激素在致子宫内膜癌上的机制不同，是否K-ras基因突变在不同人种的子宫内膜癌的发病机制上存在不同，而诱发基因突变的因素有待进一步探讨。加大样本量，进一步解释K-ras基因突变在子宫内膜癌发生机制中所处的地位是下一步需要解决的问题。
☆ 自由词。
参考文献
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(1998-07-13收稿)