用直接法原位聚合酶链反应检测肝组织中HCV RNA
作者：杨志国 许家璋 徐俊杰 乐美兆 苏长青
单位：
关键词：
一 一、材料与方法
1.材料：取血清HCV RNA及/或抗HCV-IgG阳性的丙型肝炎肝脏活检标本，经10%福马林固定，石蜡包埋。
2.试剂：HCV RNA引物选自5′端非编码区，限定扩增产物长度为240 bp，由军事医学科学院五所合成馈赠；Taq DNA聚合酶、dNTPs、AMV反转录酶(AMV-RT)、脱氧核糖核酸酶(DNase，RNase-free)、生物素-11-dUTP、卵白素-辣根过氧化物酶(HRP)均购自华美生物工程公司。
3.仪器：美国PE公司产1 000型原位扩增仪。
4.方法：(1)石蜡切片厚6～8 μm，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水中展片，烘干；(2)脱蜡水化，室温晾干；(3) 2 000 U/ml胃蛋白酶消化，室温15分钟，梯度酒精脱水，晾干；(4)1 U/μl DNase消化，37℃7小时，脱水晾干；(5)反转录，反应液组成：1×PCR缓冲液，5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTPs、1 μmol/L随机引物、10 UAMV-RT，42℃60分钟，脱水晾干；(6)原位扩增，反应液组成：1×PCR缓冲液，4.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、20 μmol/L生物素-11-dUTP、0.8 μmol/L HCV RNA引物(正义、反义)，70℃10分钟后加入10 U Taq酶，94℃2分钟后94℃40秒、50℃30秒、72℃60秒循环30次；(7)扩增产物检测：先以0.1×SSC(含0.2%牛血清白蛋白)45℃5分钟，再以卵白素-HRP亲和30分钟，DAB显色30分钟后终止反应，脱水封固；(8)镜下观察。
5.阴性对照(同一病例组织切片)：(1)逆转录反应液中不加AMV-RT，(2)PCR反应液中不加引物。
二、结果
对确诊的1例急性丙肝(其血清HCV RNA及抗HCV-IgG均阳性)和1例慢性丙肝(HCV RNA阴性，抗HCV-IgG阳性)进行了HCV RNA的原位PCR检测，结果均为阳性，其阳性信号均分布在肝细胞浆中，均呈弥漫性棕色细颗粒状(附图)，间质细胞内均未见阳性信号。
三、讨论
普通液相PCR，扩增前需将组织细胞裂解，难以判断组织细胞的形态结构和细胞类型；免疫组化技术检测肝组织中HCVAg，其抗原分布各家报道结果不一；原位杂交技术检测肝组织中HCV RNA虽特异性较高，但不能检出低于10～20挎贝的RNA序列，张长法等用此法检测的7例抗HCV-IgG阳性(HCV RNA阴性)的病例中无1例为阳性。我们采用直接法原位PCR检测的1例慢性丙型肝炎病例曾经用α-干扰素治疗3个月(300 万U，1次/隔日)，其血清HCV RNA阴转，而在肝组织中仍能检出HCV RNA，提示本方法敏感性较高，也为临床使用干扰素治疗应坚持长疗程提供了证据。本方法操作规程中均用DNase进行消化预处理，进一步消除了生物素-11-dUTP非特异掺入受损DNA的可能性，提高了本法的特异性。
(收稿：1997-02-05 修回：1997-06-19), 百拇医药
单位：
关键词：
一 一、材料与方法
1.材料：取血清HCV RNA及/或抗HCV-IgG阳性的丙型肝炎肝脏活检标本，经10%福马林固定，石蜡包埋。
2.试剂：HCV RNA引物选自5′端非编码区，限定扩增产物长度为240 bp，由军事医学科学院五所合成馈赠；Taq DNA聚合酶、dNTPs、AMV反转录酶(AMV-RT)、脱氧核糖核酸酶(DNase，RNase-free)、生物素-11-dUTP、卵白素-辣根过氧化物酶(HRP)均购自华美生物工程公司。
3.仪器：美国PE公司产1 000型原位扩增仪。
4.方法：(1)石蜡切片厚6～8 μm，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水中展片，烘干；(2)脱蜡水化，室温晾干；(3) 2 000 U/ml胃蛋白酶消化，室温15分钟，梯度酒精脱水，晾干；(4)1 U/μl DNase消化，37℃7小时，脱水晾干；(5)反转录，反应液组成：1×PCR缓冲液，5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTPs、1 μmol/L随机引物、10 UAMV-RT，42℃60分钟，脱水晾干；(6)原位扩增，反应液组成：1×PCR缓冲液，4.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、20 μmol/L生物素-11-dUTP、0.8 μmol/L HCV RNA引物(正义、反义)，70℃10分钟后加入10 U Taq酶，94℃2分钟后94℃40秒、50℃30秒、72℃60秒循环30次；(7)扩增产物检测：先以0.1×SSC(含0.2%牛血清白蛋白)45℃5分钟，再以卵白素-HRP亲和30分钟，DAB显色30分钟后终止反应，脱水封固；(8)镜下观察。
5.阴性对照(同一病例组织切片)：(1)逆转录反应液中不加AMV-RT，(2)PCR反应液中不加引物。
二、结果
对确诊的1例急性丙肝(其血清HCV RNA及抗HCV-IgG均阳性)和1例慢性丙肝(HCV RNA阴性，抗HCV-IgG阳性)进行了HCV RNA的原位PCR检测，结果均为阳性，其阳性信号均分布在肝细胞浆中，均呈弥漫性棕色细颗粒状(附图)，间质细胞内均未见阳性信号。
三、讨论
普通液相PCR，扩增前需将组织细胞裂解，难以判断组织细胞的形态结构和细胞类型；免疫组化技术检测肝组织中HCVAg，其抗原分布各家报道结果不一；原位杂交技术检测肝组织中HCV RNA虽特异性较高，但不能检出低于10～20挎贝的RNA序列，张长法等用此法检测的7例抗HCV-IgG阳性(HCV RNA阴性)的病例中无1例为阳性。我们采用直接法原位PCR检测的1例慢性丙型肝炎病例曾经用α-干扰素治疗3个月(300 万U，1次/隔日)，其血清HCV RNA阴转，而在肝组织中仍能检出HCV RNA，提示本方法敏感性较高，也为临床使用干扰素治疗应坚持长疗程提供了证据。本方法操作规程中均用DNase进行消化预处理，进一步消除了生物素-11-dUTP非特异掺入受损DNA的可能性，提高了本法的特异性。
(收稿：1997-02-05 修回：1997-06-19), 百拇医药