正常人和血栓性疾病患者凝血酶原基因20210位的变异
作者：屈晨雪 夏铁安 王建中
单位：北京大学第一医院检验科，北京 100034
关键词：突变；DNA突变分析；血栓形成
北京医科大学学报000627 [中图分类号]Q343.13 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0570-02
新近研究发现，凝血酶原基因20210位核苷酸 G→A的变异(FⅡ20210A)与血栓性疾病的形成有密切的关系[1～3]。为此，我们对36例正常人、50例静脉血栓患者及51例动脉血栓患者进行了FⅡ20210A变异的检测。
1 材料与方法
, 百拇医药 研究对象：静脉血栓患者50例，其中深静脉血栓 39例，肺栓塞11 例。动脉血栓患者51例，为既往发作过脑梗死或心肌梗死病人，均经CT确诊。以上病人均未服或停服抗凝药一周以上。正常对照组36例，来自我院健康献血员和体检健康者。
标本采集与制备：所有患者及正常对照者均采取清晨空腹抗凝血3 ml，分离出血浆测定FⅡ活性；白细胞用于制备DNA。
FⅡ活性测定：采用一期法，在ACL Futura 全自动凝血仪上完成测定。
DNA分析：采用1988年Miller等报道的盐析法提取白细胞DNA。以等位基因特异的PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)和PCR-限制性内切酶分析法同时分析FⅡ20210A变异。
AS-PCR：引物据 Bertina[4]报道设计，共4条，由赛百盛公司合成。引物3、4仅最后一个碱基不同。每个标本做a、b两管，a管加入引物1、2、3，b管加入引物1、2、4，其余条件相同。反应条件：50 μl反应体系中含50 μ mol.L-1 dNTPs，各约20 pmol的引物1、2，各约40 pmol的引物3或4，0.5～1 μgDNA模板，1～1.5 U的Taq酶。95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，67 ℃退火、延伸2 min，30个循环。用80 g.L-1聚丙烯酰胺电泳-硝酸银染色检查结果。
, 百拇医药
PCR-限制性内切酶酶切：引物据Poort[1]报道设计，由赛百盛公司合成。引物2为突变引物，设计了一个Hind Ⅲ限制性内切酶的酶切位点(-AAGCTT-)。反应条件:50 μl反应体系，其中含50 μmol.L-1 dNTPs，各约20 pmol的引物1、2，0.5～1 μg DNA模板，1～1.5 U的Taq酶。95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，67 ℃退火、延伸2 min，28个循环。酶切反应：10 μl PCR产物，用3 U Hind Ⅲ内切酶，37 ℃酶切过夜，反应体系20 μl。用80 g.L-1聚丙烯酰胺电泳-硝酸银染色检查结果，PCR产物片段长度为345 bp，FⅡ20210A变异体酶切后产生的片段为322 bp和23 bp，由于23 bp片段分子量较小，在聚丙烯酰胺电泳中难以显示。
阳性标本由荷兰Poort博士惠赠，为杂合子型。
, 百拇医药
统计学分析：采用方差分析，P<0.05 为差异有显著性。
2 结果
AS-PCR电泳结果：FⅡ20210A 变异纯合子电泳结果显示：a管两条带(270 bp，148 bp)，b管一条带(270 bp)；若杂合子型则a、b两管均有两条带(270 bp，148 bp)；正常人体为a管一条带(270 bp)，b管两条带(270 bp，148 bp)。在所有样本中未检测到FⅡ20210A变异。
PCR-限制性内切酶分析：在所有样本中未检测到FⅡ20210A变异。
FⅡ活性在3组之间的比较：FⅡ活性在3组之间差异无显著性(P>0.05)。以正常组
±2s为正常参考范围(61.9%～104.6%)，正常组中无FⅡ活性升高者，静脉血栓组有1例升高(116.4%)，动脉血栓组有9例升高。
, 百拇医药
3 讨论
凝血因子Ⅱ(FⅡ)即凝血酶原，是凝血酶(FⅡa)的前体，属于维生素K依赖的凝血因子，它同时具有促凝和抗凝活性。因此它的含量、活性及结构的改变对体内的出凝血过程有重要影响。
1996年，Poort[1]等运用PCR及直接测序技术对28例有深静脉血栓家族史的血栓病患者的凝血酶原基因进行了检测，发现在凝血酶原基因的3′-非翻译区20210位核苷酸G→A的变异与静脉血栓形成有密切联系。随后，Poort对474名深静脉血栓患者进行此变异检测，阳性率为6.2%,而正常对照为2.3%。作者还发现，带有此变异的个体中有87%的FⅡ活性升高。因此，认为此变异是静脉血栓的较常见的原因。随后的研究也证实了这一点[2，3]。然而，在我们的实验中36例正常人，50例静脉血栓患者及51例动脉血栓患者均未检测到FⅡ20210A变异。同时还测定了FⅡ的活性，静脉血栓组中仅1例FⅡ活性升高，动脉血栓组有9例FⅡ活性升高。两种结果的不同表明FⅡ20210A变异的发生可能存在着地区、种族的差异。这一点最近也被台湾学者的实验所证明。据台湾学者报道[5]，在111例确诊静脉血栓及149例正常对照中也未发现有FⅡ20210A变异。
, http://www.100md.com
Rosendaal[6]及其合作者在9个国家的11个检测中心进行了FⅡ20210A变异分布情况的研究，发现FⅡ20210A变异的发生与地理位置和种族有明显关系。这种地理和种族分布的差异性可能是遗传背景的不同、基因的适应性和选择性与环境相互作用的结果。因此，我们认为FⅡ20210A变异在中国人群中的发生率极低，不是中国人易栓症的主要发病原因。其主要发病原因尚需我们进一步研究。
我们的实验中采用了AS-PCR方法检测FⅡ20210A变异。PCR时，引物的最后几个碱基必须与模板严格配对，才可使延伸进行下去。基于这一原理出现了AS-PCR方法。本方法共设计了4条引物，其中引物1和2为一对，扩增片段为270 bp，20210位碱基包含在其中。引物3、4的最后一个碱基恰与20210位配对，引物3为A，引物4为G。正常个体20210位是G，因此引物3可以与模板完全结合，在a管可扩增出2条片段；而引物4则不能与模板完全结合，无法延伸，故在b管中，仅仅扩增出1条带(270 bp)。在20210A变异纯合子时则恰恰相反。这种方法的结果与PCR-限制性内切酶分析法的结果一致。但后者步骤繁琐，操作复杂且检测时间长，不利于常规应用，而AS-PCR方法操作简单，节省时间，大大提高了检测速度，非常有利于临床上大批量标本的检测。
, http://www.100md.com
(感谢Poort 教授和Betina 教授提供阳性标本)。
参考文献
1，Poort SR,Rosendaal FR,Reitsma PH,et al.A common genetic variation in the 3′-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis[J].Blood，1996，88:3698-3703
2，Cumming AM,Keeney S,Salden A,et al.The prothrombin gene G20210A variant:Prevalence in a UK anticoagulant clinic population[J].Br J Haematol，1997，98:353-355
, 百拇医药
3，Hillarp A,Zoller B,Svensson PJ,et al.The 20210 A allele of the prothrombin gene is a common risk factor among Swedish outpatients with verified deep venous thrombosis[J].Thromb Haemost，1997，78:990-992
4，Bertina RM.Rapid detection of the prothrombin 20210A variation by allele specfic PCR[J].Thromb Haemost，1997，78:1157-1163
5，Shen MC.The mutation at position 20210 in the 3′-untranslated reigon of the prothrombin gene is extremely rare in Taiwanese Chinese patients with venous thrombophilia[J].Thromb Haemost，1998，80:343
6，Rosendaal FR,Doggen CJM,Zivelin A,et al.Geographic distribution of the 20210 G to A prothrobin variant[J].Thromb Haemost，1998，79:706-708
收稿日期：2000-06-14, http://www.100md.com
单位：北京大学第一医院检验科，北京 100034
关键词：突变；DNA突变分析；血栓形成
北京医科大学学报000627 [中图分类号]Q343.13 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0570-02
新近研究发现，凝血酶原基因20210位核苷酸 G→A的变异(FⅡ20210A)与血栓性疾病的形成有密切的关系[1～3]。为此，我们对36例正常人、50例静脉血栓患者及51例动脉血栓患者进行了FⅡ20210A变异的检测。
1 材料与方法
, 百拇医药 研究对象：静脉血栓患者50例，其中深静脉血栓 39例，肺栓塞11 例。动脉血栓患者51例，为既往发作过脑梗死或心肌梗死病人，均经CT确诊。以上病人均未服或停服抗凝药一周以上。正常对照组36例，来自我院健康献血员和体检健康者。
标本采集与制备：所有患者及正常对照者均采取清晨空腹抗凝血3 ml，分离出血浆测定FⅡ活性；白细胞用于制备DNA。
FⅡ活性测定：采用一期法，在ACL Futura 全自动凝血仪上完成测定。
DNA分析：采用1988年Miller等报道的盐析法提取白细胞DNA。以等位基因特异的PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)和PCR-限制性内切酶分析法同时分析FⅡ20210A变异。
AS-PCR：引物据 Bertina[4]报道设计，共4条，由赛百盛公司合成。引物3、4仅最后一个碱基不同。每个标本做a、b两管，a管加入引物1、2、3，b管加入引物1、2、4，其余条件相同。反应条件：50 μl反应体系中含50 μ mol.L-1 dNTPs，各约20 pmol的引物1、2，各约40 pmol的引物3或4，0.5～1 μgDNA模板，1～1.5 U的Taq酶。95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，67 ℃退火、延伸2 min，30个循环。用80 g.L-1聚丙烯酰胺电泳-硝酸银染色检查结果。
, 百拇医药
PCR-限制性内切酶酶切：引物据Poort[1]报道设计，由赛百盛公司合成。引物2为突变引物，设计了一个Hind Ⅲ限制性内切酶的酶切位点(-AAGCTT-)。反应条件:50 μl反应体系，其中含50 μmol.L-1 dNTPs，各约20 pmol的引物1、2，0.5～1 μg DNA模板，1～1.5 U的Taq酶。95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，67 ℃退火、延伸2 min，28个循环。酶切反应：10 μl PCR产物，用3 U Hind Ⅲ内切酶，37 ℃酶切过夜，反应体系20 μl。用80 g.L-1聚丙烯酰胺电泳-硝酸银染色检查结果，PCR产物片段长度为345 bp，FⅡ20210A变异体酶切后产生的片段为322 bp和23 bp，由于23 bp片段分子量较小，在聚丙烯酰胺电泳中难以显示。
阳性标本由荷兰Poort博士惠赠，为杂合子型。
, 百拇医药
统计学分析：采用方差分析，P<0.05 为差异有显著性。
2 结果
AS-PCR电泳结果：FⅡ20210A 变异纯合子电泳结果显示：a管两条带(270 bp，148 bp)，b管一条带(270 bp)；若杂合子型则a、b两管均有两条带(270 bp，148 bp)；正常人体为a管一条带(270 bp)，b管两条带(270 bp，148 bp)。在所有样本中未检测到FⅡ20210A变异。
PCR-限制性内切酶分析：在所有样本中未检测到FⅡ20210A变异。
FⅡ活性在3组之间的比较：FⅡ活性在3组之间差异无显著性(P>0.05)。以正常组
±2s为正常参考范围(61.9%～104.6%)，正常组中无FⅡ活性升高者，静脉血栓组有1例升高(116.4%)，动脉血栓组有9例升高。, 百拇医药
3 讨论
凝血因子Ⅱ(FⅡ)即凝血酶原，是凝血酶(FⅡa)的前体，属于维生素K依赖的凝血因子，它同时具有促凝和抗凝活性。因此它的含量、活性及结构的改变对体内的出凝血过程有重要影响。
1996年，Poort[1]等运用PCR及直接测序技术对28例有深静脉血栓家族史的血栓病患者的凝血酶原基因进行了检测，发现在凝血酶原基因的3′-非翻译区20210位核苷酸G→A的变异与静脉血栓形成有密切联系。随后，Poort对474名深静脉血栓患者进行此变异检测，阳性率为6.2%,而正常对照为2.3%。作者还发现，带有此变异的个体中有87%的FⅡ活性升高。因此，认为此变异是静脉血栓的较常见的原因。随后的研究也证实了这一点[2，3]。然而，在我们的实验中36例正常人，50例静脉血栓患者及51例动脉血栓患者均未检测到FⅡ20210A变异。同时还测定了FⅡ的活性，静脉血栓组中仅1例FⅡ活性升高，动脉血栓组有9例FⅡ活性升高。两种结果的不同表明FⅡ20210A变异的发生可能存在着地区、种族的差异。这一点最近也被台湾学者的实验所证明。据台湾学者报道[5]，在111例确诊静脉血栓及149例正常对照中也未发现有FⅡ20210A变异。
, http://www.100md.com
Rosendaal[6]及其合作者在9个国家的11个检测中心进行了FⅡ20210A变异分布情况的研究，发现FⅡ20210A变异的发生与地理位置和种族有明显关系。这种地理和种族分布的差异性可能是遗传背景的不同、基因的适应性和选择性与环境相互作用的结果。因此，我们认为FⅡ20210A变异在中国人群中的发生率极低，不是中国人易栓症的主要发病原因。其主要发病原因尚需我们进一步研究。
我们的实验中采用了AS-PCR方法检测FⅡ20210A变异。PCR时，引物的最后几个碱基必须与模板严格配对，才可使延伸进行下去。基于这一原理出现了AS-PCR方法。本方法共设计了4条引物，其中引物1和2为一对，扩增片段为270 bp，20210位碱基包含在其中。引物3、4的最后一个碱基恰与20210位配对，引物3为A，引物4为G。正常个体20210位是G，因此引物3可以与模板完全结合，在a管可扩增出2条片段；而引物4则不能与模板完全结合，无法延伸，故在b管中，仅仅扩增出1条带(270 bp)。在20210A变异纯合子时则恰恰相反。这种方法的结果与PCR-限制性内切酶分析法的结果一致。但后者步骤繁琐，操作复杂且检测时间长，不利于常规应用，而AS-PCR方法操作简单，节省时间，大大提高了检测速度，非常有利于临床上大批量标本的检测。
, http://www.100md.com
(感谢Poort 教授和Betina 教授提供阳性标本)。
参考文献
1，Poort SR,Rosendaal FR,Reitsma PH,et al.A common genetic variation in the 3′-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis[J].Blood，1996，88:3698-3703
2，Cumming AM,Keeney S,Salden A,et al.The prothrombin gene G20210A variant:Prevalence in a UK anticoagulant clinic population[J].Br J Haematol，1997，98:353-355
, 百拇医药
3，Hillarp A,Zoller B,Svensson PJ,et al.The 20210 A allele of the prothrombin gene is a common risk factor among Swedish outpatients with verified deep venous thrombosis[J].Thromb Haemost，1997，78:990-992
4，Bertina RM.Rapid detection of the prothrombin 20210A variation by allele specfic PCR[J].Thromb Haemost，1997，78:1157-1163
5，Shen MC.The mutation at position 20210 in the 3′-untranslated reigon of the prothrombin gene is extremely rare in Taiwanese Chinese patients with venous thrombophilia[J].Thromb Haemost，1998，80:343
6，Rosendaal FR,Doggen CJM,Zivelin A,et al.Geographic distribution of the 20210 G to A prothrobin variant[J].Thromb Haemost，1998，79:706-708
收稿日期：2000-06-14, http://www.100md.com