C-型利钠利尿肽在球囊血管损伤中的作用*
作者：王晓红 林桂亭 李淑莲 彭旭 曹静 庞永正 唐朝枢
单位：王晓红 林桂亭 李淑莲 彭旭 曹静 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管病研究所；林桂亭 泌尿外科研究所,北京 100034
关键词：C-型利钠利尿肽☆；血管成形术；气囊；RNA；信使；代谢；内皮；血管；药物作用
北京医科大学学报990617 摘 要 目的：在大鼠主动脉球囊剥脱模型上观察血浆和主动脉组织C-型利钠利尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)的质量浓度和mRNA表达的动态变化及外源性CNP对大鼠球囊损伤后内膜生成的影响,以探讨CNP在再狭窄中的作用。方法:放射免疫法测定CNP质量浓度，RT-PCR测定CNP mRNA的表达。结果：发现大鼠球囊损伤后血浆CNP的质量浓度升高, 内膜剥脱后第3天、10天、21天,血浆CNP水平分别增高80.7%(P<0.01),43.5%(P<0.05)和27.5%(P<0.05),而主动脉组织CNP含量在损伤后第3天下降46.6%(P<0.05),第10天,21天和28天CNP含量分别增加2.8倍(P<0.01)、1.6倍(P<0.05)和0.82倍(P<0.05)。在血管损伤3天时CNP mRNA的表达减弱，而第10天和第21天CNP mRNA的表达明显增强。外源性CNP显著抑制球囊损伤后第7天和21天新生内膜的形成,内膜/中膜比值分别降低23%(P<0.05)和20%(P<0.05)。结论：CNP参与血管球囊损伤后的修复过程,可能是机体内源性抗血管再狭窄的因子之一。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R654.2-232
The role of C-type natriuretic peptide in balloon injury of rat aorta
WANG Xiao-Hong＃， LIN Gui-Ting， LI Shu-Lian， PENG Xu， CAO Jing， PANG Yong-Zheng, et al
(#Institute of Cardiovascular Diseases Research, the First Hospital,Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH C-type natriuretic peptide☆ Angioplasty， balloon RNA, messenger/metab Endothelium, vascular/drug eff
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To study the dynamic changes of C-type natriuretic peptide(CNP) in plasma and aortic tissues and the effect of exogenous CNP on intima/media (I/M) ratios in a model of balloon injury of rat aorta. Methods：CNP levels in plasma and aorta were determined by radioimmunoassay. CNP mRNA expression was measured by RT-PCR technique. Results: CNP levels in plasma were significantly increased by 80.7% (P<0.01), 43.5% (P<0.05) and 27.5% (P<0.05) 3 days, 10 days and 21 days after balloon injury, but its levels in aortic tissues were decreased by 46.6% (P<0.05) on day 3 and increased by 2.8 (P<0.01), 1.6 (P<0.05) and 0.82-fold (P<0.05) on day 10, day 21 and day 28 after balloon injury of rat aorta. In the meanwhile, CNP mRNA expression was also increased on day 10, day 21. Results also showed that the administration of CNP i.p. inhibited neointima formation. I/M ratios were decreased by 23%(P<0.05) and 20%(P<0.05) 7 days, and 21 days after balloon injury of rat aorta. Conclusion: CNP might be involved in the process of recovery after vascular endothelium-denudation and exogenous CNP suppressed the neointima formation.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:543-546)
再狭窄是成功的经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous coronary transluminal angioplasty, PTCA)后的严重并发症，其发生机制迄今尚未完全阐明，其中平滑肌细胞增殖和血管重塑起主要作用[1]。C-型利钠利尿肽(c-type natriuretic peptide, CVP)是近年发现的利钠利尿肽家族新成员，主要由内皮细胞产生。具有抑制平滑肌细胞增殖、迁移作用，并以自分泌和旁分泌的方式参与血管重塑过程[2～4]。但其在血管损伤中的病理生理意义尚未完全清楚。本实验在大鼠主动脉球囊剥脱模型上，观察了血浆和主动脉组织CNP含量和mRNA表达的动态变化，应用外源性CNP对术后血管内膜增厚的影响，以探讨CNP在再狭窄中的作用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
Wistar大鼠,由北京医科大学实验动物中心提供。CNP及CNP RIA kit为Phoenix Pharm.Inc (USA)产品。Trizol购自Clontech公司，PCR引物由赛百盛公司合成，Taq酶和逆转录酶(AMV)购自Promega公司。余为市售分析纯试剂。
1.2 大鼠主动脉内皮剥脱
体重300～380g的雄性Wistar大鼠，每千克体重40mg戊巴比妥钠i.p.麻醉，经左侧颈总动脉插入自制的2F球囊导管，至腹主动脉，注入0.1ml生理盐水扩张球囊，反复抽拉3次，剥脱主动脉内皮。实验分为3组：(1) 假手术对照组: 颈总动脉仅插入无球囊导管。(2)球囊剥脱组。(3)CNP处理组：CNP每千克体重0.5mg溶于2ml生理盐水中,在球囊剥脱后即可静脉滴注(1h内滴完),以后每天腹腔内注射相同剂量的CNP 1次, 直至术后第7天和21天处死，取主动脉测定内膜/中膜比值。另外一批球囊剥脱大鼠分别于术后3，10，21，28 d处死，取血，测定血浆CNP的放免活性；主动脉组织迅速取出，部分提取RNA和部分测定CNP的放免活性。
, 百拇医药
1.3 血浆和主动脉组织CNP的测定[5]
采用RIA kit测定血浆和动脉组织CNP,敏感度IC50为15 pg/tube,与α-ANP, BNP-45,endothelin-1 均无交叉反应。
1.4 总RNA的提取(Trizol法)
1 mg血管组织加入5 μl Trizol，组织匀浆，离心后取上清加入氯仿抽提异丙醇沉淀，乙醇洗涤后溶入RNase Free水中。提取的RNA经电泳鉴定未被降解，SDU-68型紫外分光光度计对RNA初步定量,测定A260/A280>1.8，260 nm测吸光度A值，调整RNA质量浓度为1 g.L-1。
1.5 RT-PCR
, 百拇医药
1.5.1 mRNA逆转录 取3 μg总RNA,Oligodt 1μl,双蒸水15μl在65℃变性10min，然后加入5×Buffer 5μl,dNTP 1μl,RNSin 0.5μl, AMV 0.5μl混匀，42℃下水浴1h，95℃灭活AMV。
1.5.2 PCR扩增 CNP PCR引物参照Hutchinson等[6]方法,上游引物为：5′-TGC TCG CGC TAC TCT CAC T-3′,下游引物为：5′-CGC TGC ACT AAC ATC CCA GAC CGC-3′(产物为356 bp)。反应条件：94℃变性5 min 94℃ 45 s—56℃ 30 s—72℃ 45 s，72℃延伸10 min，共30个循环，扩增产物用加溴化乙锭的琼脂糖电泳显影，β-actin作为CNP mRNA定量的内参对照同时被扩增。
1.5.3 电泳鉴定 配加了溴化乙锭的15 g.L-1琼脂糖凝胶板，取PCR扩增产物20 μl,加入溴酚蓝上样液2 μl后上样，稳压电泳(7 V/cm)约50 min，紫外灯下观察、摄影。
, 百拇医药
1.5.4 图像分析 结果进行计算机图像分析，测定各个条带的灰度值，将各组所得CNP图像灰度值/β-actin的图像灰度值,求得数据结果。
1.6 内膜/中膜比值的测定
取胸主动脉组织,10%(体积分数)甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色。在显微镜下观察血管形态的变化。计算机图像分析(Sigma Scan 软件),计算内膜平均厚度和内膜/中膜(I/M)比值。
1.7 数据处理
实验结果以
±s表示, 统计处理采用one-way ANOVA和Student-Newman-keuls' t检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 球囊损伤大鼠血浆CNP含量的动态变化
对照组血浆CNP质量浓度为(13.2±1.1)μg.L-1, 在血管内皮剥脱后第3，10，21天，血浆CNP的质量浓度分别升高80.7%(P<0.01),43.5%(P<0.05)和27.5%(P<0.05)，在损伤后28天血浆CNP的水平恢复接近对照(图1)。
*P<0.05, **P<0.01 compared with control; A, control; B, balloon-3 d; C, balloon-10 d; D, balloon-3 w; E, balloon-4 w.
图1 球囊血管损伤大鼠血浆CNP活性的动态变化(±s, n=6)
, http://www.100md.com
Figure 1 The dynamics of CNP-ir activity in plasma
after balloon angioplasty of rat (±s, n=6)
2.2 球囊损伤大鼠动脉组织CNP的动态变化
对照组大鼠主动脉组织CNP含量为每毫克蛋白(1.18±0.11) pg，血管内皮剥脱后的第3天，主动脉组织的CNP含量比对照组低46.6%(P<0.05),第10天、21天和28天主动脉组织CNP含量分别比对照组高2.8倍(P<0.01)、1.6倍(P<0.05)和0.82倍(P<0.05)，见图2。
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*P<0.05, **P<0.01 compared with control; A, control; B,balloon-3 d; C,balloon-10 d; D, balloon-3 w; E, balloon-4 w.
图2 球囊损伤大鼠主动脉CNP活性的动态变化(±s, n=6)
Figure 2 The dynamics of CNP-ir activity in aorta
after balloon angioplasty of rat (±s, n=6)
2.3 球囊损伤大鼠主动脉组织CNP表达的动态变化
, 百拇医药
对照组大鼠主动脉组织CNP mRNA有表达，球囊拉伤3 d后CNPmRNA的表达明显减弱，10 d和21 d CNP mRNA的表达明显增强，见图3。
M, marker, C, control; *P<0.05, **P<0.01 compared with control; bar graph represents CNP mRNA levels normalized to β-actin.
图3 球囊损伤后大鼠CNPmRNA表达的动态变化(±s, n=6)
Figure 3 The dynamics of CNP mRNA expression in aorta
, 百拇医药
after balloon angioplasty of rat (±s, n=6)
2.4 外源性CNP对大鼠主动脉球囊损伤内膜/中膜比值的影响
正常大鼠主动脉内皮细胞和内弹力层之间无细胞存在，球囊损伤后可见明显的新生内膜形成。球囊损伤后的第7天、21天内膜的平均厚度分别为(16.3±1.1)μm和 (22.2±1.4)μm, 内膜和中膜的比率分别是17.6%和23.0%,与球囊剥脱组相比较,CNP治疗显著抑制球囊剥脱后新生内膜的形成,内膜/中膜比值分别低22%(P<0.05)和20%(P<0.05),见表1。
表1 CNP对大鼠主动脉球囊损伤后内膜/中膜的影响(±s, n=6)
, 百拇医药
Table 1 The effect of CNP on intima/media after balloon injury
of rat aorta (±s, n=6)
Mean Thickness
d(intima)/
μm
d(media)/
μm
d(intima)/
d(media)(%)
, http://www.100md.com
Control
1 w
0
96.8±5.3
-
3 w
0
99.2±5.2
-
Balloon
1 w
16.3±1.1
92.7±5.5
, 百拇医药
17.6±2.0
3 w
22.2±1.4
96.4±6.7
23.0±2.2
CNP
1 w
12.6±2.2
91.6±4.5
13.8±1.6#
3 w
18.4±1.2#
, 百拇医药
99.8±6.2
18.4±2.0#
#P<0.05, compared with balloon alone group; d,thickness.
3 讨论
1990年Sudoh等[7]从猪的脑组织中分离出一种利钠利尿肽新成员，由22个氨基酸组成，广泛分布于中枢神经系统、肾上腺髓质、小肠和肾脏。血管内皮细胞是其产生的主要部位。CNP具有舒张血管，抑制平滑肌细胞增殖和迁移等广泛的心血管效应。最近资料报道，CNP可抑制血管紧张素诱导的纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor, PAI)的活性和mRNA的表达[8]，表明CNP还具有抗血栓形成作用。但CNP在血管损伤中的意义尚不完全清楚。
, 百拇医药
本工作发现，大鼠血管球囊损伤后，血浆和主动脉组织CNP的含量及表达均有显著变化。其中血浆浓度在球囊剥脱后增加，3d 时最明显，以后逐渐下降，28d时血浆浓度逐渐恢复到正常。主动脉组织CNP含量及mRNA表达在球囊剥脱3d时减少，以后逐渐升高。表明CNP可能参与血管修复过程。血管组织生成和释放许多自分泌或旁分泌活性因子，参与血管功能和结构的调节，部分因子如内皮素、血管紧张素和某些生长因子等，刺激和促进再狭窄的发展，而某些因子(如NO、降钙素基因相关肽等)则能抑制再狭窄的发生[2]。本实验早期应用CNP可抑制新生内膜的形成，表现为内膜与中膜的比值显著降低。上述结果提示，CNP在血管球囊损伤后具有保护作用，可能是内源性抗损伤因素之一。
关于CNP在球囊血管损伤中的变化机制尚不完全清楚。CNP释放受许多因素的调节，细菌脂多糖、炎症因子(如肿瘤坏死因子和白介素1等)增加培养内皮细胞CNP mRNA表达[9]。推测是损伤后应激及炎症刺激，促进CNP由其它非内皮剥脱部位释放到血液的结果。而主动脉球囊损伤后3d，CNP的含量及mRNA的表达均降低，可能与内皮剥脱尚未修复有关。Brown等[10]应用免疫组化法和RT-PCR等技术研究发现，血管球囊损伤后14 d，新生内膜可自分泌CNP。本工作发现血管损伤后10 d和21 d主动脉组织CNP含量及mRNA的表达增高，可能是由于新生内膜产生CNP增多的缘故。
, 百拇医药
外源性CNP抑制内膜增厚的机制可能与下列因素有关:(1)CNP抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移[9，11];(2)CNP具有舒张血管的作用;(3)CNP可抑制血栓形成[8];(4)CNP抑制细胞外基质形成;(5)CNP抑制促增殖因素的释放[2]。
血管损伤后，主动脉组织CNP含量及表达升高，外源性CNP可抑制内膜的增厚，推测CNP的自身保护机制防止内膜的过度增殖，对于探寻再狭窄防治具有潜在的临床意义。
*国家自然科学基金(39730220)资助课题； “九五”国家科技攻关项目(96-906-02-07)；
参考文献
1 Libby P, Tanaka H. The molecular bases of restenosis. Prog Cardiovas Dis, 1997, 40(2): 97-106
, 百拇医药
2 Barr CS, Rhodes P, Struthers AD. C-type natriuretic peptide. Peptides, 1996, 17(7): 1243-1251
3 Shinomiya M, Tashiro J, Saito Y, et al. C-type natriuretic peptide inhibits intimal thickening of rabbit carotid artery after balloon catheter injury. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 205(2):1051-1056
4 Matuo H, Furuya M . C-type natriuretic protein inhibits intimal thickening after vascular injury. Ann N Y Acad Sci, 1997, 811:45-47
, 百拇医药
5 Minamino N, Kangawa K, Matuso H. N-terminally extended form of C-type natriuretic peptide (CNP-53) identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 170:973-979
6 Hutchinson HG, Trindade PT, Cunanan DB, et al. Mechanism of natriuretic peptide-induced growth inhibition of vascular smooth muscle cells. Cardiovas Res, 1997, 35(1): 158-167
7 Sudoh T, Minamino N, Kangawa K， et al. C-type natriuretic peptide (CNP): A new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 168:863-870
, http://www.100md.com
8 Bouchie JL, Hansen H, Feener EP. Natriuretic factors and nitric oxide suppress plasminogen activator inhibitor expression in vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1998,18: 1771-1779
9 Barr CS, Cargill RI, Coutie WJ， et al. C-type natriuretic peptide in heart failure and pulmonary heart disease. Br Heart J, 1994, 71: 73 (abstract)
10 Brown J, Chen Q, Hong GZ, et al. An autocrine system for C-type natriuretic peptide within rat carotid neointima during arterial repair. Am J Physiol, 1997,272 (Heart Cir Physiol.41): H2919-H2931
11 王晓红,薛 林，佟俐家,等.血管活性肽对同型半胱氨酸刺激平滑肌细胞增殖的实验研究.中华医学杂志， 1999，79(6):411-414
(1999-08-31收稿), http://www.100md.com
单位：王晓红 林桂亭 李淑莲 彭旭 曹静 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管病研究所；林桂亭 泌尿外科研究所,北京 100034
关键词：C-型利钠利尿肽☆；血管成形术；气囊；RNA；信使；代谢；内皮；血管；药物作用
北京医科大学学报990617 摘 要 目的：在大鼠主动脉球囊剥脱模型上观察血浆和主动脉组织C-型利钠利尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)的质量浓度和mRNA表达的动态变化及外源性CNP对大鼠球囊损伤后内膜生成的影响,以探讨CNP在再狭窄中的作用。方法:放射免疫法测定CNP质量浓度，RT-PCR测定CNP mRNA的表达。结果：发现大鼠球囊损伤后血浆CNP的质量浓度升高, 内膜剥脱后第3天、10天、21天,血浆CNP水平分别增高80.7%(P<0.01),43.5%(P<0.05)和27.5%(P<0.05),而主动脉组织CNP含量在损伤后第3天下降46.6%(P<0.05),第10天,21天和28天CNP含量分别增加2.8倍(P<0.01)、1.6倍(P<0.05)和0.82倍(P<0.05)。在血管损伤3天时CNP mRNA的表达减弱，而第10天和第21天CNP mRNA的表达明显增强。外源性CNP显著抑制球囊损伤后第7天和21天新生内膜的形成,内膜/中膜比值分别降低23%(P<0.05)和20%(P<0.05)。结论：CNP参与血管球囊损伤后的修复过程,可能是机体内源性抗血管再狭窄的因子之一。
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中国图书资料分类法分类号 R654.2-232
The role of C-type natriuretic peptide in balloon injury of rat aorta
WANG Xiao-Hong＃， LIN Gui-Ting， LI Shu-Lian， PENG Xu， CAO Jing， PANG Yong-Zheng, et al
(#Institute of Cardiovascular Diseases Research, the First Hospital,Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH C-type natriuretic peptide☆ Angioplasty， balloon RNA, messenger/metab Endothelium, vascular/drug eff
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ABSTRACT Objective: To study the dynamic changes of C-type natriuretic peptide(CNP) in plasma and aortic tissues and the effect of exogenous CNP on intima/media (I/M) ratios in a model of balloon injury of rat aorta. Methods：CNP levels in plasma and aorta were determined by radioimmunoassay. CNP mRNA expression was measured by RT-PCR technique. Results: CNP levels in plasma were significantly increased by 80.7% (P<0.01), 43.5% (P<0.05) and 27.5% (P<0.05) 3 days, 10 days and 21 days after balloon injury, but its levels in aortic tissues were decreased by 46.6% (P<0.05) on day 3 and increased by 2.8 (P<0.01), 1.6 (P<0.05) and 0.82-fold (P<0.05) on day 10, day 21 and day 28 after balloon injury of rat aorta. In the meanwhile, CNP mRNA expression was also increased on day 10, day 21. Results also showed that the administration of CNP i.p. inhibited neointima formation. I/M ratios were decreased by 23%(P<0.05) and 20%(P<0.05) 7 days, and 21 days after balloon injury of rat aorta. Conclusion: CNP might be involved in the process of recovery after vascular endothelium-denudation and exogenous CNP suppressed the neointima formation.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:543-546)
再狭窄是成功的经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous coronary transluminal angioplasty, PTCA)后的严重并发症，其发生机制迄今尚未完全阐明，其中平滑肌细胞增殖和血管重塑起主要作用[1]。C-型利钠利尿肽(c-type natriuretic peptide, CVP)是近年发现的利钠利尿肽家族新成员，主要由内皮细胞产生。具有抑制平滑肌细胞增殖、迁移作用，并以自分泌和旁分泌的方式参与血管重塑过程[2～4]。但其在血管损伤中的病理生理意义尚未完全清楚。本实验在大鼠主动脉球囊剥脱模型上，观察了血浆和主动脉组织CNP含量和mRNA表达的动态变化，应用外源性CNP对术后血管内膜增厚的影响，以探讨CNP在再狭窄中的作用。
1 材料与方法
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1.1 材料
Wistar大鼠,由北京医科大学实验动物中心提供。CNP及CNP RIA kit为Phoenix Pharm.Inc (USA)产品。Trizol购自Clontech公司，PCR引物由赛百盛公司合成，Taq酶和逆转录酶(AMV)购自Promega公司。余为市售分析纯试剂。
1.2 大鼠主动脉内皮剥脱
体重300～380g的雄性Wistar大鼠，每千克体重40mg戊巴比妥钠i.p.麻醉，经左侧颈总动脉插入自制的2F球囊导管，至腹主动脉，注入0.1ml生理盐水扩张球囊，反复抽拉3次，剥脱主动脉内皮。实验分为3组：(1) 假手术对照组: 颈总动脉仅插入无球囊导管。(2)球囊剥脱组。(3)CNP处理组：CNP每千克体重0.5mg溶于2ml生理盐水中,在球囊剥脱后即可静脉滴注(1h内滴完),以后每天腹腔内注射相同剂量的CNP 1次, 直至术后第7天和21天处死，取主动脉测定内膜/中膜比值。另外一批球囊剥脱大鼠分别于术后3，10，21，28 d处死，取血，测定血浆CNP的放免活性；主动脉组织迅速取出，部分提取RNA和部分测定CNP的放免活性。
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1.3 血浆和主动脉组织CNP的测定[5]
采用RIA kit测定血浆和动脉组织CNP,敏感度IC50为15 pg/tube,与α-ANP, BNP-45,endothelin-1 均无交叉反应。
1.4 总RNA的提取(Trizol法)
1 mg血管组织加入5 μl Trizol，组织匀浆，离心后取上清加入氯仿抽提异丙醇沉淀，乙醇洗涤后溶入RNase Free水中。提取的RNA经电泳鉴定未被降解，SDU-68型紫外分光光度计对RNA初步定量,测定A260/A280>1.8，260 nm测吸光度A值，调整RNA质量浓度为1 g.L-1。
1.5 RT-PCR
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1.5.1 mRNA逆转录 取3 μg总RNA,Oligodt 1μl,双蒸水15μl在65℃变性10min，然后加入5×Buffer 5μl,dNTP 1μl,RNSin 0.5μl, AMV 0.5μl混匀，42℃下水浴1h，95℃灭活AMV。
1.5.2 PCR扩增 CNP PCR引物参照Hutchinson等[6]方法,上游引物为：5′-TGC TCG CGC TAC TCT CAC T-3′,下游引物为：5′-CGC TGC ACT AAC ATC CCA GAC CGC-3′(产物为356 bp)。反应条件：94℃变性5 min 94℃ 45 s—56℃ 30 s—72℃ 45 s，72℃延伸10 min，共30个循环，扩增产物用加溴化乙锭的琼脂糖电泳显影，β-actin作为CNP mRNA定量的内参对照同时被扩增。
1.5.3 电泳鉴定 配加了溴化乙锭的15 g.L-1琼脂糖凝胶板，取PCR扩增产物20 μl,加入溴酚蓝上样液2 μl后上样，稳压电泳(7 V/cm)约50 min，紫外灯下观察、摄影。
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1.5.4 图像分析 结果进行计算机图像分析，测定各个条带的灰度值，将各组所得CNP图像灰度值/β-actin的图像灰度值,求得数据结果。
1.6 内膜/中膜比值的测定
取胸主动脉组织,10%(体积分数)甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色。在显微镜下观察血管形态的变化。计算机图像分析(Sigma Scan 软件),计算内膜平均厚度和内膜/中膜(I/M)比值。
1.7 数据处理
实验结果以
±s表示, 统计处理采用one-way ANOVA和Student-Newman-keuls' t检验。2 结果
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2.1 球囊损伤大鼠血浆CNP含量的动态变化
对照组血浆CNP质量浓度为(13.2±1.1)μg.L-1, 在血管内皮剥脱后第3，10，21天，血浆CNP的质量浓度分别升高80.7%(P<0.01),43.5%(P<0.05)和27.5%(P<0.05)，在损伤后28天血浆CNP的水平恢复接近对照(图1)。
*P<0.05, **P<0.01 compared with control; A, control; B, balloon-3 d; C, balloon-10 d; D, balloon-3 w; E, balloon-4 w.
图1 球囊血管损伤大鼠血浆CNP活性的动态变化(
±s, n=6), http://www.100md.com
Figure 1 The dynamics of CNP-ir activity in plasma
after balloon angioplasty of rat (
±s, n=6)2.2 球囊损伤大鼠动脉组织CNP的动态变化
对照组大鼠主动脉组织CNP含量为每毫克蛋白(1.18±0.11) pg，血管内皮剥脱后的第3天，主动脉组织的CNP含量比对照组低46.6%(P<0.05),第10天、21天和28天主动脉组织CNP含量分别比对照组高2.8倍(P<0.01)、1.6倍(P<0.05)和0.82倍(P<0.05)，见图2。
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*P<0.05, **P<0.01 compared with control; A, control; B,balloon-3 d; C,balloon-10 d; D, balloon-3 w; E, balloon-4 w.
图2 球囊损伤大鼠主动脉CNP活性的动态变化(
±s, n=6)Figure 2 The dynamics of CNP-ir activity in aorta
after balloon angioplasty of rat (
±s, n=6)2.3 球囊损伤大鼠主动脉组织CNP表达的动态变化
, 百拇医药
对照组大鼠主动脉组织CNP mRNA有表达，球囊拉伤3 d后CNPmRNA的表达明显减弱，10 d和21 d CNP mRNA的表达明显增强，见图3。
M, marker, C, control; *P<0.05, **P<0.01 compared with control; bar graph represents CNP mRNA levels normalized to β-actin.
图3 球囊损伤后大鼠CNPmRNA表达的动态变化(
±s, n=6)Figure 3 The dynamics of CNP mRNA expression in aorta
, 百拇医药
after balloon angioplasty of rat (
±s, n=6)2.4 外源性CNP对大鼠主动脉球囊损伤内膜/中膜比值的影响
正常大鼠主动脉内皮细胞和内弹力层之间无细胞存在，球囊损伤后可见明显的新生内膜形成。球囊损伤后的第7天、21天内膜的平均厚度分别为(16.3±1.1)μm和 (22.2±1.4)μm, 内膜和中膜的比率分别是17.6%和23.0%,与球囊剥脱组相比较,CNP治疗显著抑制球囊剥脱后新生内膜的形成,内膜/中膜比值分别低22%(P<0.05)和20%(P<0.05),见表1。
表1 CNP对大鼠主动脉球囊损伤后内膜/中膜的影响(
±s, n=6), 百拇医药
Table 1 The effect of CNP on intima/media after balloon injury
of rat aorta (
±s, n=6)Mean Thickness
d(intima)/
μm
d(media)/
μm
d(intima)/
d(media)(%)
, http://www.100md.com
Control
1 w
0
96.8±5.3
-
3 w
0
99.2±5.2
-
Balloon
1 w
16.3±1.1
92.7±5.5
, 百拇医药
17.6±2.0
3 w
22.2±1.4
96.4±6.7
23.0±2.2
CNP
1 w
12.6±2.2
91.6±4.5
13.8±1.6#
3 w
18.4±1.2#
, 百拇医药
99.8±6.2
18.4±2.0#
#P<0.05, compared with balloon alone group; d,thickness.
3 讨论
1990年Sudoh等[7]从猪的脑组织中分离出一种利钠利尿肽新成员，由22个氨基酸组成，广泛分布于中枢神经系统、肾上腺髓质、小肠和肾脏。血管内皮细胞是其产生的主要部位。CNP具有舒张血管，抑制平滑肌细胞增殖和迁移等广泛的心血管效应。最近资料报道，CNP可抑制血管紧张素诱导的纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor, PAI)的活性和mRNA的表达[8]，表明CNP还具有抗血栓形成作用。但CNP在血管损伤中的意义尚不完全清楚。
, 百拇医药
本工作发现，大鼠血管球囊损伤后，血浆和主动脉组织CNP的含量及表达均有显著变化。其中血浆浓度在球囊剥脱后增加，3d 时最明显，以后逐渐下降，28d时血浆浓度逐渐恢复到正常。主动脉组织CNP含量及mRNA表达在球囊剥脱3d时减少，以后逐渐升高。表明CNP可能参与血管修复过程。血管组织生成和释放许多自分泌或旁分泌活性因子，参与血管功能和结构的调节，部分因子如内皮素、血管紧张素和某些生长因子等，刺激和促进再狭窄的发展，而某些因子(如NO、降钙素基因相关肽等)则能抑制再狭窄的发生[2]。本实验早期应用CNP可抑制新生内膜的形成，表现为内膜与中膜的比值显著降低。上述结果提示，CNP在血管球囊损伤后具有保护作用，可能是内源性抗损伤因素之一。
关于CNP在球囊血管损伤中的变化机制尚不完全清楚。CNP释放受许多因素的调节，细菌脂多糖、炎症因子(如肿瘤坏死因子和白介素1等)增加培养内皮细胞CNP mRNA表达[9]。推测是损伤后应激及炎症刺激，促进CNP由其它非内皮剥脱部位释放到血液的结果。而主动脉球囊损伤后3d，CNP的含量及mRNA的表达均降低，可能与内皮剥脱尚未修复有关。Brown等[10]应用免疫组化法和RT-PCR等技术研究发现，血管球囊损伤后14 d，新生内膜可自分泌CNP。本工作发现血管损伤后10 d和21 d主动脉组织CNP含量及mRNA的表达增高，可能是由于新生内膜产生CNP增多的缘故。
, 百拇医药
外源性CNP抑制内膜增厚的机制可能与下列因素有关:(1)CNP抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移[9，11];(2)CNP具有舒张血管的作用;(3)CNP可抑制血栓形成[8];(4)CNP抑制细胞外基质形成;(5)CNP抑制促增殖因素的释放[2]。
血管损伤后，主动脉组织CNP含量及表达升高，外源性CNP可抑制内膜的增厚，推测CNP的自身保护机制防止内膜的过度增殖，对于探寻再狭窄防治具有潜在的临床意义。
*国家自然科学基金(39730220)资助课题； “九五”国家科技攻关项目(96-906-02-07)；
参考文献
1 Libby P, Tanaka H. The molecular bases of restenosis. Prog Cardiovas Dis, 1997, 40(2): 97-106
, 百拇医药
2 Barr CS, Rhodes P, Struthers AD. C-type natriuretic peptide. Peptides, 1996, 17(7): 1243-1251
3 Shinomiya M, Tashiro J, Saito Y, et al. C-type natriuretic peptide inhibits intimal thickening of rabbit carotid artery after balloon catheter injury. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 205(2):1051-1056
4 Matuo H, Furuya M . C-type natriuretic protein inhibits intimal thickening after vascular injury. Ann N Y Acad Sci, 1997, 811:45-47
, 百拇医药
5 Minamino N, Kangawa K, Matuso H. N-terminally extended form of C-type natriuretic peptide (CNP-53) identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 170:973-979
6 Hutchinson HG, Trindade PT, Cunanan DB, et al. Mechanism of natriuretic peptide-induced growth inhibition of vascular smooth muscle cells. Cardiovas Res, 1997, 35(1): 158-167
7 Sudoh T, Minamino N, Kangawa K， et al. C-type natriuretic peptide (CNP): A new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 168:863-870
, http://www.100md.com
8 Bouchie JL, Hansen H, Feener EP. Natriuretic factors and nitric oxide suppress plasminogen activator inhibitor expression in vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1998,18: 1771-1779
9 Barr CS, Cargill RI, Coutie WJ， et al. C-type natriuretic peptide in heart failure and pulmonary heart disease. Br Heart J, 1994, 71: 73 (abstract)
10 Brown J, Chen Q, Hong GZ, et al. An autocrine system for C-type natriuretic peptide within rat carotid neointima during arterial repair. Am J Physiol, 1997,272 (Heart Cir Physiol.41): H2919-H2931
11 王晓红,薛 林，佟俐家,等.血管活性肽对同型半胱氨酸刺激平滑肌细胞增殖的实验研究.中华医学杂志， 1999，79(6):411-414
(1999-08-31收稿), http://www.100md.com