脓毒血症时大鼠心血管系统血红素加氧酶的变化*
作者：李玉明 刘俊昌 张敏 郑新程 吴立玲 时安云 伍贻经
单位：北京医科大学病理生理学教研室，北京 100083
关键词：毒血症；酶学；血红素氧化酶；代谢；心血管系统；酶学；乳酸脱氢酶；代谢
北京医科大学学报990605 摘 要 目的：探讨脓毒血症时心血管系统血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)的变化及作用。方法：盲肠结扎穿孔法复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型，术后9 h和18 h测血流动力学指标及血浆乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，取心、主动脉测HO活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，Northern Blot测HO-1mRNA表达。结果：早期组血流动力学指标及血浆LDH无明显变化，心脏与主动脉MDA含量分别增加60.3%和96.5%(P<0.05)，心脏HO活性比对照组升高72.1%(P<0.01)，主动脉HO活性无明显变化。晚期组血压降低、心功能下降，血浆LDH与组织MDA含量升高，心脏HO活性仍维持高水平，主动脉HO活性比早期组增加261%(P<0.01)。心脏HO-1 mRNA表达与HO活性变化趋势相同；早、晚期主动脉HO-1mRNA表达分别增加49.2%(P<0.05)和143%(P<0.01)。结论：脓毒血症时心脏与主动脉HO活性及HO-1 mRNA表达增加，但变化趋势不同；HO可能与早期机体的抗损伤机制和晚期低血压的形成有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R631.1-332
Alterations of heme oxygenase in cardiovascular system during sepsis
LI Yu-Ming, LIU Jun-Chang, ZHANG Min, ZHENG Xin-Cheng, WU Li-Ling, SHI An-Yun, et al
(Department of Pathophysiology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Toxemia/enzymal Heme oxygenase/metab Cardiovascular system/enzymal Lactate dehydrogenase/metab
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To study the alterations of heme oxygenase(HO) in cardiovascular system during sepsis. Methods: A rat sepsis model was induced by cecal ligation and puncture. In early and late sepsis, mean blood pressure(MBP)，left ventricular function parameters and blood plasma lactate dehydrogenase (LDH) were measured. Then HO activities and MDA contents of the heart and aorta were examined. HO-1 mRNA expression was examined by Northern Blot. Results: In early sepsis, HO activity in the heart increased by 72.1% (P<0.01)compared with control;while HO activity in the aorta， MBP， left ventricular function and blood plasma LDH had no significant changes. MDA contents in the heart and aorta increased by 60.3% and 96.5% respectively(P<0.05).In late sepsis,HO activity in the heart was still maintained at the high level while that in the aorta increased by 261% (P<0.01)compared with that in early sepsis. MBP,left ventricular function decreased and blood plasma LDH and MDA contents in the heart and aorta increased significantly (P<0.01).HO-1 mRNA expression in the heart was the same as the alteration tendency of HO activity but that in the aorta was increased by 49.2% (P<0.05) and 143% (P<0.01) respectively in early and late sepsis. Conclusion: HO activity and HO-1 mRNA expression in the heart and aorta are increased during sepsis and the inducable HO plays an important role during sepsis.In early sepsis HO can protect organs from injury but in late sepsis it may be one of the most important reasons for hypotension.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:497-500)
血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血红素代谢过程中的起始、限速酶，其生理功能为催化血红素降解，生成胆绿素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和亚铁。近年来的研究结果表明，HO的生物学效应并不局限于此，其催化产物同样具有重要的生物学功能，主要表现为胆绿素及其还原产物胆红素和亚铁的抗氧化损伤及CO的血管调节作用。可诱导型血红素加氧酶(HO-1)除受血红素调节外，在许多病理情况下均可被诱导产生[1]。脓毒血症系由革兰氏阴性菌感染所致,通过细菌壁释放的内毒素引起细胞因子及血管活性物质的产生,导致不同程度的心功能障碍和低血压。有研究表明HO-1表达增加可能具有抗内毒素血症作用[2]，但亦有学者发现，腹腔注射内毒素的大鼠主动脉HO-1mRNA表达增加,酶活性增强，提示内毒素性低血压与HO/CO通路的活性增强有关[3]。我们以盲肠结扎穿孔法复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型，系统地观察心脏与主动脉HO活性和HO-1mRNA表达的动态变化，并探讨HO在脓毒血症病理演变中的作用。
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1 材料与方法
1.1 试剂
氯高铁血红素(hemin)、氧化型辅酶Ⅱ(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADP)、三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane，TRIS]、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)、十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)均为Sigma产品;异硫氰酸胍为Promega产品、 α-32P-dCTP为北京亚辉生物工程公司产品，鼠HO-1cDNA探针(838 bp)由NIH衰老研究所龙西林惠赠。其它试剂均为市售分析纯。
1.2 动物模型
200～250g雄性Wistar大鼠(北京医科大学实验动物中心提供)15只，随机分为3组：(1)对照组(control)：除不进行盲肠结扎穿孔外，余同脓毒血症组，分别于术后9 h和18 h处死大鼠 (实验显示9 h与18 h对照组无区别,故合为一组)；(2)早期脓毒血症组(early sepsis)：盲肠结扎穿孔法复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型[4]，术后9h测平均动脉压(mean blood pressure, MBP)、心功能指标及血浆氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)，同时取心脏与主动脉测HO活性与MDA含量，提取总RNA、Northern 印迹杂交测HO-1mRNA表达；(3)晚期脓毒血症组(late sepsis)：术后18 h完成上述实验。
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1.3 血流动力学指标测定
血压与心功能测定：用四道生理记录仪(San.ei,日本)右颈总动脉插管测MBP、左室收缩压(left ventricular end-systolic pressure, LVESP)、舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)及左室内压最大变化速率(±dp/dtmax);留动脉血样，抗凝后于4℃保存。取心脏与主动脉，彻底清除残留血液后于液氮中保存。
1.4 生化指标测定
Lowry法测定蛋白浓度，硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量，乳酸基质法测定LDH活性。
HO(微粒体)提取及活性测定[5]：将组织剪碎，加3倍体积预冷的含蔗糖的Tris缓冲液，匀浆，10000r.min-1、4℃离心20min,取上清33500r.min-1、4℃离心(Backman,XL-90 )1h,弃上清、沉淀用0.1mol.L-1的磷酸钾缓冲液(pH7.4)溶解。利用硫酸铵沉淀、透析法从大鼠肝脏中提取胆绿素还原酶。HO活性测定反应体系中含HO 0.5mg、Hemin 20μmol.L-1、胆绿素还原酶4mg、NADP 0.8mmol.L-1、G-6-P 4mmol.L-1及G-6-PD 1U。反应体积1ml,最后避光加Hemin，于37℃水浴避光反应20 min后冰浴终止反应，分光光度法测定D463和D530(UV-260,日本)。胆红素消光系数40nm-1.cm-1，利用(D463- D530)×40÷1/2÷1/3计算1mg HO 1h催化血红素降解生成胆红素的nmol数，并以此来表示HO活性。
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1.5 Northern印迹杂交
用异硫氰酸胍裂解一步法提取心肌与主动脉平滑肌组织总RNA, RNA经甲醛变性凝胶电泳分离后转移至尼龙膜上，先预杂交，然后用α-32P-dCTP标记的鼠HO-1cDNA变性探针与固定在尼龙膜上的RNA进行杂交，按常规方法洗膜，于-20℃放射自显影。以图像分析仪(LEICA Q550IW，德国)测定各杂交带光密度值与面积，计算积分分光密度(I.D)，以对照组I.D为100%计算其它组I.D变化的百分比。
1.6 统计学处理
全部数据用
±s表示，采用One-way ANOVA软件分析进行组间比较，继而用q检验进行两组间的比较，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
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2.1 血流动力学变化(表1)
本实验中采用的大鼠腹膜炎脓毒血症模型血流动力学呈早期高动力(高代谢)和晚期低动力(低代谢)的双相变化,心脏舒缩功能也出现双相变化，早期心肌收缩力增强，血压无改变；晚期左室±dp/dtmax分别降低41.3%和40.4%(P<0.01),LVESP降低31.1%(P<0.05),LVEDP升高278.6%(P<0.01)，血压较对照组降低25%(P<0.05)，血流动力学变化趋势与文献报道一致。该模型很好地反映了临床上腹膜炎脓毒血症的血流动力学和代谢紊乱的变化过程，较单纯注射内毒素引起的脓毒血症更贴近临床实际。
表1 脓毒血症时平均动脉压、左室内压及最大变化速率的变化(±s)
Table 1 Alterations of mean blood pressure、left ventricular pressure and ±dp/dtmax during sepsis(±s) Group
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p(MBP)/kPa
p(LVESP)/kPa
p(LVEDP)/kPa
+dp/dtmax(kPa.s-1)
-dp/dtmax(kPa.s-1)
Control
16.4±0.8
16.6±0.8
0.70±0.11
349±17
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300±15
Early sepsis
16.5±0.9
16.8±0.9
0.67±0.10
410±15*
298±17
Late sepsis
12.5±0.6**
11.4±1.3*
2.65±0.34**
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205±9**
179±9**
n=5, *P<0.05， **P<0.01 vs control.
2.2 心血管系统生化指标变化(表2)
早期组血浆LDH无明显变化,而晚期组升高71.9%(P<0.01)。早期脓毒血症时心脏与主动脉MDA含量即开始增加(P<0.05)，晚期增加更为明显(P<0.01),与脓毒血症的病理演变过程一致。
表2 脓毒血症时血浆LDH及心脏与主动脉MDA含量的变化(±s)
Table 2 Alterations of blood plasma LDH and MDA contents in heart
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and aorta during sepsis(±s) Group
LDH(U.ml-1)
n(MDA contents)/nmol☆
Blood plasma
Heart
Aorta
Control
342±27
4.0±0.9
, 百拇医药
4.1±1.3
Early sepsis
376±24
6.4±1.6*
7.9±1.9*
Late sepsis
587±39**##
13.8±2.6**##
10.6±2.1**##
n=5, *P<0.05, **P<0.01 vs control； ##P<0.01 vs early sepsis； ☆per mg protein.2.3 心血管系统HO活性的变化(表3)
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脓毒血症早期，心脏HO活性比对照组升高72.1%(P<0.01)，而主动脉HO活性尚无明显变化。脓毒血症晚期心脏HO活性仍保持在早期时的高水平，而主动脉HO活性比早期组增加261%(P<0.01)。这表明，脓毒血症时心脏与主动脉HO活性均增加,但两者的变化规律不同；主动脉HO活性增加的高峰时间迟于心脏，但幅度远大于心脏。
2.4 心血管系统HO-1mRNA表达的变化
脓毒血症早期，心脏HO-1mRNA表达增加(P<0.01，表3和图1) ，晚期表达水平与早期相同，心脏HO-1mRNA表达的变化规律与心脏HO活性的变化趋势一致。主动脉HO-1mRNA表达在早期即已明显增加(P<0.05)，到晚期则显著增加(P<0.01)，这提示主动脉HO-1mRNA表达增加在时间上略早于HO活性的升高，HO活性的升高是由于大量诱导HO-1生成的结果。
表3 脓毒血症时心脏与主动脉HO活性与HO-1mRNA表达的变化(±s)
, 百拇医药
Table 3 Alterations of HO activity and HO-1mRNA expressions in heart and aorta during sepsis(±s) Group
Heme oxygenase activity(nmol.h-1)☆
HO-1mRNA expression (%)
Heart
Aorta
n
Heart
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Aorta
n
Control
30.7±2.7
16.1±2.6
5
100
100
3
Early sepsis
52.8±6.4**
19.2±3.0
, 百拇医药
5
147±12**
149±18*
3
Late sepsis
56.5±7.0**
69.2±7.2**##
5
49±6**
243±25**##
3
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*P<0.05， **P<0.01 vs control； ## P<0.01， vs early sepsis， ☆ per mg protein.
A，heart; B,aorta; 1,control; 2,early sepsis; 3,late sepsis.
图1 脓毒血症时心脏与主动脉HO-1 mRNA表达的变化
Figure 1 Alterations of HO-1 mRNA expressions in heart
and aorta during sepsis
3 讨论
, 百拇医药
近年来，HO以其催化产物的抗氧化损伤与生物调节作用日益受到人们的重视[1～3]。体内HO存在两种亚型,即HO-1和HO-2,二者分别为不同基因表达的产物。HO-1为可诱导型,是传统意义上的血红素加氧酶，其活性除受血红素调节外，缺氧、热休克及多种非血红素类物质也可诱导其产生,如重金属盐(铬盐、钴盐)、激素、内毒素及炎性细胞因子等。HO-2为结构型表达，其活性在生理状态下受糖皮质激素的调节，应激反应不能诱导其产生[6]。
脓毒血症时往往出现不同程度的心功能障碍与低血压，其形成机制一直是医学领域的研究热点和难点。Otterbein 等[2]给大鼠腹腔注射血红蛋白后发现肺HO-1mRNA表达增多，HO活性增强，注射致死剂量的内毒素后，大鼠100%存活，提示HO具有抗内毒素血症的作用；然而，Yet等[3]给大鼠腹腔注射内毒素后9 h，发现主动脉HO-1mRNA表达增多，HO活性增强，血压降低，用HO活性抑制剂锌原卟啉Ⅸ(Zn-protoporphyrin-Ⅸ, ZnPPⅨ)后血压回升，提示HO/CO通路活性增强参与内毒素性低血压的形成，在内毒素性休克的发生发展中起促进作用。关于脓毒血症时HO的变化规律及其在心血管系统中的综合作用报道甚少。
, 百拇医药
本实验以更贴近临床实际的腹膜炎脓毒血症的大鼠为模型，观察HO在心血管系统的动态变化。结果显示，脓毒血症时，心脏与主动脉HO活性增强，表明细菌内毒素等可激活HO活性，介导脓毒血症时的心血管系统功能调节。为探讨HO活性升高的机制，我们用Northern Blot检测了心脏与主动脉HO-1 mRNA的表达。结果表明，脓毒血症时HO-1 mRNA表达量增加，这提示HO活性的增加是由HO-1被诱导合成所致。此外，我们的结果还表明，在脓毒血症病理演变过程中，心脏与主动脉HO变化的规律是不同的。心脏HO-1mRNA表达在脓毒血症早期即明显升高并一直持续到晚期，与心脏HO活性的变化趋势一致。主动脉HO-1mRNA表达在早期虽已增加，但HO活性升高尚不明显；脓毒血症晚期，主动脉HO-1mRNA表达及HO活性呈急剧升高，即主动脉HO升高较心脏升高的晚，但其升高的程度却明显大于心脏。这可能与脓毒血症时心血管系统的功能变化有关。
HO对细胞的保护可能与其催化产物的抗氧化作用有关[1]。为了探讨心脏和主动脉HO变化与脓毒血症病理演进的关系，我们检测了血液动力学与反映器官损伤的血浆LDH及组织MDA含量等指标。结果显示，早期脓毒血症时MBP、血浆LDH无明显变化、+dp/dtmax升高提示心功能代偿性增强，心血管MDA含量仅轻度升高，这可能与心脏HO-1 mRNA表达增加，HO活性升高，催化血红素生成具有抗氧化损伤作用的胆红素、亚铁等有关。提示HO在早期脓毒血症时可能具有抗组织损伤和细胞保护作用，参与心血管系统功能的代偿和调节。随着脓毒血症的加重，心脏HO-1mRNA表达及HO活性虽基本保持早期时的水平，但已不足以对抗因内毒素和细胞因子等的增多对心肌的损伤，致使血浆LDH与心肌MDA含量明显增加，心脏收缩与舒张功能严重抑制，而血管HO-1mRNA表达的急剧增加与HO活性的大幅度升高导致平滑肌内源性CO生成增加，激活动脉平滑肌细胞膜上的鸟苷酸环化酶，增加细胞内cGMP的生成，减少细胞内的钙含量[7]，舒张血管平滑肌，使血压大幅度下降，造成器官低灌注，使损伤进一步加剧，终致HO催化产物的抗氧化损伤作用被掩盖。
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总之，脓毒血症时心血管系统HO活性升高，为HO-1mRNA表达增多所致。HO在脓毒血症病理演变过程中的作用不是一成不变的，随着病程的延长其作用方式会发生变化，早期可能与机体的抗氧化损伤机制有关，晚期则参与低血压的形成使器官损伤加重，可能为脓毒血症时心血管系统功能变化的机制之一，值得进一步探讨。
* 国家自然科学基金(39670308)资助项目。
参考文献
1 Choi AM, Alam J. Heme oxygenase: function, regulation, and implication of a novel stress-inducible protein in oxidant-induced lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol,1996,15:9-19
2 Otterbein L, Sylvester SL, Choi AM, et al. Hemoglobin provides protection against lethal endotoxemia in rats:the role of heme oxygenase-1. Am J Respir Cell Mol Biol,1995,13(5):595-601
, http://www.100md.com
3 Yet SF, Pellacani A, Patterson C, et al. Induction of heme oxgenase-1 in vascular smooth muscle cell.a link to endotoxic shock. J Biol Chem, 1997,272:4295-4301
4 Wichterman KA, Bauce AE, Chaudry IH. Sepsis and septic shock:a review of laboratory models and a proposal. J Surg Res,1980,29:189-201
5 Balla G, Jacob HS, Balla J, et al. Ferritin: a cytoprotective antioxidant stratagem of endothelium.J Biol Chem,1992,267:18148-18153
, 百拇医药
6 Bauer I,Wanner GA, Rensing H, et al. Expression pattern of heme oxygenase Isoenzymes1 and 2 in normal and stress-exposed rat liver. Hepatology, 1998,27:829-838
7 Mains MD. The heme oxygenase system:a regulator of second messenger gases. Annu Rev Pharmacol Toxicol,1997,37:517-554
(1999-09-15收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学病理生理学教研室，北京 100083
关键词：毒血症；酶学；血红素氧化酶；代谢；心血管系统；酶学；乳酸脱氢酶；代谢
北京医科大学学报990605 摘 要 目的：探讨脓毒血症时心血管系统血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)的变化及作用。方法：盲肠结扎穿孔法复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型，术后9 h和18 h测血流动力学指标及血浆乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，取心、主动脉测HO活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，Northern Blot测HO-1mRNA表达。结果：早期组血流动力学指标及血浆LDH无明显变化，心脏与主动脉MDA含量分别增加60.3%和96.5%(P<0.05)，心脏HO活性比对照组升高72.1%(P<0.01)，主动脉HO活性无明显变化。晚期组血压降低、心功能下降，血浆LDH与组织MDA含量升高，心脏HO活性仍维持高水平，主动脉HO活性比早期组增加261%(P<0.01)。心脏HO-1 mRNA表达与HO活性变化趋势相同；早、晚期主动脉HO-1mRNA表达分别增加49.2%(P<0.05)和143%(P<0.01)。结论：脓毒血症时心脏与主动脉HO活性及HO-1 mRNA表达增加，但变化趋势不同；HO可能与早期机体的抗损伤机制和晚期低血压的形成有关。
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中国图书资料分类法分类号 R631.1-332
Alterations of heme oxygenase in cardiovascular system during sepsis
LI Yu-Ming, LIU Jun-Chang, ZHANG Min, ZHENG Xin-Cheng, WU Li-Ling, SHI An-Yun, et al
(Department of Pathophysiology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Toxemia/enzymal Heme oxygenase/metab Cardiovascular system/enzymal Lactate dehydrogenase/metab
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ABSTRACT Objective: To study the alterations of heme oxygenase(HO) in cardiovascular system during sepsis. Methods: A rat sepsis model was induced by cecal ligation and puncture. In early and late sepsis, mean blood pressure(MBP)，left ventricular function parameters and blood plasma lactate dehydrogenase (LDH) were measured. Then HO activities and MDA contents of the heart and aorta were examined. HO-1 mRNA expression was examined by Northern Blot. Results: In early sepsis, HO activity in the heart increased by 72.1% (P<0.01)compared with control;while HO activity in the aorta， MBP， left ventricular function and blood plasma LDH had no significant changes. MDA contents in the heart and aorta increased by 60.3% and 96.5% respectively(P<0.05).In late sepsis,HO activity in the heart was still maintained at the high level while that in the aorta increased by 261% (P<0.01)compared with that in early sepsis. MBP,left ventricular function decreased and blood plasma LDH and MDA contents in the heart and aorta increased significantly (P<0.01).HO-1 mRNA expression in the heart was the same as the alteration tendency of HO activity but that in the aorta was increased by 49.2% (P<0.05) and 143% (P<0.01) respectively in early and late sepsis. Conclusion: HO activity and HO-1 mRNA expression in the heart and aorta are increased during sepsis and the inducable HO plays an important role during sepsis.In early sepsis HO can protect organs from injury but in late sepsis it may be one of the most important reasons for hypotension.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:497-500)
血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血红素代谢过程中的起始、限速酶，其生理功能为催化血红素降解，生成胆绿素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和亚铁。近年来的研究结果表明，HO的生物学效应并不局限于此，其催化产物同样具有重要的生物学功能，主要表现为胆绿素及其还原产物胆红素和亚铁的抗氧化损伤及CO的血管调节作用。可诱导型血红素加氧酶(HO-1)除受血红素调节外，在许多病理情况下均可被诱导产生[1]。脓毒血症系由革兰氏阴性菌感染所致,通过细菌壁释放的内毒素引起细胞因子及血管活性物质的产生,导致不同程度的心功能障碍和低血压。有研究表明HO-1表达增加可能具有抗内毒素血症作用[2]，但亦有学者发现，腹腔注射内毒素的大鼠主动脉HO-1mRNA表达增加,酶活性增强，提示内毒素性低血压与HO/CO通路的活性增强有关[3]。我们以盲肠结扎穿孔法复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型，系统地观察心脏与主动脉HO活性和HO-1mRNA表达的动态变化，并探讨HO在脓毒血症病理演变中的作用。
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1 材料与方法
1.1 试剂
氯高铁血红素(hemin)、氧化型辅酶Ⅱ(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADP)、三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane，TRIS]、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)、十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)均为Sigma产品;异硫氰酸胍为Promega产品、 α-32P-dCTP为北京亚辉生物工程公司产品，鼠HO-1cDNA探针(838 bp)由NIH衰老研究所龙西林惠赠。其它试剂均为市售分析纯。
1.2 动物模型
200～250g雄性Wistar大鼠(北京医科大学实验动物中心提供)15只，随机分为3组：(1)对照组(control)：除不进行盲肠结扎穿孔外，余同脓毒血症组，分别于术后9 h和18 h处死大鼠 (实验显示9 h与18 h对照组无区别,故合为一组)；(2)早期脓毒血症组(early sepsis)：盲肠结扎穿孔法复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型[4]，术后9h测平均动脉压(mean blood pressure, MBP)、心功能指标及血浆氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)，同时取心脏与主动脉测HO活性与MDA含量，提取总RNA、Northern 印迹杂交测HO-1mRNA表达；(3)晚期脓毒血症组(late sepsis)：术后18 h完成上述实验。
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1.3 血流动力学指标测定
血压与心功能测定：用四道生理记录仪(San.ei,日本)右颈总动脉插管测MBP、左室收缩压(left ventricular end-systolic pressure, LVESP)、舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)及左室内压最大变化速率(±dp/dtmax);留动脉血样，抗凝后于4℃保存。取心脏与主动脉，彻底清除残留血液后于液氮中保存。
1.4 生化指标测定
Lowry法测定蛋白浓度，硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量，乳酸基质法测定LDH活性。
HO(微粒体)提取及活性测定[5]：将组织剪碎，加3倍体积预冷的含蔗糖的Tris缓冲液，匀浆，10000r.min-1、4℃离心20min,取上清33500r.min-1、4℃离心(Backman,XL-90 )1h,弃上清、沉淀用0.1mol.L-1的磷酸钾缓冲液(pH7.4)溶解。利用硫酸铵沉淀、透析法从大鼠肝脏中提取胆绿素还原酶。HO活性测定反应体系中含HO 0.5mg、Hemin 20μmol.L-1、胆绿素还原酶4mg、NADP 0.8mmol.L-1、G-6-P 4mmol.L-1及G-6-PD 1U。反应体积1ml,最后避光加Hemin，于37℃水浴避光反应20 min后冰浴终止反应，分光光度法测定D463和D530(UV-260,日本)。胆红素消光系数40nm-1.cm-1，利用(D463- D530)×40÷1/2÷1/3计算1mg HO 1h催化血红素降解生成胆红素的nmol数，并以此来表示HO活性。
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1.5 Northern印迹杂交
用异硫氰酸胍裂解一步法提取心肌与主动脉平滑肌组织总RNA, RNA经甲醛变性凝胶电泳分离后转移至尼龙膜上，先预杂交，然后用α-32P-dCTP标记的鼠HO-1cDNA变性探针与固定在尼龙膜上的RNA进行杂交，按常规方法洗膜，于-20℃放射自显影。以图像分析仪(LEICA Q550IW，德国)测定各杂交带光密度值与面积，计算积分分光密度(I.D)，以对照组I.D为100%计算其它组I.D变化的百分比。
1.6 统计学处理
全部数据用
±s表示，采用One-way ANOVA软件分析进行组间比较，继而用q检验进行两组间的比较，P<0.05为差异有显著性。2 结果
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2.1 血流动力学变化(表1)
本实验中采用的大鼠腹膜炎脓毒血症模型血流动力学呈早期高动力(高代谢)和晚期低动力(低代谢)的双相变化,心脏舒缩功能也出现双相变化，早期心肌收缩力增强，血压无改变；晚期左室±dp/dtmax分别降低41.3%和40.4%(P<0.01),LVESP降低31.1%(P<0.05),LVEDP升高278.6%(P<0.01)，血压较对照组降低25%(P<0.05)，血流动力学变化趋势与文献报道一致。该模型很好地反映了临床上腹膜炎脓毒血症的血流动力学和代谢紊乱的变化过程，较单纯注射内毒素引起的脓毒血症更贴近临床实际。
表1 脓毒血症时平均动脉压、左室内压及最大变化速率的变化(
±s)Table 1 Alterations of mean blood pressure、left ventricular pressure and ±dp/dtmax during sepsis(
±s) Group, http://www.100md.com
p(MBP)/kPa
p(LVESP)/kPa
p(LVEDP)/kPa
+dp/dtmax(kPa.s-1)
-dp/dtmax(kPa.s-1)
Control
16.4±0.8
16.6±0.8
0.70±0.11
349±17
, 百拇医药
300±15
Early sepsis
16.5±0.9
16.8±0.9
0.67±0.10
410±15*
298±17
Late sepsis
12.5±0.6**
11.4±1.3*
2.65±0.34**
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205±9**
179±9**
n=5, *P<0.05， **P<0.01 vs control.
2.2 心血管系统生化指标变化(表2)
早期组血浆LDH无明显变化,而晚期组升高71.9%(P<0.01)。早期脓毒血症时心脏与主动脉MDA含量即开始增加(P<0.05)，晚期增加更为明显(P<0.01),与脓毒血症的病理演变过程一致。
表2 脓毒血症时血浆LDH及心脏与主动脉MDA含量的变化(
±s)Table 2 Alterations of blood plasma LDH and MDA contents in heart
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and aorta during sepsis(
±s) GroupLDH(U.ml-1)
n(MDA contents)/nmol☆
Blood plasma
Heart
Aorta
Control
342±27
4.0±0.9
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4.1±1.3
Early sepsis
376±24
6.4±1.6*
7.9±1.9*
Late sepsis
587±39**##
13.8±2.6**##
10.6±2.1**##
n=5, *P<0.05, **P<0.01 vs control； ##P<0.01 vs early sepsis； ☆per mg protein.2.3 心血管系统HO活性的变化(表3)
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脓毒血症早期，心脏HO活性比对照组升高72.1%(P<0.01)，而主动脉HO活性尚无明显变化。脓毒血症晚期心脏HO活性仍保持在早期时的高水平，而主动脉HO活性比早期组增加261%(P<0.01)。这表明，脓毒血症时心脏与主动脉HO活性均增加,但两者的变化规律不同；主动脉HO活性增加的高峰时间迟于心脏，但幅度远大于心脏。
2.4 心血管系统HO-1mRNA表达的变化
脓毒血症早期，心脏HO-1mRNA表达增加(P<0.01，表3和图1) ，晚期表达水平与早期相同，心脏HO-1mRNA表达的变化规律与心脏HO活性的变化趋势一致。主动脉HO-1mRNA表达在早期即已明显增加(P<0.05)，到晚期则显著增加(P<0.01)，这提示主动脉HO-1mRNA表达增加在时间上略早于HO活性的升高，HO活性的升高是由于大量诱导HO-1生成的结果。
表3 脓毒血症时心脏与主动脉HO活性与HO-1mRNA表达的变化(
±s), 百拇医药
Table 3 Alterations of HO activity and HO-1mRNA expressions in heart and aorta during sepsis(
±s) GroupHeme oxygenase activity(nmol.h-1)☆
HO-1mRNA expression (%)
Heart
Aorta
n
Heart
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Aorta
n
Control
30.7±2.7
16.1±2.6
5
100
100
3
Early sepsis
52.8±6.4**
19.2±3.0
, 百拇医药
5
147±12**
149±18*
3
Late sepsis
56.5±7.0**
69.2±7.2**##
5
49±6**
243±25**##
3
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*P<0.05， **P<0.01 vs control； ## P<0.01， vs early sepsis， ☆ per mg protein.
A，heart; B,aorta; 1,control; 2,early sepsis; 3,late sepsis.
图1 脓毒血症时心脏与主动脉HO-1 mRNA表达的变化
Figure 1 Alterations of HO-1 mRNA expressions in heart
and aorta during sepsis
3 讨论
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近年来，HO以其催化产物的抗氧化损伤与生物调节作用日益受到人们的重视[1～3]。体内HO存在两种亚型,即HO-1和HO-2,二者分别为不同基因表达的产物。HO-1为可诱导型,是传统意义上的血红素加氧酶，其活性除受血红素调节外，缺氧、热休克及多种非血红素类物质也可诱导其产生,如重金属盐(铬盐、钴盐)、激素、内毒素及炎性细胞因子等。HO-2为结构型表达，其活性在生理状态下受糖皮质激素的调节，应激反应不能诱导其产生[6]。
脓毒血症时往往出现不同程度的心功能障碍与低血压，其形成机制一直是医学领域的研究热点和难点。Otterbein 等[2]给大鼠腹腔注射血红蛋白后发现肺HO-1mRNA表达增多，HO活性增强，注射致死剂量的内毒素后，大鼠100%存活，提示HO具有抗内毒素血症的作用；然而，Yet等[3]给大鼠腹腔注射内毒素后9 h，发现主动脉HO-1mRNA表达增多，HO活性增强，血压降低，用HO活性抑制剂锌原卟啉Ⅸ(Zn-protoporphyrin-Ⅸ, ZnPPⅨ)后血压回升，提示HO/CO通路活性增强参与内毒素性低血压的形成，在内毒素性休克的发生发展中起促进作用。关于脓毒血症时HO的变化规律及其在心血管系统中的综合作用报道甚少。
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本实验以更贴近临床实际的腹膜炎脓毒血症的大鼠为模型，观察HO在心血管系统的动态变化。结果显示，脓毒血症时，心脏与主动脉HO活性增强，表明细菌内毒素等可激活HO活性，介导脓毒血症时的心血管系统功能调节。为探讨HO活性升高的机制，我们用Northern Blot检测了心脏与主动脉HO-1 mRNA的表达。结果表明，脓毒血症时HO-1 mRNA表达量增加，这提示HO活性的增加是由HO-1被诱导合成所致。此外，我们的结果还表明，在脓毒血症病理演变过程中，心脏与主动脉HO变化的规律是不同的。心脏HO-1mRNA表达在脓毒血症早期即明显升高并一直持续到晚期，与心脏HO活性的变化趋势一致。主动脉HO-1mRNA表达在早期虽已增加，但HO活性升高尚不明显；脓毒血症晚期，主动脉HO-1mRNA表达及HO活性呈急剧升高，即主动脉HO升高较心脏升高的晚，但其升高的程度却明显大于心脏。这可能与脓毒血症时心血管系统的功能变化有关。
HO对细胞的保护可能与其催化产物的抗氧化作用有关[1]。为了探讨心脏和主动脉HO变化与脓毒血症病理演进的关系，我们检测了血液动力学与反映器官损伤的血浆LDH及组织MDA含量等指标。结果显示，早期脓毒血症时MBP、血浆LDH无明显变化、+dp/dtmax升高提示心功能代偿性增强，心血管MDA含量仅轻度升高，这可能与心脏HO-1 mRNA表达增加，HO活性升高，催化血红素生成具有抗氧化损伤作用的胆红素、亚铁等有关。提示HO在早期脓毒血症时可能具有抗组织损伤和细胞保护作用，参与心血管系统功能的代偿和调节。随着脓毒血症的加重，心脏HO-1mRNA表达及HO活性虽基本保持早期时的水平，但已不足以对抗因内毒素和细胞因子等的增多对心肌的损伤，致使血浆LDH与心肌MDA含量明显增加，心脏收缩与舒张功能严重抑制，而血管HO-1mRNA表达的急剧增加与HO活性的大幅度升高导致平滑肌内源性CO生成增加，激活动脉平滑肌细胞膜上的鸟苷酸环化酶，增加细胞内cGMP的生成，减少细胞内的钙含量[7]，舒张血管平滑肌，使血压大幅度下降，造成器官低灌注，使损伤进一步加剧，终致HO催化产物的抗氧化损伤作用被掩盖。
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总之，脓毒血症时心血管系统HO活性升高，为HO-1mRNA表达增多所致。HO在脓毒血症病理演变过程中的作用不是一成不变的，随着病程的延长其作用方式会发生变化，早期可能与机体的抗氧化损伤机制有关，晚期则参与低血压的形成使器官损伤加重，可能为脓毒血症时心血管系统功能变化的机制之一，值得进一步探讨。
* 国家自然科学基金(39670308)资助项目。
参考文献
1 Choi AM, Alam J. Heme oxygenase: function, regulation, and implication of a novel stress-inducible protein in oxidant-induced lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol,1996,15:9-19
2 Otterbein L, Sylvester SL, Choi AM, et al. Hemoglobin provides protection against lethal endotoxemia in rats:the role of heme oxygenase-1. Am J Respir Cell Mol Biol,1995,13(5):595-601
, http://www.100md.com
3 Yet SF, Pellacani A, Patterson C, et al. Induction of heme oxgenase-1 in vascular smooth muscle cell.a link to endotoxic shock. J Biol Chem, 1997,272:4295-4301
4 Wichterman KA, Bauce AE, Chaudry IH. Sepsis and septic shock:a review of laboratory models and a proposal. J Surg Res,1980,29:189-201
5 Balla G, Jacob HS, Balla J, et al. Ferritin: a cytoprotective antioxidant stratagem of endothelium.J Biol Chem,1992,267:18148-18153
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6 Bauer I,Wanner GA, Rensing H, et al. Expression pattern of heme oxygenase Isoenzymes1 and 2 in normal and stress-exposed rat liver. Hepatology, 1998,27:829-838
7 Mains MD. The heme oxygenase system:a regulator of second messenger gases. Annu Rev Pharmacol Toxicol,1997,37:517-554
(1999-09-15收稿), http://www.100md.com