甲亢患者心率变异性分析
作者：胡宇美 王关炎 陆广华
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志980614
1型糖尿病是一种在遗传基础上由环境因素触发的慢性自身免疫性疾病，以特异性损伤β细胞为特征〔1〕。1型糖尿病发病前有一段较长的糖尿病前期阶段(prediabetes)，此时1型糖尿病的病理过程已经开始。人们尝试在1型糖尿病前期应用免疫干预治疗以期阻止胰岛的自身免疫过程，达到预防或减轻1型糖尿病的目的。本实验目的是了解应用一种免疫调节剂—卡介苗，能否阻止由环境因素(化学毒素)引起的自身免疫性损伤，并初步探讨其可能的免疫作用机理及其预防1型糖尿病的可行性。
一、材料和方法
1.动物及分组：正常雄性昆明小鼠20只，8周龄，体重20～25g，随机分为A、B两组，各10只，固定饲料，自由饮水。
, 百拇医药
2.试剂及配制：(1)卡介苗：卫生部上海生物制品研究所。0.75mg/支(每mg活菌数：4×106个)。使用时用无菌生理盐水配制成1mg/ml。(2)链脲佐菌素(STZ)：美国Sigma公司，先配制pH 4.2的柠檬酸缓冲液，使用时配制新鲜的STZ注射液。
3.实验方法：实验前测定所有动物的体重、尿糖及非空腹血糖。A组为实验组，分别于腹腔内及后跖部各注入卡介苗(BCG)0.05mg〔3〕，B组为对照组，以同样方法注入等量的生理盐水。2周后，所有动物于腹腔内注射STZ(按40mg*kg-*d-1×5天)，制造1型糖尿病的动物模型。STZ注射后每周测定尿糖及非空腹血糖。
4.观察指标：(1)体重：实验前、后测定所有动物的体重(单位：g)。(2)血糖及尿糖：实验中每周10Am取小鼠尾静脉血测定非空腹血糖，同时用尿糖试纸测定非空腹尿糖。(3)糖尿病发病率：凡尿糖阳性、血糖≥11.1mmol/L者视为糖尿病，并计算其发病率。(4)胰腺组织形态学检查：实验结束时每组随机取6只小鼠，摘除胰腺用Bouin's液固定，石蜡包埋，每个胰腺连续切片3～4张，胰岛炎严重程度按以下标准分级〔4〕：0级：正常小岛，无任何淋巴细胞浸润。1级：局限性胰岛淋巴细胞浸润。2级：胰岛周围较大范围淋巴细胞浸润，但小于1/3小岛面积。3级：淋巴细胞浸润面积占小岛面积的1/3～1/2。4级：小岛内广泛炎症，面积超过小岛面积的1/2伴有胰岛结构破坏。(5)脾脏淋巴细胞对ConA的刺激反应：实验结束后取胰腺的同时在无菌操作下摘除所有动物的脾脏，制备脾细胞悬液，用MTT比色法测定。结果用刺激指数SI(Stimulation Index)表示：SI=试验孔OD均值/对照孔OD均值。
, 百拇医药
表1 A、B两组血糖变化及糖尿病发病率
时间
血糖值(mmol/L)
糖尿病发病率(%)
A组
B组
A组
B组
(10例)
(10例)
(10例)
(10例)
, 百拇医药 实验前
7.22±2.60
7.31±1.90
0
0
BCG注射后
2周
7.32±1.80
7.10±2.0
0
0
STZ注射后
1周
, 百拇医药
7.97±0.76*
10.64±1.57
0
20
2周
8.29±0.84**
11.96±2.66
0
50
3周
8.75±0.94#
13.85±2.63
, 百拇医药
10
80
4周
9.04±1.68#
15.71±3.28
10
80
注：A组与B组比较，*P<0.05，**P<0.01,#P<0.001
表2 A、B两组胰岛炎严重程度比较
组别
例数(只)
, 百拇医药
胰岛炎分级(%)
胰岛总数(个)
0级
1级
2级
3级
4级
A组
6
45(80)
7(12.5)
3(5.25)
1(1.79)
, 百拇医药
0(0)
56
B组
6*
2(3.78)
5(9.4)
10(18.9)
16(30.2)
20(37.7)
53
5.统计学处理：本实验数据用x±s表示，组间均数比较用t检验：糖尿病患病率及胰岛炎严重程度比较用χ2检验，差异显著性水平以P<0.05为标准。统计分析均采用计算机SAS软件。
, 百拇医药
二、结果
1.体重变化：随着实验进行，小鼠的体重逐渐增加，但实验前及6周后两组比较无明显差异。
2.血糖变化及糖尿病发病率：B组血糖逐渐增高，到STZ注射后第四周，8/10血糖>11.1mmol/L，糖尿病发病率为80%；而A组血糖于STZ注射后较稳定，到STZ注射后第四周糖尿病发病率仅为10%。两组血糖值在不同时期比较的P值见表1，糖尿病发病率比较(10%对80%)差异显著(P<0.005)。
3.胰腺组织形态学检查：采用HE染色，每个胰腺观察7～11个胰岛，光镜下见A组绝大多数为正常胰岛，胰岛周围及外分泌腺泡未见淋巴细胞浸润，胰岛炎分级均为0级，个别仅间质内有少量炎性细胞；B组小岛周围及间质内有大量淋巴细胞浸润，胰岛炎分级为1～4级，有的胰岛结构完全破坏，原胰岛所在位置被大量炎性细胞所取代，两组胰岛炎严重程度比较差异显著。详见表2。
, 百拇医药
4.脾脏淋巴细胞对ConA的刺激反应：用SI表示脾脏淋巴细胞对ConA刺激反应的强弱，A组脾脏淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应较对照组B组明显减弱(A组SI为1.22±0.08，B组为1.51±0.04)。
三、讨论
本研究采用一种胰岛β细胞毒素-链脲佐菌素(简称STZ)在昆明小鼠中连续多次小剂量注射，诱导针对胰岛的免疫反应，特异性损伤β细胞，使胰岛素分泌减少，最终产生类似人类1型糖尿病的胰岛炎改变。
临床上，1型糖尿病的早期胰岛素治疗后残存的β细胞功能得以部分恢复，可持续3～6个月，甚至2年，此时若不给予积极治疗，则残存的β细胞将破坏殆尽〔5〕。人们尝试在1型糖尿病的早期，甚至在胰岛的自身免疫反应发生之前应用免疫干预治疗，使β细胞免受自身免疫的攻击，达到预防或减轻1型糖尿病的目的。
BCG作为一种生物反应调节剂，它既能通过佐剂效应非特异性地增强机体的免疫反应，又能通过诱导机体产生抑制性T细胞或抑制性巨噬细胞抑制免疫应答，且作用持久、有效〔6〕。大量实验证明：BCG在体内作用于免疫系统，通过T细胞和巨噬细胞分泌各种细胞因子形成复杂的细胞因子网络发挥免疫调节作用〔7〕。本实验结果发现BCG接种后明显抑制了由STZ引起的胰岛炎及糖尿病，且使脾脏淋巴细胞对ConA的刺激反应较对照组明显减弱。其作用机理目前尚不清楚，我们推测可能是BCG接种后在脾脏产生一种调节性细胞，这种调节性细胞具有抑制T细胞的功能，它转移至胰岛内部，释放抑制性细胞因子如IL-4、IL-10等引出对自身抗原的耐受信号，促使T细胞向Th2细胞分化，并抑制Th1细胞及其细胞因子包括γ-IFN、IL-2、TNF的产生，从而阻止了细胞毒性T细胞对胰岛β细胞的破坏，最终减轻了胰岛炎及糖尿病〔2，8〕。
, http://www.100md.com
目前针对1型糖尿病预防的研究大多来自实验模型，与人类1型糖尿病尚有一定的差异。本实验结果提示：应用一种非特异性的免疫调节剂—卡介苗，抑制了实验动物胰岛炎及糖尿病的发生，且无任何毒副作用，有希望成为早期预防1型糖尿病的一种免疫干预治疗方法。
注：A组与B组比较，*P<0.005
参考文献
1 Christian B, Jean FB. Insulin-dependent diabetes mellitus: an autoimmune disease. In: Norman Talal (ed). Molecular autoimmunity. Academic press, 1991,273.
2 Maclaren N, Lafferty K. The 12th International Immunology and Diabetes Workshop. Diabetes, 1993,42:1099.
, 百拇医药
3 Guytinco R, Quddus J, Richardson B, et al. Single administration of Bacillus Calmette-Guenn (BCG) vaccine in nonobese diabetic mice results in suppression of in vitro T lymphocyte proliferation and regression of insulitis. Diabetes, 1991,40(suppl 1):152A.
4 Zhang ZJ, Davidson L, Eisenbarth G, et al. Suppression of diabetes in nonobese diabetic mice by oral administration of porcine insulin. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:10252.
, 百拇医药
5 Gareth W. IDDM: long honeymoon, sweet ending. Lancet, 1994,343:684.
6 Yagi H, Matsumoto M, Ritsuko S. Possible mechanism of the preventive effect of BCG against diabetes mellitus in NOD mice. I. Generation of suppressor macrophages in spleen cells of BCG-vaccinated mice. Cell Immunol, 1991,138:130.
7 Huygen K, Abramanwicez D, Vandenbussche P. Spleen cell cytokine secretion in mycobacterium bovis BCG-infected mice. Infect Immun, 1992,60(7):2880.
8 Rabinovich A. Immunregulator and cytokine imbalance in the pathogenesis of IDDM: therapeutic intervention by immunostimulation? Diabetes, 1994,43:613.
(收稿：1997-11-10 修回：1998-11-04), 百拇医药
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志980614
1型糖尿病是一种在遗传基础上由环境因素触发的慢性自身免疫性疾病，以特异性损伤β细胞为特征〔1〕。1型糖尿病发病前有一段较长的糖尿病前期阶段(prediabetes)，此时1型糖尿病的病理过程已经开始。人们尝试在1型糖尿病前期应用免疫干预治疗以期阻止胰岛的自身免疫过程，达到预防或减轻1型糖尿病的目的。本实验目的是了解应用一种免疫调节剂—卡介苗，能否阻止由环境因素(化学毒素)引起的自身免疫性损伤，并初步探讨其可能的免疫作用机理及其预防1型糖尿病的可行性。
一、材料和方法
1.动物及分组：正常雄性昆明小鼠20只，8周龄，体重20～25g，随机分为A、B两组，各10只，固定饲料，自由饮水。
, 百拇医药
2.试剂及配制：(1)卡介苗：卫生部上海生物制品研究所。0.75mg/支(每mg活菌数：4×106个)。使用时用无菌生理盐水配制成1mg/ml。(2)链脲佐菌素(STZ)：美国Sigma公司，先配制pH 4.2的柠檬酸缓冲液，使用时配制新鲜的STZ注射液。
3.实验方法：实验前测定所有动物的体重、尿糖及非空腹血糖。A组为实验组，分别于腹腔内及后跖部各注入卡介苗(BCG)0.05mg〔3〕，B组为对照组，以同样方法注入等量的生理盐水。2周后，所有动物于腹腔内注射STZ(按40mg*kg-*d-1×5天)，制造1型糖尿病的动物模型。STZ注射后每周测定尿糖及非空腹血糖。
4.观察指标：(1)体重：实验前、后测定所有动物的体重(单位：g)。(2)血糖及尿糖：实验中每周10Am取小鼠尾静脉血测定非空腹血糖，同时用尿糖试纸测定非空腹尿糖。(3)糖尿病发病率：凡尿糖阳性、血糖≥11.1mmol/L者视为糖尿病，并计算其发病率。(4)胰腺组织形态学检查：实验结束时每组随机取6只小鼠，摘除胰腺用Bouin's液固定，石蜡包埋，每个胰腺连续切片3～4张，胰岛炎严重程度按以下标准分级〔4〕：0级：正常小岛，无任何淋巴细胞浸润。1级：局限性胰岛淋巴细胞浸润。2级：胰岛周围较大范围淋巴细胞浸润，但小于1/3小岛面积。3级：淋巴细胞浸润面积占小岛面积的1/3～1/2。4级：小岛内广泛炎症，面积超过小岛面积的1/2伴有胰岛结构破坏。(5)脾脏淋巴细胞对ConA的刺激反应：实验结束后取胰腺的同时在无菌操作下摘除所有动物的脾脏，制备脾细胞悬液，用MTT比色法测定。结果用刺激指数SI(Stimulation Index)表示：SI=试验孔OD均值/对照孔OD均值。
, 百拇医药
表1 A、B两组血糖变化及糖尿病发病率
时间
血糖值(mmol/L)
糖尿病发病率(%)
A组
B组
A组
B组
(10例)
(10例)
(10例)
(10例)
, 百拇医药 实验前
7.22±2.60
7.31±1.90
0
0
BCG注射后
2周
7.32±1.80
7.10±2.0
0
0
STZ注射后
1周
, 百拇医药
7.97±0.76*
10.64±1.57
0
20
2周
8.29±0.84**
11.96±2.66
0
50
3周
8.75±0.94#
13.85±2.63
, 百拇医药
10
80
4周
9.04±1.68#
15.71±3.28
10
80
注：A组与B组比较，*P<0.05，**P<0.01,#P<0.001
表2 A、B两组胰岛炎严重程度比较
组别
例数(只)
, 百拇医药
胰岛炎分级(%)
胰岛总数(个)
0级
1级
2级
3级
4级
A组
6
45(80)
7(12.5)
3(5.25)
1(1.79)
, 百拇医药
0(0)
56
B组
6*
2(3.78)
5(9.4)
10(18.9)
16(30.2)
20(37.7)
53
5.统计学处理：本实验数据用x±s表示，组间均数比较用t检验：糖尿病患病率及胰岛炎严重程度比较用χ2检验，差异显著性水平以P<0.05为标准。统计分析均采用计算机SAS软件。
, 百拇医药
二、结果
1.体重变化：随着实验进行，小鼠的体重逐渐增加，但实验前及6周后两组比较无明显差异。
2.血糖变化及糖尿病发病率：B组血糖逐渐增高，到STZ注射后第四周，8/10血糖>11.1mmol/L，糖尿病发病率为80%；而A组血糖于STZ注射后较稳定，到STZ注射后第四周糖尿病发病率仅为10%。两组血糖值在不同时期比较的P值见表1，糖尿病发病率比较(10%对80%)差异显著(P<0.005)。
3.胰腺组织形态学检查：采用HE染色，每个胰腺观察7～11个胰岛，光镜下见A组绝大多数为正常胰岛，胰岛周围及外分泌腺泡未见淋巴细胞浸润，胰岛炎分级均为0级，个别仅间质内有少量炎性细胞；B组小岛周围及间质内有大量淋巴细胞浸润，胰岛炎分级为1～4级，有的胰岛结构完全破坏，原胰岛所在位置被大量炎性细胞所取代，两组胰岛炎严重程度比较差异显著。详见表2。
, 百拇医药
4.脾脏淋巴细胞对ConA的刺激反应：用SI表示脾脏淋巴细胞对ConA刺激反应的强弱，A组脾脏淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应较对照组B组明显减弱(A组SI为1.22±0.08，B组为1.51±0.04)。
三、讨论
本研究采用一种胰岛β细胞毒素-链脲佐菌素(简称STZ)在昆明小鼠中连续多次小剂量注射，诱导针对胰岛的免疫反应，特异性损伤β细胞，使胰岛素分泌减少，最终产生类似人类1型糖尿病的胰岛炎改变。
临床上，1型糖尿病的早期胰岛素治疗后残存的β细胞功能得以部分恢复，可持续3～6个月，甚至2年，此时若不给予积极治疗，则残存的β细胞将破坏殆尽〔5〕。人们尝试在1型糖尿病的早期，甚至在胰岛的自身免疫反应发生之前应用免疫干预治疗，使β细胞免受自身免疫的攻击，达到预防或减轻1型糖尿病的目的。
BCG作为一种生物反应调节剂，它既能通过佐剂效应非特异性地增强机体的免疫反应，又能通过诱导机体产生抑制性T细胞或抑制性巨噬细胞抑制免疫应答，且作用持久、有效〔6〕。大量实验证明：BCG在体内作用于免疫系统，通过T细胞和巨噬细胞分泌各种细胞因子形成复杂的细胞因子网络发挥免疫调节作用〔7〕。本实验结果发现BCG接种后明显抑制了由STZ引起的胰岛炎及糖尿病，且使脾脏淋巴细胞对ConA的刺激反应较对照组明显减弱。其作用机理目前尚不清楚，我们推测可能是BCG接种后在脾脏产生一种调节性细胞，这种调节性细胞具有抑制T细胞的功能，它转移至胰岛内部，释放抑制性细胞因子如IL-4、IL-10等引出对自身抗原的耐受信号，促使T细胞向Th2细胞分化，并抑制Th1细胞及其细胞因子包括γ-IFN、IL-2、TNF的产生，从而阻止了细胞毒性T细胞对胰岛β细胞的破坏，最终减轻了胰岛炎及糖尿病〔2，8〕。
, http://www.100md.com
目前针对1型糖尿病预防的研究大多来自实验模型，与人类1型糖尿病尚有一定的差异。本实验结果提示：应用一种非特异性的免疫调节剂—卡介苗，抑制了实验动物胰岛炎及糖尿病的发生，且无任何毒副作用，有希望成为早期预防1型糖尿病的一种免疫干预治疗方法。
注：A组与B组比较，*P<0.005
参考文献
1 Christian B, Jean FB. Insulin-dependent diabetes mellitus: an autoimmune disease. In: Norman Talal (ed). Molecular autoimmunity. Academic press, 1991,273.
2 Maclaren N, Lafferty K. The 12th International Immunology and Diabetes Workshop. Diabetes, 1993,42:1099.
, 百拇医药
3 Guytinco R, Quddus J, Richardson B, et al. Single administration of Bacillus Calmette-Guenn (BCG) vaccine in nonobese diabetic mice results in suppression of in vitro T lymphocyte proliferation and regression of insulitis. Diabetes, 1991,40(suppl 1):152A.
4 Zhang ZJ, Davidson L, Eisenbarth G, et al. Suppression of diabetes in nonobese diabetic mice by oral administration of porcine insulin. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:10252.
, 百拇医药
5 Gareth W. IDDM: long honeymoon, sweet ending. Lancet, 1994,343:684.
6 Yagi H, Matsumoto M, Ritsuko S. Possible mechanism of the preventive effect of BCG against diabetes mellitus in NOD mice. I. Generation of suppressor macrophages in spleen cells of BCG-vaccinated mice. Cell Immunol, 1991,138:130.
7 Huygen K, Abramanwicez D, Vandenbussche P. Spleen cell cytokine secretion in mycobacterium bovis BCG-infected mice. Infect Immun, 1992,60(7):2880.
8 Rabinovich A. Immunregulator and cytokine imbalance in the pathogenesis of IDDM: therapeutic intervention by immunostimulation? Diabetes, 1994,43:613.
(收稿：1997-11-10 修回：1998-11-04), 百拇医药