应激免疫抑制蛋白的细胞来源
作者：吴树亚 邓玉兰 丁桂凤 范少光
单位：吴树亚 邓玉兰 丁桂凤(北京大学基础医学院免疫学系)；范少光(生理学系，北京 100083)
关键词：应激免疫抑制蛋白；T-淋巴细胞；分泌；T淋巴细胞亚型；分泌
北京医科大学学报000414 [摘 要] 目的：研究应激免疫抑制蛋白(immunosuppressive protein of stress, ISPS)的细胞来源。方法：免疫荧光染色后，运用流式细胞仪和激光扫描共焦显微镜两种技术对ISPS进行定性和定量研究。结果：流式细胞仪结果发现无论在正常还是应激条件下，ISPS均在T淋巴细胞上表达，且应激后ISPS表达量在T淋巴细胞显著升高至正常时的3倍。在激光扫描共焦显微镜下，直接观察到分离纯化的T淋巴细胞中有ISPS阳性细胞存在，且发现T细胞的两类亚群均具有产生ISPS的功能。结论：T淋巴细胞可以产生ISPS。
, 百拇医药
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0332-02
Identifying the cell source of immunosuppressive protein of stress
WU Shu-Ya
(Department of Immunology)
DENG Yu-Lan
(Department of Immunology)
DING Gui-Feng
(Department of Immunology)
, 百拇医药
FANG Shao-Guang
(Department of physiology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To identify the cell source of immunosuppressive protein of stress(ISPS). Methods: Fluorescence-activated cell sorter (FACS) and confocal laser microscope were used to analyze ISPS in purified T cells. Results: FACS analysis showed ISPS increased significantly under stress condition in T lymphocytes. ISPS positive cells were also observed among the purified T lymphocytes through confocal laser microscope. We also found that both subtypes of T lymphocytes can produce ISPS. Conclusion: T lymphocytes can produce ISPS.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Immunosuppressive protein of stress; T-lymphocytes/secret; T-lymphocyte subsets/secret
(J Beijing Med Univ, 2000,32:332-333)
应激免疫抑制蛋白(immunosuppressive protein of stress, ISPS)是在应激条件下，通过中枢神经系统作用，由外周淋巴组织产生的相对分子质量为150 000和370 000的蛋白质。ISPS具有多种功能，它能明显抑制淋巴细胞转化，抑制体外培养的T细胞释放IL-2[1]，整体研究中，发现它还能降低正常大鼠的动脉血压[2]，并能对抗由四氧嘧啶(alloxan)所致大鼠糖尿病的发生[3]。在成功制备ISPS的单克隆抗体2C4的基础上，本文对ISPS 的细胞定位作了进一步的探讨。
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1 材料与方法
透析法标记应激免疫抑制蛋白单克隆抗体2C4：取1 mg经饱和硫酸铵粗提的ISPS单克隆抗体，用0.025 mol.L-1碳酸盐缓冲液稀释至终质量浓度0.5g.L-1，装入透析袋中。称取3 mg异硫氰荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)溶于30 ml 0.025 mol.L-1的碳酸盐缓冲液中。将透析袋置于该缓冲液中，4℃下避光搅拌24 h后，用Sephadex G-50 层析柱分离未在蛋白质上标记的游离FITC。收集上样后的第一个峰。
流式细胞仪检测免疫荧光标记的T、B淋巴细胞：实验用体重20～22 g雄性BALB/C小鼠(6～8周龄，由我校动物部提供)，束缚应激过夜。推颈处死小鼠，常规制备脾细胞悬液。Ficoll 泛影葡胺细胞分离液(ρ=1.090)分离单个核细胞后，利用兔抗小鼠血清包被的平皿亲和性分离T、B淋巴细胞。荧光抗体标记分纯的T、B淋巴细胞，流式细胞仪检测。结果用
±s表示，以t检验作统计学处理。
, 百拇医药
激光扫描共焦显微镜直接观察结合免疫荧光抗体的淋巴细胞：依前法分离纯化正常对照及应激小鼠T、B淋巴细胞，常规标记FITC-2C4 抗体，将细胞悬液滴加在洁净载玻片上，置于激光扫描共焦显微镜载物台上。同一视野先在透射光通道下观察，后转入荧光通道下观察阳性细胞是否存在及其比例。同样方法制备T、B淋巴细胞悬液，进行免疫荧光抗体双标记，即PE-CD4/CD8(Pharmingen公司产品)和FITC-2C4，观察是否存在双阳性的细胞。
2 结果
流式细胞仪检测T、B淋巴细胞中应激免疫抑制蛋白阳性细胞率：分离纯化正常对照及应激小鼠T、B淋巴细胞，流式细胞仪检测T、B淋巴细胞纯度分别为(87.1±1.4)%，(85.8±1.0)%，基本符合后继实验的要求。常规进行FITC-2C4荧光抗体标记，检测T、B淋巴细胞中阳性细胞率。结果表明，分离纯化的小鼠T淋巴细胞中，正常对照组FITC-2C4 阳性细胞率为(5.6±2.2)%，应激组则为(16.1±3.1)%，二组间差异有显著性(n=6, P<0.01, t检验)。分离纯化的B细胞中，FITC-2C4 阳性细胞率分别为：应激组(2.2±1.3)%、对照组(1.2±0.8)%，两组间差异无显著性(n=6, P>0.05, t检验)，表明B淋巴细胞中缺乏或极少有应激免疫抑蛋白的存在。
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镜下观察分离纯化的T、B淋巴细胞中的应激免疫抑制蛋白阳性细胞：在分离纯化的T细胞中，清晰可见FITC-2C4荧光阳性细胞。在分纯的B细胞中则几乎未见阳性细胞。随机选取3个视野，每一视野均先在透射光通道下观察，后转入荧光通道下，发现在分纯的T细胞中3个视野平均阳性率为37%， 而在分纯的B细胞中阳性率为0%，从而进一步证实了流式细胞仪的检测结果(图1)。
UL,under FITC fluorescence channel;UR,under transmission channel(figure 1),under PE fluorescence channel(figure2);
LL,none;LR,combined picture from UL and UR by computer;
, http://www.100md.com 2a,FITC-2C4 adn PE-CD4 double staining;2b,FITC-2C4 adn PE-CD8 double staining.
图1 免疫荧光双染色后的T(1a)和B(1b)淋巴细胞
(同一视野，不同通道下观察) ×25
Figure.1 T(1a)and B(1b) lymphocytes after immunofluorecence staining.
(observe the same field under different channel) ×25
镜下观察PE-CD4/CD8，FITC-2C4双阳性细胞：为进一步确定ISPS在 T淋巴细胞中的亚群定位，本实验采用PE-CD4/CD8，FITC-2C4进行免疫荧光抗体双标记，利用激光扫描共焦显微镜双通道的技术特性，观察单个淋巴细胞PE或/和FITC单荧光及双荧光阳性着色情况。所观察视野中可见PE-CD4和FITC-2C4双阳性细胞，及PE-CD8和FITC-2C4双阳性细胞。初步说明CD4+和CD8+的T细胞均可产生免疫抑制蛋白(图2)。
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图2 免疫荧光双染色后的T淋巴细胞(同一细胞，不同通道下观察) ×25
Figure.2 T lymphocytes after immunofluorecence double staining
(observe the same cell under different channel) ×25
3 讨论
在应激条件下机体的免疫功能会有很大的变化，我们发现和研究的ISPS，由于其独特的生成机制，有可能是联系神经系统和免疫系统的重要介导物质[4]。本文采用了流式细胞仪和激光共焦扫描显微镜二种技术对ISPS的细胞定位进行了研究。流式细胞仪可以快速、客观、敏感的鉴别荧光阳性细胞，是目前较佳的定量手段。从本文流式细胞仪检测的结果来看，无论在应激还是正常情况下，ISPS均在T 细胞上有表达，但应激后ISPS的表达量显著升高至正常时的3倍。这一结果与免疫组化染色后灰度扫描的结果完全一致[5]。其机制可能为产生该蛋白的T 细胞数量的增多，或ISPS在细胞中表达量的增多，或二者兼而有之。在分离纯化的B细胞中也有ISPS 检出率，但其正常与应激组相比ISPS阳性率差异并无显著性，所以可能是分离纯化的B细胞中还含有少量T细胞之故。综上所述，我们推论是T 细胞产生了ISPS。同时本文还从形态学的角度，利用激光扫描共焦显微镜，直接观察到了FITC-2C4阳性细胞存在于分纯的 T细胞中，而在分纯的B细胞中几乎未见阳性细胞的存在。利用断层光切扫描技术观察，发现抗体的结合部位不仅位于细胞的外周区，而且在胞浆中也有着色，又知该蛋白在血清中存在，所以ISPS极有可能是一分泌型的蛋白，但这一结论还有待于进一步的实验证实。本文对ISPS在T细胞的亚群定位也作了初步探讨，分别用PE-CD4和FITC-2C4,PE-CD8和FITC-2C4对分离纯化的应激T细胞进行免疫荧光双标记，均可见呈橙黄色的双阳性细胞存在，证明T细胞的两类亚群均具有产生ISPS的功能。
, 百拇医药
参考文献
1，刘 薇，范少光，丁桂凤.应激免疫抑制蛋白对免疫细胞功能的影响[J]. 北京医科大学学报，1997,29:86-87
2，汪静雪，李怡凡，黄庆军. 应激免疫抑制蛋白降低大鼠动脉血压 . 北京医科大学学报[J]，1998,30:499-500
3，高 珊，梅 林，范少光. 束缚应激免疫抑制因子对抗由四氧嘧啶所致大鼠糖尿病的发生[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志，1996,3:96-99
4，Fan SG, Shao L, Ding GF . A suppressive protein generated in peripheral lymph tissue induced by restraint stress[J]. Adv Neuroimmuol, 1996.6:279-288
5，黄庆军. 应激免疫抑制蛋白的细胞来源及功能的研究[学位论文]. 北京：北京医科大学，1998
(2000-03-31收稿), http://www.100md.com
单位：吴树亚 邓玉兰 丁桂凤(北京大学基础医学院免疫学系)；范少光(生理学系，北京 100083)
关键词：应激免疫抑制蛋白；T-淋巴细胞；分泌；T淋巴细胞亚型；分泌
北京医科大学学报000414 [摘 要] 目的：研究应激免疫抑制蛋白(immunosuppressive protein of stress, ISPS)的细胞来源。方法：免疫荧光染色后，运用流式细胞仪和激光扫描共焦显微镜两种技术对ISPS进行定性和定量研究。结果：流式细胞仪结果发现无论在正常还是应激条件下，ISPS均在T淋巴细胞上表达，且应激后ISPS表达量在T淋巴细胞显著升高至正常时的3倍。在激光扫描共焦显微镜下，直接观察到分离纯化的T淋巴细胞中有ISPS阳性细胞存在，且发现T细胞的两类亚群均具有产生ISPS的功能。结论：T淋巴细胞可以产生ISPS。
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[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0332-02
Identifying the cell source of immunosuppressive protein of stress
WU Shu-Ya
(Department of Immunology)
DENG Yu-Lan
(Department of Immunology)
DING Gui-Feng
(Department of Immunology)
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FANG Shao-Guang
(Department of physiology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To identify the cell source of immunosuppressive protein of stress(ISPS). Methods: Fluorescence-activated cell sorter (FACS) and confocal laser microscope were used to analyze ISPS in purified T cells. Results: FACS analysis showed ISPS increased significantly under stress condition in T lymphocytes. ISPS positive cells were also observed among the purified T lymphocytes through confocal laser microscope. We also found that both subtypes of T lymphocytes can produce ISPS. Conclusion: T lymphocytes can produce ISPS.
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KEY WORDS Immunosuppressive protein of stress; T-lymphocytes/secret; T-lymphocyte subsets/secret
(J Beijing Med Univ, 2000,32:332-333)
应激免疫抑制蛋白(immunosuppressive protein of stress, ISPS)是在应激条件下，通过中枢神经系统作用，由外周淋巴组织产生的相对分子质量为150 000和370 000的蛋白质。ISPS具有多种功能，它能明显抑制淋巴细胞转化，抑制体外培养的T细胞释放IL-2[1]，整体研究中，发现它还能降低正常大鼠的动脉血压[2]，并能对抗由四氧嘧啶(alloxan)所致大鼠糖尿病的发生[3]。在成功制备ISPS的单克隆抗体2C4的基础上，本文对ISPS 的细胞定位作了进一步的探讨。
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1 材料与方法
透析法标记应激免疫抑制蛋白单克隆抗体2C4：取1 mg经饱和硫酸铵粗提的ISPS单克隆抗体，用0.025 mol.L-1碳酸盐缓冲液稀释至终质量浓度0.5g.L-1，装入透析袋中。称取3 mg异硫氰荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)溶于30 ml 0.025 mol.L-1的碳酸盐缓冲液中。将透析袋置于该缓冲液中，4℃下避光搅拌24 h后，用Sephadex G-50 层析柱分离未在蛋白质上标记的游离FITC。收集上样后的第一个峰。
流式细胞仪检测免疫荧光标记的T、B淋巴细胞：实验用体重20～22 g雄性BALB/C小鼠(6～8周龄，由我校动物部提供)，束缚应激过夜。推颈处死小鼠，常规制备脾细胞悬液。Ficoll 泛影葡胺细胞分离液(ρ=1.090)分离单个核细胞后，利用兔抗小鼠血清包被的平皿亲和性分离T、B淋巴细胞。荧光抗体标记分纯的T、B淋巴细胞，流式细胞仪检测。结果用
±s表示，以t检验作统计学处理。, 百拇医药
激光扫描共焦显微镜直接观察结合免疫荧光抗体的淋巴细胞：依前法分离纯化正常对照及应激小鼠T、B淋巴细胞，常规标记FITC-2C4 抗体，将细胞悬液滴加在洁净载玻片上，置于激光扫描共焦显微镜载物台上。同一视野先在透射光通道下观察，后转入荧光通道下观察阳性细胞是否存在及其比例。同样方法制备T、B淋巴细胞悬液，进行免疫荧光抗体双标记，即PE-CD4/CD8(Pharmingen公司产品)和FITC-2C4，观察是否存在双阳性的细胞。
2 结果
流式细胞仪检测T、B淋巴细胞中应激免疫抑制蛋白阳性细胞率：分离纯化正常对照及应激小鼠T、B淋巴细胞，流式细胞仪检测T、B淋巴细胞纯度分别为(87.1±1.4)%，(85.8±1.0)%，基本符合后继实验的要求。常规进行FITC-2C4荧光抗体标记，检测T、B淋巴细胞中阳性细胞率。结果表明，分离纯化的小鼠T淋巴细胞中，正常对照组FITC-2C4 阳性细胞率为(5.6±2.2)%，应激组则为(16.1±3.1)%，二组间差异有显著性(n=6, P<0.01, t检验)。分离纯化的B细胞中，FITC-2C4 阳性细胞率分别为：应激组(2.2±1.3)%、对照组(1.2±0.8)%，两组间差异无显著性(n=6, P>0.05, t检验)，表明B淋巴细胞中缺乏或极少有应激免疫抑蛋白的存在。
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镜下观察分离纯化的T、B淋巴细胞中的应激免疫抑制蛋白阳性细胞：在分离纯化的T细胞中，清晰可见FITC-2C4荧光阳性细胞。在分纯的B细胞中则几乎未见阳性细胞。随机选取3个视野，每一视野均先在透射光通道下观察，后转入荧光通道下，发现在分纯的T细胞中3个视野平均阳性率为37%， 而在分纯的B细胞中阳性率为0%，从而进一步证实了流式细胞仪的检测结果(图1)。
UL,under FITC fluorescence channel;UR,under transmission channel(figure 1),under PE fluorescence channel(figure2);
LL,none;LR,combined picture from UL and UR by computer;
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图1 免疫荧光双染色后的T(1a)和B(1b)淋巴细胞
(同一视野，不同通道下观察) ×25
Figure.1 T(1a)and B(1b) lymphocytes after immunofluorecence staining.
(observe the same field under different channel) ×25
镜下观察PE-CD4/CD8，FITC-2C4双阳性细胞：为进一步确定ISPS在 T淋巴细胞中的亚群定位，本实验采用PE-CD4/CD8，FITC-2C4进行免疫荧光抗体双标记，利用激光扫描共焦显微镜双通道的技术特性，观察单个淋巴细胞PE或/和FITC单荧光及双荧光阳性着色情况。所观察视野中可见PE-CD4和FITC-2C4双阳性细胞，及PE-CD8和FITC-2C4双阳性细胞。初步说明CD4+和CD8+的T细胞均可产生免疫抑制蛋白(图2)。
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图2 免疫荧光双染色后的T淋巴细胞(同一细胞，不同通道下观察) ×25
Figure.2 T lymphocytes after immunofluorecence double staining
(observe the same cell under different channel) ×25
3 讨论
在应激条件下机体的免疫功能会有很大的变化，我们发现和研究的ISPS，由于其独特的生成机制，有可能是联系神经系统和免疫系统的重要介导物质[4]。本文采用了流式细胞仪和激光共焦扫描显微镜二种技术对ISPS的细胞定位进行了研究。流式细胞仪可以快速、客观、敏感的鉴别荧光阳性细胞，是目前较佳的定量手段。从本文流式细胞仪检测的结果来看，无论在应激还是正常情况下，ISPS均在T 细胞上有表达，但应激后ISPS的表达量显著升高至正常时的3倍。这一结果与免疫组化染色后灰度扫描的结果完全一致[5]。其机制可能为产生该蛋白的T 细胞数量的增多，或ISPS在细胞中表达量的增多，或二者兼而有之。在分离纯化的B细胞中也有ISPS 检出率，但其正常与应激组相比ISPS阳性率差异并无显著性，所以可能是分离纯化的B细胞中还含有少量T细胞之故。综上所述，我们推论是T 细胞产生了ISPS。同时本文还从形态学的角度，利用激光扫描共焦显微镜，直接观察到了FITC-2C4阳性细胞存在于分纯的 T细胞中，而在分纯的B细胞中几乎未见阳性细胞的存在。利用断层光切扫描技术观察，发现抗体的结合部位不仅位于细胞的外周区，而且在胞浆中也有着色，又知该蛋白在血清中存在，所以ISPS极有可能是一分泌型的蛋白，但这一结论还有待于进一步的实验证实。本文对ISPS在T细胞的亚群定位也作了初步探讨，分别用PE-CD4和FITC-2C4,PE-CD8和FITC-2C4对分离纯化的应激T细胞进行免疫荧光双标记，均可见呈橙黄色的双阳性细胞存在，证明T细胞的两类亚群均具有产生ISPS的功能。
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参考文献
1，刘 薇，范少光，丁桂凤.应激免疫抑制蛋白对免疫细胞功能的影响[J]. 北京医科大学学报，1997,29:86-87
2，汪静雪，李怡凡，黄庆军. 应激免疫抑制蛋白降低大鼠动脉血压 . 北京医科大学学报[J]，1998,30:499-500
3，高 珊，梅 林，范少光. 束缚应激免疫抑制因子对抗由四氧嘧啶所致大鼠糖尿病的发生[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志，1996,3:96-99
4，Fan SG, Shao L, Ding GF . A suppressive protein generated in peripheral lymph tissue induced by restraint stress[J]. Adv Neuroimmuol, 1996.6:279-288
5，黄庆军. 应激免疫抑制蛋白的细胞来源及功能的研究[学位论文]. 北京：北京医科大学，1998
(2000-03-31收稿), http://www.100md.com