幽门螺杆菌细胞毒素的鉴定方法
作者：王化冰 董秀云
单位：王化冰(卫生部北京医院消化科)；董秀云(北京大学第三医院消化科，北京 100083)
关键词：幽门螺杆菌；细胞毒素；VacA,CagA；鉴定
北京医科大学学报000624 [摘 要]目的:探讨幽门螺杆菌临床分离株的毒素鉴定方法。方法:临床分离幽门螺杆菌HB1菌株，以国际标准株NCTC 11637(VacA+ CagA+)和NCTC 11639(VacA- CagA+)为参照，运用细胞培养、PCR、Western blot等技术对HB1进行细胞毒素鉴定。结果:HB1菌株可诱导HeLa细胞发生空泡变性，经PCR检测含cagA基因，Western blot显示87×103及130×103处有蛋白条带。结论:HB1菌株为VacA+ CagA+菌株。
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[中图分类号]R939.1 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0564-03
The methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori
WANG Hua-Bing,DONG Xiu-Yun
(Department of Gastroenterology,Peking University Third Hospital,Beijing 100083,China)
ABSTRACT Objective:To investigate the methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori (H.Pylori) clinical isolate.Methods:H.Pylori strain HB1 was isolated from the biopsy specimen of gastric mucosa and identified its cytotoxin by using the techniques of cell culture,PCR and Western blot.Results:HB1 strain induced vacuolation in HeLa cells.The cagA gene was detected by PCR in HB1 strain.The Western blot analysis showed there were two protein bands of 87×103 and 130×103 in H.pylori water extract.Conclusion:H.pylori clinical isolate HB1 was a VacA+CagA+ strain.
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KEY WORDS Helicobacter pylori;Cytotoxin/VacA,CagA;Identify
自1983年澳大利亚学者Marshall和Warren首次从人胃粘膜中成功地分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)以来，Hp已成为国内外许多专家、学者研究的对象。最近Hp毒素在致病性中的重要作用引起人们广泛关注。根据目前的研究，Hp毒素主要有两种，即空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)和毒素相关基因A(Cytotoxin associated gene A,CagA)。根据这两种蛋白可将Hp分为两种主要类型[1]：Ⅰ型菌株含有cagA基因，表达CagA蛋白，并产生空泡毒素；Ⅱ型菌株缺乏cagA基因，不表达CagA蛋白，不产生空泡毒素。这两型菌株分别占研究总样本的56%和16%，其余28%属中间表型，仅表达CagA或VacA。本实验利用已知毒素特性的Hp国际标准株NCTC 11637和NCTC 11639为参照，对临床分离株HB1进行细胞毒素鉴定，以求探索出一套有效的鉴定方法，以便对不同菌株作进一步研究。
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1 材料与方法
1.1 细菌来源
NCTC 11637(VacA+,CagA+)和NCTC 11639(VacA-,CagA+)由中国预防医学科学院流行病学研究所提供；HB1从十二指肠球溃疡患者胃粘膜活检标本中分离。
1.2 主要试剂
cag A扩增产物为349 bp片段，引物由中国预防医学科学院流行病学研究所惠赠，序列如下：
5′-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3′
5′-CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA-3′
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100 bp Ladder Marker由北京大学基础医学院病理学系提供。高分子蛋白质分子质量标准为Promega公司产品。 第一抗体为混合病人血清，经Helico Blot试剂盒检测CagA抗体及VacA抗体均为阳性。第二抗体(辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG)为中山生物工程公司产品。
1.3 HeLa细胞空泡变性实验
将培养3～4 d的Hp刮入盛有灭菌三蒸水的小离心管中，在涡旋振荡器上充分振荡后，放-20 ℃过夜。取出融化后，再次振荡，12 000 r*min-1离心15 min，TGL-16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)，取上清液用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取对数生长期HeLa细胞，消化后制成细胞悬液，调细胞数后接种于六孔板中。CO2恒温培养箱中孵育24 h，更换培养液后分别加入各型Hp细胞毒素提取液共同孵育24 h。弃去培养液，以甲醇固定10 min，晾干后加Giemsa染液作用20 min，自来水冲洗。镜下观察细胞内是否有空泡形成，若大于50%的细胞形成空泡，则认为该菌株有空泡变性能力。
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1.4 多聚酶链反应(PCR)检测cag A基因
用接种环刮取1/3环细菌，悬于0.5 ml STE缓冲液中，洗涤一次，再以 200 μl TE重悬，100 ℃煮沸5 min，14 000 r*min-1离心10 min，取上清进行扩增反应。经15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察结果。分子质量标准为100 bp Ladder Marker。
1.5 Western blot分析
配制80 g*L-1分离胶和40 g*L-1积层胶，加入电泳缓冲液。据蛋白定量结果每孔加样50 μg进行垂直电泳。电泳结束后电转移至硝酸纤维素(NC)膜上。经丽春红S染色，用针尖标出作为分子质量标准的参照蛋白的位置，然后进行抗原-抗体结合反应，DAB显色。
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2 结果
2.1 HeLa细胞空泡变性实验
阳性对照NCTC 11637毒素提取液使HeLa细胞发生空泡变性；阴性对照NCTC 11639未使HeLa细胞发生空泡变性；临床株 HB1可使HeLa细胞发生空泡变性，提示HB1菌株为VacA+菌株(图1)。
图1 空泡变性实验 ×400
Figure 1 Vacuolating test ×400
2.2 PCR检测
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外检测仪下观察可见：以NCTC 11637、NCTC 11639、HB1 3种菌株的裂解物为模板的扩增产物均出现一DNA带。据DNA Ladder Marker计算约350 bp，提示为cag A。说明3种菌株均属于cag A阳性菌株(图2)。
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2.3 Western blot分析
经与蛋白质分子质量标准比较(已通过丽春红S染色标记条带位置)，在130×103处，3种菌株均有条带，87×103处仅NCTC 11637及HB1有条带，NCTC 11639条带缺如(图3)。
3 讨论
十多年来，大量研究资料表明，Hp感染与胃十二指肠疾病关系密切[2]。所有的Hp感染者在组织学上都有胃炎的表现，但大多数人并无症状，仅一小部分人发展成严重疾病(如消化性溃疡和胃癌)[3]。目前人们对Hp的致病机制还不太清楚，但是导致临床结局不同的一个重要因素在于Hp菌株之间毒力的差异。Hp的几种毒力因子(如鞭毛的动力、粘附因子、脂多糖的内毒素、尿素酶、蛋白水解酶、磷脂酶A和超氧离子歧化酶等)存在于所有的Hp菌株，因此用上述因素并不能完全解释为什么感染Hp者会出现不同的临床后果。
, 百拇医药
图2 PCR检测cagA基因
Figure 2 PCR result for detecting cagA gene
1，HB1;2，NCTC11637;3，NCTC11639.
图3 Western blot分析
Figure 3 Western blot analysis
Hp毒素VacA 和CagA只在大约50%～60%的Hp菌株中产生，并且与胃十二指肠疾病关系密切[4]，编码二者的基因分别称之为vacA和cagA。VacA 蛋白于1988年由Leunk等首先描述，1992年被提纯[5]，在SDS-PAGE上表现为87×103成熟蛋白，可导致真核细胞发生空泡变性，其目标是晚期核内体膜上的Ⅴ型ATP酶[6]。本研究临床分离株HB1经HeLa细胞空泡变性实验显示具有空泡变性能力，提示为VacA+。所有Hp都具有vacA，但并非所有的Hp都有空泡毒素活性，对于这一现象的解释认为，两种Hp的vacA在DNA序列上有所不同，碱基组成上有64.8%的同源性。Cover等[7]的研究显示，大约60%～70%的Hp菌株含有cagA基因，这些菌株均是CagA+，不产生CagA蛋白的Hp没有cagA基因[8]。HB1经PCR检测具有cagA基因，由此推测亦CagA+。cagA基因内部存在重复序列，所以cagA基因和蛋白的大小在Hp菌株间存在差异，CagA蛋白的相对分子质量变动于120×103～140×103。Western blot结果显示，HB1在130×103处可见一杂交条带，相同位置NCTC11637和NCTC11639亦有条带，进一步支持PCR检测结果。同时Western blot分析显示在87×103处，HB1、NCTC11637有杂交带，NCTC11639条带缺如，亦支持HeLa细胞空泡变性实验。综上所述，本实验从功能到结构、从基因到蛋白质对Hp细胞毒素进行了双重鉴定：Hp临床分离株HB1为VacA+和CagA+菌株。从而为HB1的深入研究准备了条件。
, 百拇医药
参考文献
1，Xiang Z,Censini S,Bayeli PF,et al.Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin[J].Infect & Immun,1995,63(1):94-98
2，Kuipers EJ,Meuwissen SGM.Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis[J].Scand J Gastroenterol,1996,31 (218):103-105
, 百拇医药
3，Correa P.Human gastric carcinogenesis:A multistep and multifactorial process-first American cancer society award lecture on cancer epidemiology and prevention[J].Cancer Res,1992,52:6735-6740
4，Weel JFL,van der Hulst RWM,Gerrits Y,et al.The interrelationship between cytotoxin-associated gene A,vacuolating cytotoxin,and Helicobacter pylori-related diseases[J].J Infect Dis,1996,173:1171-1175
5，Cover TL,Blaser MJ.Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori[J].J Biol Chem,1992,267(15):10570-10575
, http://www.100md.com
6，Papini E,Bernard MD,Milia E,et al.Cellular vacuoles induced by Helicobacter pylori originate from late endosomal compartments[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:9720-9724
7，Cover TL,Tummuru MKR,Cao P,et al.Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains[J].J Biol Chem,1994,269(14):10566-10573
8，Covacci A,Censini S,Bugnoli M,et al.Molecular characterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:5791-5795
收稿日期：1999-05-08, http://www.100md.com
单位：王化冰(卫生部北京医院消化科)；董秀云(北京大学第三医院消化科，北京 100083)
关键词：幽门螺杆菌；细胞毒素；VacA,CagA；鉴定
北京医科大学学报000624 [摘 要]目的:探讨幽门螺杆菌临床分离株的毒素鉴定方法。方法:临床分离幽门螺杆菌HB1菌株，以国际标准株NCTC 11637(VacA+ CagA+)和NCTC 11639(VacA- CagA+)为参照，运用细胞培养、PCR、Western blot等技术对HB1进行细胞毒素鉴定。结果:HB1菌株可诱导HeLa细胞发生空泡变性，经PCR检测含cagA基因，Western blot显示87×103及130×103处有蛋白条带。结论:HB1菌株为VacA+ CagA+菌株。
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[中图分类号]R939.1 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0564-03
The methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori
WANG Hua-Bing,DONG Xiu-Yun
(Department of Gastroenterology,Peking University Third Hospital,Beijing 100083,China)
ABSTRACT Objective:To investigate the methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori (H.Pylori) clinical isolate.Methods:H.Pylori strain HB1 was isolated from the biopsy specimen of gastric mucosa and identified its cytotoxin by using the techniques of cell culture,PCR and Western blot.Results:HB1 strain induced vacuolation in HeLa cells.The cagA gene was detected by PCR in HB1 strain.The Western blot analysis showed there were two protein bands of 87×103 and 130×103 in H.pylori water extract.Conclusion:H.pylori clinical isolate HB1 was a VacA+CagA+ strain.
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KEY WORDS Helicobacter pylori;Cytotoxin/VacA,CagA;Identify
自1983年澳大利亚学者Marshall和Warren首次从人胃粘膜中成功地分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)以来，Hp已成为国内外许多专家、学者研究的对象。最近Hp毒素在致病性中的重要作用引起人们广泛关注。根据目前的研究，Hp毒素主要有两种，即空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)和毒素相关基因A(Cytotoxin associated gene A,CagA)。根据这两种蛋白可将Hp分为两种主要类型[1]：Ⅰ型菌株含有cagA基因，表达CagA蛋白，并产生空泡毒素；Ⅱ型菌株缺乏cagA基因，不表达CagA蛋白，不产生空泡毒素。这两型菌株分别占研究总样本的56%和16%，其余28%属中间表型，仅表达CagA或VacA。本实验利用已知毒素特性的Hp国际标准株NCTC 11637和NCTC 11639为参照，对临床分离株HB1进行细胞毒素鉴定，以求探索出一套有效的鉴定方法，以便对不同菌株作进一步研究。
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1 材料与方法
1.1 细菌来源
NCTC 11637(VacA+,CagA+)和NCTC 11639(VacA-,CagA+)由中国预防医学科学院流行病学研究所提供；HB1从十二指肠球溃疡患者胃粘膜活检标本中分离。
1.2 主要试剂
cag A扩增产物为349 bp片段，引物由中国预防医学科学院流行病学研究所惠赠，序列如下：
5′-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3′
5′-CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA-3′
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100 bp Ladder Marker由北京大学基础医学院病理学系提供。高分子蛋白质分子质量标准为Promega公司产品。 第一抗体为混合病人血清，经Helico Blot试剂盒检测CagA抗体及VacA抗体均为阳性。第二抗体(辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG)为中山生物工程公司产品。
1.3 HeLa细胞空泡变性实验
将培养3～4 d的Hp刮入盛有灭菌三蒸水的小离心管中，在涡旋振荡器上充分振荡后，放-20 ℃过夜。取出融化后，再次振荡，12 000 r*min-1离心15 min，TGL-16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)，取上清液用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取对数生长期HeLa细胞，消化后制成细胞悬液，调细胞数后接种于六孔板中。CO2恒温培养箱中孵育24 h，更换培养液后分别加入各型Hp细胞毒素提取液共同孵育24 h。弃去培养液，以甲醇固定10 min，晾干后加Giemsa染液作用20 min，自来水冲洗。镜下观察细胞内是否有空泡形成，若大于50%的细胞形成空泡，则认为该菌株有空泡变性能力。
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1.4 多聚酶链反应(PCR)检测cag A基因
用接种环刮取1/3环细菌，悬于0.5 ml STE缓冲液中，洗涤一次，再以 200 μl TE重悬，100 ℃煮沸5 min，14 000 r*min-1离心10 min，取上清进行扩增反应。经15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察结果。分子质量标准为100 bp Ladder Marker。
1.5 Western blot分析
配制80 g*L-1分离胶和40 g*L-1积层胶，加入电泳缓冲液。据蛋白定量结果每孔加样50 μg进行垂直电泳。电泳结束后电转移至硝酸纤维素(NC)膜上。经丽春红S染色，用针尖标出作为分子质量标准的参照蛋白的位置，然后进行抗原-抗体结合反应，DAB显色。
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2 结果
2.1 HeLa细胞空泡变性实验
阳性对照NCTC 11637毒素提取液使HeLa细胞发生空泡变性；阴性对照NCTC 11639未使HeLa细胞发生空泡变性；临床株 HB1可使HeLa细胞发生空泡变性，提示HB1菌株为VacA+菌株(图1)。
图1 空泡变性实验 ×400
Figure 1 Vacuolating test ×400
2.2 PCR检测
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外检测仪下观察可见：以NCTC 11637、NCTC 11639、HB1 3种菌株的裂解物为模板的扩增产物均出现一DNA带。据DNA Ladder Marker计算约350 bp，提示为cag A。说明3种菌株均属于cag A阳性菌株(图2)。
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2.3 Western blot分析
经与蛋白质分子质量标准比较(已通过丽春红S染色标记条带位置)，在130×103处，3种菌株均有条带，87×103处仅NCTC 11637及HB1有条带，NCTC 11639条带缺如(图3)。
3 讨论
十多年来，大量研究资料表明，Hp感染与胃十二指肠疾病关系密切[2]。所有的Hp感染者在组织学上都有胃炎的表现，但大多数人并无症状，仅一小部分人发展成严重疾病(如消化性溃疡和胃癌)[3]。目前人们对Hp的致病机制还不太清楚，但是导致临床结局不同的一个重要因素在于Hp菌株之间毒力的差异。Hp的几种毒力因子(如鞭毛的动力、粘附因子、脂多糖的内毒素、尿素酶、蛋白水解酶、磷脂酶A和超氧离子歧化酶等)存在于所有的Hp菌株，因此用上述因素并不能完全解释为什么感染Hp者会出现不同的临床后果。
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图2 PCR检测cagA基因
Figure 2 PCR result for detecting cagA gene
1，HB1;2，NCTC11637;3，NCTC11639.
图3 Western blot分析
Figure 3 Western blot analysis
Hp毒素VacA 和CagA只在大约50%～60%的Hp菌株中产生，并且与胃十二指肠疾病关系密切[4]，编码二者的基因分别称之为vacA和cagA。VacA 蛋白于1988年由Leunk等首先描述，1992年被提纯[5]，在SDS-PAGE上表现为87×103成熟蛋白，可导致真核细胞发生空泡变性，其目标是晚期核内体膜上的Ⅴ型ATP酶[6]。本研究临床分离株HB1经HeLa细胞空泡变性实验显示具有空泡变性能力，提示为VacA+。所有Hp都具有vacA，但并非所有的Hp都有空泡毒素活性，对于这一现象的解释认为，两种Hp的vacA在DNA序列上有所不同，碱基组成上有64.8%的同源性。Cover等[7]的研究显示，大约60%～70%的Hp菌株含有cagA基因，这些菌株均是CagA+，不产生CagA蛋白的Hp没有cagA基因[8]。HB1经PCR检测具有cagA基因，由此推测亦CagA+。cagA基因内部存在重复序列，所以cagA基因和蛋白的大小在Hp菌株间存在差异，CagA蛋白的相对分子质量变动于120×103～140×103。Western blot结果显示，HB1在130×103处可见一杂交条带，相同位置NCTC11637和NCTC11639亦有条带，进一步支持PCR检测结果。同时Western blot分析显示在87×103处，HB1、NCTC11637有杂交带，NCTC11639条带缺如，亦支持HeLa细胞空泡变性实验。综上所述，本实验从功能到结构、从基因到蛋白质对Hp细胞毒素进行了双重鉴定：Hp临床分离株HB1为VacA+和CagA+菌株。从而为HB1的深入研究准备了条件。
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参考文献
1，Xiang Z,Censini S,Bayeli PF,et al.Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin[J].Infect & Immun,1995,63(1):94-98
2，Kuipers EJ,Meuwissen SGM.Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis[J].Scand J Gastroenterol,1996,31 (218):103-105
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3，Correa P.Human gastric carcinogenesis:A multistep and multifactorial process-first American cancer society award lecture on cancer epidemiology and prevention[J].Cancer Res,1992,52:6735-6740
4，Weel JFL,van der Hulst RWM,Gerrits Y,et al.The interrelationship between cytotoxin-associated gene A,vacuolating cytotoxin,and Helicobacter pylori-related diseases[J].J Infect Dis,1996,173:1171-1175
5，Cover TL,Blaser MJ.Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori[J].J Biol Chem,1992,267(15):10570-10575
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7，Cover TL,Tummuru MKR,Cao P,et al.Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains[J].J Biol Chem,1994,269(14):10566-10573
8，Covacci A,Censini S,Bugnoli M,et al.Molecular characterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:5791-5795
收稿日期：1999-05-08, http://www.100md.com