甜菜碱对大鼠肝细胞膜表皮生长因子受体及其酪氨酸蛋白激酶的作用
作者：邱 阳 黄力新 贺师鹏
单位：北京医科大学生物物理学系，北京 100083
关键词：甜菜碱；药理学；蛋白质酪氨酸激酶；药物作用；受体；表皮生长因子
北京医科大学学报990405 摘 要 目的：研究甜菜碱对大鼠肝细胞膜表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体及其酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)活性的影响。方法：应用受体的放射配基结合分析法(radioligand binding assay of receptors，RBA)，比较实验组和对照组之间125I-EGF与其受体的结合情况；受体酪氨酸蛋白激酶活性测定法，以大鼠肝细胞膜可溶性蛋白为酪氨酸蛋白激酶来源，比较实验组和阴性组之间受体蛋白自身磷酸化作用的差异。结果：26 nmol.L-1～5.2 mmol.L-1的甜菜碱均能抑制正常大鼠肝细胞膜EGF受体与其配基的结合，这种抑制作用为非竞争性抑制；10与100 μmol.L-1的甜菜碱可激活酪氨酸蛋白激酶活性，而10 mmol.L-1的甜菜碱则抑制酪氨酸蛋白激酶活性。结论：甜菜碱可以抑制EGF受体与其配基的结合并影响EGF受体的酪氨酸蛋白激酶活性。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q26
The effect of betaine on epidermal growth factor receptor
and tyrosine protein kinase of rat liver cell membrane
QIU Yang, HUANG Li-Xin, HE Shi-Peng
(Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Objective: To study the effect of betaine on EGF receptor and its tyrosine protein kinase activity of rat liver cell membrane. Methods: Radioligand binding assay of receptor, comparing the binding of 125 I-EGF to its receptor between test groups and the control group; Receptor tyrosine protein kinase activity test, using the soluble proteins of rat liver cell membrane as the source of tyrosine protein kinase to compare the autophosphorylation difference between test groups and the negative group. Results: 26 nmol. L-1～5.2 mmol.L-1 betaine inhibited the binding of EGF receptor with EGF in a noncompetitive way, 10, 100 μmol.L-1 betaine stimulated TPK activity, but inhibited TPK activity when concentration was up to 10 mmol.L-1. Conclusion: Betaine can inhibit the binding of EGF receptor with EGF and affect TPK activity conspicuously.
, 百拇医药
MeSH Betaine/pharmacol Protein-tyrosine kinase/drug eff Receptors, epidermal growth factor
甜菜碱(betaine)也称为N-三甲基甘氨酸，是一个小分子的季胺，通常以盐酸盐的形式存在，临床上用作利胆剂。近年来，陆续发现甜菜碱还具有多种药理作用：可以取代山梨醇保护体外培养的肾髓质细胞抵抗高渗[1]；调节多种细胞对高渗的反应，大大缓解或消除由于高渗导致的DNA复制、蛋白质合成及细胞增殖速率的下降[2]， 并且抑制高渗介质诱导的HSP70基因的表达[3]。不仅如此，甜菜碱还可抑制L1210白血病细胞、肉瘤37及埃利希瘤等肿瘤细胞株的有丝分裂，当和维生素C的同分异构体D-异抗坏血酸联合作用时，这种抑制作用更为显著[4]。另外，甜菜碱还是一种甲基化试剂，可被细胞吸收并参与细胞内的甲基转移过程[5]。甜菜碱虽然具有多种引人注目的生理活性，但其作用机制仍不明确。我们在研究中药枸杞的生物学活性时曾发现，枸杞的10%(体积分数)乙醇提取液能与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)受体结合, 经分析鉴定，该提取液富含甜菜碱。为了进一步探明甜菜碱的作用机制，我们选择EGF受体及EGF受体酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)为研究对象，在离体条件下，考察甜菜碱对上述两者的作用，获得了有关甜菜碱作用机制的初步证据。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂
成年Wistar大鼠，体重250 g左右，由我校实验动物中心提供。甜菜碱、小鼠EGF(受体纯)、ATP购自Sigma公司；Na125I(3.7×107 Bq.ml-1)购自中国原子能研究所；[γ-32P]ATP(3.7×107 Bq.ml-1) 购自北京市亚辉生物医学工程公司；细胞膜制备液：50 ml 0.2 mol.L-1 Tris-HCl, 50 ml 4 mmol.L-1 EDTA, 50 ml 4 mmol.L-1 EGTA,17.5 g蔗糖混合加蒸馏水至200 ml即成；HEPES缓冲液：95.3 mg HEPES、2.51 mg MnCl2、6.5 mg BSA溶于5 ml蒸馏水中,4 ℃保存；ATP反应液： 临用前将0.1 ml ATP(50 mg.L-1)和0.1 ml[γ-32P]ATP(1.85×106 Bq.ml-1)混合，再加0.4 ml HEPES缓冲液即得；闪烁液：500 ml二甲苯中溶解2.5 g PPO、0.25 g POPOP,避光保存。
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1.2 方法
大鼠肝细胞膜EGF受体及可溶性EGF受体蛋白的制备： 大鼠断颈取血后，立即取肝，用生理盐水快速清洗，剪碎。加10倍量膜制备液，用内切式匀浆机匀浆3次，每次1 min，再用玻璃匀浆器匀浆3 min。匀浆液于4 ℃、2 500 r.min-1离心10 min,弃沉淀；上清液于4 ℃、5 000 r.min-1离心30 min，弃沉淀；取上清液于4 ℃、13 000 r.min-1离心60 min，弃上清；沉淀用不加蔗糖的膜制备液吹打使其悬浮后,再于4 ℃、13 000 r.min-1离心60 min，弃上清，沉淀分成2份，其中1份用不含蔗糖的膜制备液吹打使其悬浮,得大鼠肝细胞膜制剂，按每管1 ml分装,-70 ℃贮存。使用前稀释成一定浓度后即可用于EGF受体结合抑制实验。另一部分沉淀用20 mmol.L-1、pH 7.4的Tris-HCl(含有体积分数分别为1%、10%的Triton X-100和甘油)溶液吹打使其悬浮，室温放置20 min后，于4 ℃、38 000 r.min-1离心60 min，上清液中即含有可溶性EGF受体，将上清液按每管1 ml分装，-70 ℃贮存，临用前稀释成适当浓度。
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受体蛋白含量测定：用考马斯亮蓝比色法测定。吸取蛋白提取液0.3 ml，加入等量的2 mol.L-1 NaOH溶液，于70 ℃水浴保温30 min使溶液变为清亮，加入2.4 ml蒸馏水，取0.1 ml溶液进行比色。
125I-EGF的制备及其放射性比活度的测定：按Iodogen固相氧化法制备125I-EGF，放射性比活度的测定采用放射受体自身替代法，方法详见文献[6]。放射性比活度为8.64×1013 Bq.mmol-1。
EGF受体的结合抑制实验：0.4 ml EGF受体反应缓冲液[50 mmol.L-1、pH 7.4 Tris-HCl,1 mmol.L-1 EDTA,1 mmol.L-1 EGTA,1%(体积分数)BSA]中含50 μg肝细胞膜蛋白，625 Bq 125 I-EGF,甜菜碱的浓度在26 nmol.L-1到5.2 mmol.L-1之间。加甜菜碱的为实验组，不加甜菜碱的为对照组，非特异结合管(non-specific binding, NSB)中加入1 μg EGF。每一样品设3个平行管。反应液于25 ℃保温60 min，保温结束后将试管置冰水浴中终止反应，用细胞收集器将反应液迅速抽滤到玻璃纤维滤膜上[0.1%(体积分数)BSA预饱和],用0.05 mol.L-1 pH 7.4的PBS 15 ml冲洗滤膜(3×5 ml),除去游离的125I-EGF,用γ-计数仪测量各滤膜上的每分放射性计数(f/min-1),求出各样品的均值,按下式计算结合抑制率(%):
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[1-(f实验组-fNSB)/(f对照组-fNSB)]×100%
EGF受体结合反应的动力学实验：分A、B两组同时进行。A组：0.4 ml反应缓冲液[50 mmol.L-1、pH7.4 Tris-HCl, 1 mmol.L-1 EDTA, 1 mmol.L-1 EGTA,1%(体积分数)BSA]中含50 μg肝细胞膜蛋白，625 Bq 125 I-EGF以及不同量的EGF(0.03 ng～3.2 ng), 每个样品设3个平行管。B组： 0.4 ml 反应缓冲液中含 50 μg 肝细胞膜蛋白， 625 Bq 125 Ⅰ-EGF、2 mmol.L-1甜菜碱。每一样品设3个平行管，同时设空白组和非特异组(NSB)，加样完毕后的反应和测量过程与EGF受体的结合抑制实验相同。实验结果用双倒数作图法进行处理，求出甜菜碱对EGF受体的结合抑制常数Ki(mmol.L-1)。
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EGF受体的酪氨酸蛋白激酶活性测定：70 μl反应液中含20 μl HEPES缓冲液、25 μl可溶性肝细胞膜受体蛋白(100 mg.L-1)及不同浓度的甜菜碱。空白组不加甜菜碱和可溶性肝细胞膜蛋白，用20 mmol.L-1、pH 7.4 Tris-HCl(含有体积分数分别为1%、10%的Triton X-100和甘油)补足反应液体积；阳性组加入100 ng EGF；阴性组不加EGF。加样完毕后反应液置于25 ℃保温10 min，再置于0 ℃保温10 min后，加入30 μl ATP反应液(含2.78×104 Bq[γ-32P]ATP和0.75 μg ATP),准确反应5 min，随即加入20 μl、5 mol.L-1 HCl终止磷酸化反应。将反应液抽滤到Whatman 3#滤纸上,依次用0.01 mol.L-1焦磷酸钠(含100 g.L-1 TCA)10 ml、无水乙醇5 ml和无水乙醚3 ml冲洗滤纸。滤纸片用红外灯烘干后,置闪烁液中测量每分放射性记数。按下式计算甜菜碱对TPK的激活/抑制率(%)：
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{[(f实验组-f空白组)/(f阴性组-f空白组)]-1}×100%
2 结果
不同浓度的甜菜碱对EGF受体均有显著的结合抑制作用，见表1。
表1 甜菜碱对EGF-受体的结合抑制作用(
±s)
Table 1 Binding inhibition of betaine
on EGF receptor(±s) Sample
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n
f/min-1
inhibition
ratio(%)
Control
3
16 658±518
-
NSB
3
841±89
-
Betaine
, 百拇医药
26 nmol.L-1
3
15 000±175**＃
10.5
260 nmol.L-1
3
14 325±625*＃
14.7
2.6 μmol.L-1
3
, 百拇医药
14 785±465*＃
11.8
26 μmol.L-1
3
13 364±441**＃
20.8
260 μmol.L-1
3
13 755±814**＃
18.4
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2.6 mmol.L-1
3
13 622±455**＃
19.2
5.2 mmol.L-1
3
11 302±625***＃
33.9
*P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, vs control group; # P<0.05, compared between every two groups.
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甜菜碱对正常大鼠肝细胞膜EGF受体结合作用的抑制动力学试验表明,无甜菜碱存在时，EGF受体的解离平衡常数KD等于0.094 nmol.L-1、最大结合容量Bmax等于0.030 4 nmol.L-1；而加入2 mmol.L-1的甜菜碱之后，EGF受体的表观解离平衡常数KD表等于0.097 nmol.L-1,表观最大结合容量Bmax表等于0.024 1 nmol.L-1。即甜菜碱作用前后，EGF受体的解离平衡常数几乎不变，而最大结合容量则下降0.006 3 nmol.L-1，并且，用Linewear-Burk双倒数作图法得到的无甜菜碱时肝细胞膜EGF受体的双倒数方程直线和存在甜菜碱时肝细胞膜EGF受体的双倒数方程直线在坐标的横轴上交于一点。这一结果说明，甜菜碱对EGF受体的结合作用为非竞争抑制型，根据非竞争抑制型反应的公式计算出甜菜碱对EGF受体的结合抑制常数Ki等于6.45 mmol.L-1。
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甜菜碱对酪氨酸蛋白激酶的作用结果见表2。我们比较了EGF的膜受体与可溶性受体的自身磷酸化效率，结果说明可溶性受体蛋白的自身磷酸化水平比膜受体蛋白高约2.6倍，因此，EGF受体的TPK活性测定均采用可溶性肝细胞膜受体蛋白作为TPK来源。低浓度的甜菜碱(10和100 μmol.L-1)与TPK共同作用后,可使TPK活性显著升高，高浓度的甜菜碱(10 mmol.L-1)与TPK共同作用后,则显著抑制TPK活性，呈双相作用。
表2 不同浓度甜菜碱对TPK活性的影响(±s)
Table 2 Effects of betaine of different concentrations
on TPK activity (±s) Sample
, 百拇医药
n
f/min-1
activation
/inhibition
ratio(%)
blank
3
884±43
-
-EGF
3
1765±186
, 百拇医药
-
+EGF 100ng
3
2189±158
-
Betaine
10 μnmol.L-1
3
2285±77*#
+59.0
100 μnmol.L-1
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3
2145±103*#
+43.1
1 mmol.L-1
3
1949±29#
+20.8
10 mmol.L-1
3
1443±114*＃
-36.6
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“-” inhibition, “+” activation; * P<0.05， vs -EGF group; # P<0.05，compared between every two groups.
3 讨论
EGF受体广泛分布于上皮细胞，以肝细胞含量为最多,每个细胞约为8×104个受体，是细胞膜上的整合蛋白。据估计,细胞质膜上的受体总数仅占质膜蛋白的万分之一，采用RBA法定量检测EGF受体与配基的结合能力不仅特异性强，而且灵敏度高，是目前较为常用的方法。我们采用从大鼠肝中提取的肝细胞膜为EGF受体来源，获得了满意的实验效果，离体细胞膜可于-70 ℃保存2周左右，活性基本不变。由于取材方便，便于保存，使大鼠肝细胞膜成为EGF受体分析的理想选材，可广泛运用于中草药有效成分的筛选。
EGF受体具有TPK活性，在功能上，TPK不但参与生长因子等胞外信息的传递，还与细胞的癌变和增殖有关。对受体蛋白TPK活性的检测，一般来说有两种方法：一是分析受体蛋白催化自身分子中Tyr残基磷酸化(称为自身磷酸化)的能力；二是分析受体蛋白催化外源性底物中Tyr残基磷酸化的能力。后一种方法常用人工合成的含Tyr残基的多肽作为底物来测定EGF受体TPK活性[7]。我们的实验使用了第1种方法，并在George等[8]方法的基础上, 用去垢剂Triton X-100处理肝细胞膜，使EGF受体蛋白从细胞膜上溶解下来，经过超速离心后，去除与自身磷酸化无关的杂蛋白。实验表明，经过纯化的可溶性膜受体蛋白的自身磷酸化活性比未纯化的膜受体高2.6倍，所以，改进后的EGF受体TPK活性测定方法是一个简便、高效的方法。
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甜菜碱是一个相对分子质量为117的小分子内盐，在中药枸杞子中有较高含量。我们的实验证明，甜菜碱在26 nmol.L-1～5.2 mmol.L-1的广泛剂量范围内均可抑制125I-EGF与其受体的结合；同时，动力学实验表明，甜菜碱是通过非竞争性的方式抑制EGF受体与其配基的结合，不过，甜菜碱的这种抑制作用不算强(Ki等于6.45 mmol.L-1)。甜菜碱对EGF受体酪氨酸蛋白激酶的作用则较为复杂：在10 μmol.L-1和100 μmol.L-1的剂量条件下有很强的激活作用，随剂量升高，激活作用反而下降，当剂量达到10 mmol.L-1时，就出现了抑制作用。甜菜碱对EGF受体有结合作用，而且能够显著影响EGF受体的TPK活性，所以，我们可以初步断定，甜菜碱能够通过影响EGF受体与其配基的结合能力以及酪氨酸蛋白激酶的活性来调节细胞的生长状态，在低剂量条件下甜菜碱具有EGF受体激动剂的功效，而大剂量给药时甜菜碱则成为EGF受体拮抗剂。我们的实验不仅首次揭示了甜菜碱对EGF受体介导的信号传递系统的作用，而且也给中药枸杞子的进一步开发利用提供了有益的参考。
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近年来的研究发现，许多非肽化合物能够抑制肽类配基与其受体的结合并产生不同的影响。一些研究人员指出，这些非肽化合物常常不作用在受体的膜外功能区，而是作用在受体的跨膜功能区，导致受体的构象发生改变，从而抑制受体与其多肽配基的结合。非肽化合物的这种作用在通常情况下表现为竞争性抑制作用，但有时也表现为不可克服的或者称为非竞争性的抑制作用(insurmountable or noncompetitive inhibition)[9]。甜菜碱对EGF受体的作用可能就属于后者。至于甜菜碱在不同剂量条件下所表现出的对TPK的双相作用的机制，尚需进一步的研究。
国家自然科学基金(29372040)资助项目。
参考文献
1 Moriyama T, Carcia-Perez A, Olson AD, et al. Intracellular betaine substitutes for sorbitol in protecting renal medullary from hypertonicity. Am J Physiol， 1991,260(4 Pt 2): F494-F497
, 百拇医药
2 Petronini PG, De Angelis EM, Borghetti P, et al. Modulation by betaine of cellular responses to osmotic stress. Biochem J， 1992,282(Pt 1):69-73
3 Petronini PG, De Angelis EM, Borghetti P, et al. Effect of betaine on HSP70 expression and cell survival during adaption to osmotic stress. Biochem J， 1993,293(Pt 2):553-558
4 Freidel JF, Fardon JC, Tsuchiya Y, et al. In vitro effect of D-isoascorbic acid and betaine hydrate alone and in combination on normal and malignant cells. Exp Cell Biol， 1979,47:463-469
, 百拇医药
5 Hoffman RM. Altered methionine metabolism and transmethylation in cancer. Anticancer Res， 1985,5:1-30
6 贺师鹏,黄天贵,黄力新.表皮生长因子的Iodogen标记法与放射性比度测定.北京医科大学学报,1992,24:416
7 Levitzki A, Gazit A, Osherov N, et al. Inhibition of protein-tyrosine kinases by tyrphostins. Methods Enzymol, 1991, 201:347-361
8 Weiland GA， Molinoff PB. Quantitative analysis of drug-receptor interactions: Interaction of kinetic and equilibrium properties. Life Sci, 1981,29:313
9 Hunyada L, Balla T， Catt KG. The ligand binding site of the angio-tensin AT1 receptor. TIPS, 1996,17:135-140
(1998-08-26收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学生物物理学系，北京 100083
关键词：甜菜碱；药理学；蛋白质酪氨酸激酶；药物作用；受体；表皮生长因子
北京医科大学学报990405 摘 要 目的：研究甜菜碱对大鼠肝细胞膜表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体及其酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)活性的影响。方法：应用受体的放射配基结合分析法(radioligand binding assay of receptors，RBA)，比较实验组和对照组之间125I-EGF与其受体的结合情况；受体酪氨酸蛋白激酶活性测定法，以大鼠肝细胞膜可溶性蛋白为酪氨酸蛋白激酶来源，比较实验组和阴性组之间受体蛋白自身磷酸化作用的差异。结果：26 nmol.L-1～5.2 mmol.L-1的甜菜碱均能抑制正常大鼠肝细胞膜EGF受体与其配基的结合，这种抑制作用为非竞争性抑制；10与100 μmol.L-1的甜菜碱可激活酪氨酸蛋白激酶活性，而10 mmol.L-1的甜菜碱则抑制酪氨酸蛋白激酶活性。结论：甜菜碱可以抑制EGF受体与其配基的结合并影响EGF受体的酪氨酸蛋白激酶活性。
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中国图书资料分类法分类号 Q26
The effect of betaine on epidermal growth factor receptor
and tyrosine protein kinase of rat liver cell membrane
QIU Yang, HUANG Li-Xin, HE Shi-Peng
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ABSTRACT Objective: To study the effect of betaine on EGF receptor and its tyrosine protein kinase activity of rat liver cell membrane. Methods: Radioligand binding assay of receptor, comparing the binding of 125 I-EGF to its receptor between test groups and the control group; Receptor tyrosine protein kinase activity test, using the soluble proteins of rat liver cell membrane as the source of tyrosine protein kinase to compare the autophosphorylation difference between test groups and the negative group. Results: 26 nmol. L-1～5.2 mmol.L-1 betaine inhibited the binding of EGF receptor with EGF in a noncompetitive way, 10, 100 μmol.L-1 betaine stimulated TPK activity, but inhibited TPK activity when concentration was up to 10 mmol.L-1. Conclusion: Betaine can inhibit the binding of EGF receptor with EGF and affect TPK activity conspicuously.
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MeSH Betaine/pharmacol Protein-tyrosine kinase/drug eff Receptors, epidermal growth factor
甜菜碱(betaine)也称为N-三甲基甘氨酸，是一个小分子的季胺，通常以盐酸盐的形式存在，临床上用作利胆剂。近年来，陆续发现甜菜碱还具有多种药理作用：可以取代山梨醇保护体外培养的肾髓质细胞抵抗高渗[1]；调节多种细胞对高渗的反应，大大缓解或消除由于高渗导致的DNA复制、蛋白质合成及细胞增殖速率的下降[2]， 并且抑制高渗介质诱导的HSP70基因的表达[3]。不仅如此，甜菜碱还可抑制L1210白血病细胞、肉瘤37及埃利希瘤等肿瘤细胞株的有丝分裂，当和维生素C的同分异构体D-异抗坏血酸联合作用时，这种抑制作用更为显著[4]。另外，甜菜碱还是一种甲基化试剂，可被细胞吸收并参与细胞内的甲基转移过程[5]。甜菜碱虽然具有多种引人注目的生理活性，但其作用机制仍不明确。我们在研究中药枸杞的生物学活性时曾发现，枸杞的10%(体积分数)乙醇提取液能与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)受体结合, 经分析鉴定，该提取液富含甜菜碱。为了进一步探明甜菜碱的作用机制，我们选择EGF受体及EGF受体酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)为研究对象，在离体条件下，考察甜菜碱对上述两者的作用，获得了有关甜菜碱作用机制的初步证据。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂
成年Wistar大鼠，体重250 g左右，由我校实验动物中心提供。甜菜碱、小鼠EGF(受体纯)、ATP购自Sigma公司；Na125I(3.7×107 Bq.ml-1)购自中国原子能研究所；[γ-32P]ATP(3.7×107 Bq.ml-1) 购自北京市亚辉生物医学工程公司；细胞膜制备液：50 ml 0.2 mol.L-1 Tris-HCl, 50 ml 4 mmol.L-1 EDTA, 50 ml 4 mmol.L-1 EGTA,17.5 g蔗糖混合加蒸馏水至200 ml即成；HEPES缓冲液：95.3 mg HEPES、2.51 mg MnCl2、6.5 mg BSA溶于5 ml蒸馏水中,4 ℃保存；ATP反应液： 临用前将0.1 ml ATP(50 mg.L-1)和0.1 ml[γ-32P]ATP(1.85×106 Bq.ml-1)混合，再加0.4 ml HEPES缓冲液即得；闪烁液：500 ml二甲苯中溶解2.5 g PPO、0.25 g POPOP,避光保存。
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1.2 方法
大鼠肝细胞膜EGF受体及可溶性EGF受体蛋白的制备： 大鼠断颈取血后，立即取肝，用生理盐水快速清洗，剪碎。加10倍量膜制备液，用内切式匀浆机匀浆3次，每次1 min，再用玻璃匀浆器匀浆3 min。匀浆液于4 ℃、2 500 r.min-1离心10 min,弃沉淀；上清液于4 ℃、5 000 r.min-1离心30 min，弃沉淀；取上清液于4 ℃、13 000 r.min-1离心60 min，弃上清；沉淀用不加蔗糖的膜制备液吹打使其悬浮后,再于4 ℃、13 000 r.min-1离心60 min，弃上清，沉淀分成2份，其中1份用不含蔗糖的膜制备液吹打使其悬浮,得大鼠肝细胞膜制剂，按每管1 ml分装,-70 ℃贮存。使用前稀释成一定浓度后即可用于EGF受体结合抑制实验。另一部分沉淀用20 mmol.L-1、pH 7.4的Tris-HCl(含有体积分数分别为1%、10%的Triton X-100和甘油)溶液吹打使其悬浮，室温放置20 min后，于4 ℃、38 000 r.min-1离心60 min，上清液中即含有可溶性EGF受体，将上清液按每管1 ml分装，-70 ℃贮存，临用前稀释成适当浓度。
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受体蛋白含量测定：用考马斯亮蓝比色法测定。吸取蛋白提取液0.3 ml，加入等量的2 mol.L-1 NaOH溶液，于70 ℃水浴保温30 min使溶液变为清亮，加入2.4 ml蒸馏水，取0.1 ml溶液进行比色。
125I-EGF的制备及其放射性比活度的测定：按Iodogen固相氧化法制备125I-EGF，放射性比活度的测定采用放射受体自身替代法，方法详见文献[6]。放射性比活度为8.64×1013 Bq.mmol-1。
EGF受体的结合抑制实验：0.4 ml EGF受体反应缓冲液[50 mmol.L-1、pH 7.4 Tris-HCl,1 mmol.L-1 EDTA,1 mmol.L-1 EGTA,1%(体积分数)BSA]中含50 μg肝细胞膜蛋白，625 Bq 125 I-EGF,甜菜碱的浓度在26 nmol.L-1到5.2 mmol.L-1之间。加甜菜碱的为实验组，不加甜菜碱的为对照组，非特异结合管(non-specific binding, NSB)中加入1 μg EGF。每一样品设3个平行管。反应液于25 ℃保温60 min，保温结束后将试管置冰水浴中终止反应，用细胞收集器将反应液迅速抽滤到玻璃纤维滤膜上[0.1%(体积分数)BSA预饱和],用0.05 mol.L-1 pH 7.4的PBS 15 ml冲洗滤膜(3×5 ml),除去游离的125I-EGF,用γ-计数仪测量各滤膜上的每分放射性计数(f/min-1),求出各样品的均值,按下式计算结合抑制率(%):
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[1-(f实验组-fNSB)/(f对照组-fNSB)]×100%
EGF受体结合反应的动力学实验：分A、B两组同时进行。A组：0.4 ml反应缓冲液[50 mmol.L-1、pH7.4 Tris-HCl, 1 mmol.L-1 EDTA, 1 mmol.L-1 EGTA,1%(体积分数)BSA]中含50 μg肝细胞膜蛋白，625 Bq 125 I-EGF以及不同量的EGF(0.03 ng～3.2 ng), 每个样品设3个平行管。B组： 0.4 ml 反应缓冲液中含 50 μg 肝细胞膜蛋白， 625 Bq 125 Ⅰ-EGF、2 mmol.L-1甜菜碱。每一样品设3个平行管，同时设空白组和非特异组(NSB)，加样完毕后的反应和测量过程与EGF受体的结合抑制实验相同。实验结果用双倒数作图法进行处理，求出甜菜碱对EGF受体的结合抑制常数Ki(mmol.L-1)。
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EGF受体的酪氨酸蛋白激酶活性测定：70 μl反应液中含20 μl HEPES缓冲液、25 μl可溶性肝细胞膜受体蛋白(100 mg.L-1)及不同浓度的甜菜碱。空白组不加甜菜碱和可溶性肝细胞膜蛋白，用20 mmol.L-1、pH 7.4 Tris-HCl(含有体积分数分别为1%、10%的Triton X-100和甘油)补足反应液体积；阳性组加入100 ng EGF；阴性组不加EGF。加样完毕后反应液置于25 ℃保温10 min，再置于0 ℃保温10 min后，加入30 μl ATP反应液(含2.78×104 Bq[γ-32P]ATP和0.75 μg ATP),准确反应5 min，随即加入20 μl、5 mol.L-1 HCl终止磷酸化反应。将反应液抽滤到Whatman 3#滤纸上,依次用0.01 mol.L-1焦磷酸钠(含100 g.L-1 TCA)10 ml、无水乙醇5 ml和无水乙醚3 ml冲洗滤纸。滤纸片用红外灯烘干后,置闪烁液中测量每分放射性记数。按下式计算甜菜碱对TPK的激活/抑制率(%)：
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{[(f实验组-f空白组)/(f阴性组-f空白组)]-1}×100%
2 结果
不同浓度的甜菜碱对EGF受体均有显著的结合抑制作用，见表1。
表1 甜菜碱对EGF-受体的结合抑制作用(
±s)Table 1 Binding inhibition of betaine
on EGF receptor(
±s) Sample, http://www.100md.com
n
f/min-1
inhibition
ratio(%)
Control
3
16 658±518
-
NSB
3
841±89
-
Betaine
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26 nmol.L-1
3
15 000±175**＃
10.5
260 nmol.L-1
3
14 325±625*＃
14.7
2.6 μmol.L-1
3
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14 785±465*＃
11.8
26 μmol.L-1
3
13 364±441**＃
20.8
260 μmol.L-1
3
13 755±814**＃
18.4
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2.6 mmol.L-1
3
13 622±455**＃
19.2
5.2 mmol.L-1
3
11 302±625***＃
33.9
*P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, vs control group; # P<0.05, compared between every two groups.
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甜菜碱对正常大鼠肝细胞膜EGF受体结合作用的抑制动力学试验表明,无甜菜碱存在时，EGF受体的解离平衡常数KD等于0.094 nmol.L-1、最大结合容量Bmax等于0.030 4 nmol.L-1；而加入2 mmol.L-1的甜菜碱之后，EGF受体的表观解离平衡常数KD表等于0.097 nmol.L-1,表观最大结合容量Bmax表等于0.024 1 nmol.L-1。即甜菜碱作用前后，EGF受体的解离平衡常数几乎不变，而最大结合容量则下降0.006 3 nmol.L-1，并且，用Linewear-Burk双倒数作图法得到的无甜菜碱时肝细胞膜EGF受体的双倒数方程直线和存在甜菜碱时肝细胞膜EGF受体的双倒数方程直线在坐标的横轴上交于一点。这一结果说明，甜菜碱对EGF受体的结合作用为非竞争抑制型，根据非竞争抑制型反应的公式计算出甜菜碱对EGF受体的结合抑制常数Ki等于6.45 mmol.L-1。
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甜菜碱对酪氨酸蛋白激酶的作用结果见表2。我们比较了EGF的膜受体与可溶性受体的自身磷酸化效率，结果说明可溶性受体蛋白的自身磷酸化水平比膜受体蛋白高约2.6倍，因此，EGF受体的TPK活性测定均采用可溶性肝细胞膜受体蛋白作为TPK来源。低浓度的甜菜碱(10和100 μmol.L-1)与TPK共同作用后,可使TPK活性显著升高，高浓度的甜菜碱(10 mmol.L-1)与TPK共同作用后,则显著抑制TPK活性，呈双相作用。
表2 不同浓度甜菜碱对TPK活性的影响(
±s)Table 2 Effects of betaine of different concentrations
on TPK activity (
±s) Sample, 百拇医药
n
f/min-1
activation
/inhibition
ratio(%)
blank
3
884±43
-
-EGF
3
1765±186
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-
+EGF 100ng
3
2189±158
-
Betaine
10 μnmol.L-1
3
2285±77*#
+59.0
100 μnmol.L-1
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3
2145±103*#
+43.1
1 mmol.L-1
3
1949±29#
+20.8
10 mmol.L-1
3
1443±114*＃
-36.6
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“-” inhibition, “+” activation; * P<0.05， vs -EGF group; # P<0.05，compared between every two groups.
3 讨论
EGF受体广泛分布于上皮细胞，以肝细胞含量为最多,每个细胞约为8×104个受体，是细胞膜上的整合蛋白。据估计,细胞质膜上的受体总数仅占质膜蛋白的万分之一，采用RBA法定量检测EGF受体与配基的结合能力不仅特异性强，而且灵敏度高，是目前较为常用的方法。我们采用从大鼠肝中提取的肝细胞膜为EGF受体来源，获得了满意的实验效果，离体细胞膜可于-70 ℃保存2周左右，活性基本不变。由于取材方便，便于保存，使大鼠肝细胞膜成为EGF受体分析的理想选材，可广泛运用于中草药有效成分的筛选。
EGF受体具有TPK活性，在功能上，TPK不但参与生长因子等胞外信息的传递，还与细胞的癌变和增殖有关。对受体蛋白TPK活性的检测，一般来说有两种方法：一是分析受体蛋白催化自身分子中Tyr残基磷酸化(称为自身磷酸化)的能力；二是分析受体蛋白催化外源性底物中Tyr残基磷酸化的能力。后一种方法常用人工合成的含Tyr残基的多肽作为底物来测定EGF受体TPK活性[7]。我们的实验使用了第1种方法，并在George等[8]方法的基础上, 用去垢剂Triton X-100处理肝细胞膜，使EGF受体蛋白从细胞膜上溶解下来，经过超速离心后，去除与自身磷酸化无关的杂蛋白。实验表明，经过纯化的可溶性膜受体蛋白的自身磷酸化活性比未纯化的膜受体高2.6倍，所以，改进后的EGF受体TPK活性测定方法是一个简便、高效的方法。
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甜菜碱是一个相对分子质量为117的小分子内盐，在中药枸杞子中有较高含量。我们的实验证明，甜菜碱在26 nmol.L-1～5.2 mmol.L-1的广泛剂量范围内均可抑制125I-EGF与其受体的结合；同时，动力学实验表明，甜菜碱是通过非竞争性的方式抑制EGF受体与其配基的结合，不过，甜菜碱的这种抑制作用不算强(Ki等于6.45 mmol.L-1)。甜菜碱对EGF受体酪氨酸蛋白激酶的作用则较为复杂：在10 μmol.L-1和100 μmol.L-1的剂量条件下有很强的激活作用，随剂量升高，激活作用反而下降，当剂量达到10 mmol.L-1时，就出现了抑制作用。甜菜碱对EGF受体有结合作用，而且能够显著影响EGF受体的TPK活性，所以，我们可以初步断定，甜菜碱能够通过影响EGF受体与其配基的结合能力以及酪氨酸蛋白激酶的活性来调节细胞的生长状态，在低剂量条件下甜菜碱具有EGF受体激动剂的功效，而大剂量给药时甜菜碱则成为EGF受体拮抗剂。我们的实验不仅首次揭示了甜菜碱对EGF受体介导的信号传递系统的作用，而且也给中药枸杞子的进一步开发利用提供了有益的参考。
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近年来的研究发现，许多非肽化合物能够抑制肽类配基与其受体的结合并产生不同的影响。一些研究人员指出，这些非肽化合物常常不作用在受体的膜外功能区，而是作用在受体的跨膜功能区，导致受体的构象发生改变，从而抑制受体与其多肽配基的结合。非肽化合物的这种作用在通常情况下表现为竞争性抑制作用，但有时也表现为不可克服的或者称为非竞争性的抑制作用(insurmountable or noncompetitive inhibition)[9]。甜菜碱对EGF受体的作用可能就属于后者。至于甜菜碱在不同剂量条件下所表现出的对TPK的双相作用的机制，尚需进一步的研究。
国家自然科学基金(29372040)资助项目。
参考文献
1 Moriyama T, Carcia-Perez A, Olson AD, et al. Intracellular betaine substitutes for sorbitol in protecting renal medullary from hypertonicity. Am J Physiol， 1991,260(4 Pt 2): F494-F497
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2 Petronini PG, De Angelis EM, Borghetti P, et al. Modulation by betaine of cellular responses to osmotic stress. Biochem J， 1992,282(Pt 1):69-73
3 Petronini PG, De Angelis EM, Borghetti P, et al. Effect of betaine on HSP70 expression and cell survival during adaption to osmotic stress. Biochem J， 1993,293(Pt 2):553-558
4 Freidel JF, Fardon JC, Tsuchiya Y, et al. In vitro effect of D-isoascorbic acid and betaine hydrate alone and in combination on normal and malignant cells. Exp Cell Biol， 1979,47:463-469
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5 Hoffman RM. Altered methionine metabolism and transmethylation in cancer. Anticancer Res， 1985,5:1-30
6 贺师鹏,黄天贵,黄力新.表皮生长因子的Iodogen标记法与放射性比度测定.北京医科大学学报,1992,24:416
7 Levitzki A, Gazit A, Osherov N, et al. Inhibition of protein-tyrosine kinases by tyrphostins. Methods Enzymol, 1991, 201:347-361
8 Weiland GA， Molinoff PB. Quantitative analysis of drug-receptor interactions: Interaction of kinetic and equilibrium properties. Life Sci, 1981,29:313
9 Hunyada L, Balla T， Catt KG. The ligand binding site of the angio-tensin AT1 receptor. TIPS, 1996,17:135-140
(1998-08-26收稿), http://www.100md.com