亚硝基胍诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中p53、ras基因表达和突变的研究
作者：孟振行 雷道年 王江 吴晓 李豪侠 郭山春
单位：
关键词：
New Page 1 【摘要】 目的 探讨p53、ras基因在亚硝基胍(N-methyl-N′nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中的作用。方法 用免疫组织化学、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术对大鼠正常腺胃粘膜、癌前病变和胃腺癌组织中p53，ras基因的表达和突变进行检测。结果 p53蛋白在癌组织中的阳性表达率为50%(20/40只)，正常和癌前病变组织中为阴性；ras蛋白(p21)癌前病变组织中阳性率为44%(23/52只)，在癌组织中为23%(9/40只)。癌组织中p53基因突变率为45%(18/40只)，非癌组织为阴性。癌组织及癌前病变组织中均未发现ras基因突变。结论 在MNNG诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中，ras基因的激活是一早期事件，可能参与了癌的发生过程，而p53突变则主要与胃癌的进展有关。
, http://www.100md.com
Expression and mutation of p53 and H-ras genes in the carcinogenesis and development of gastric adenocancinoma induced by MNNG in rats Meng Zhenhang, Lei Daonian, Wang Jiang, et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of p53 and H-ras genes in the carcinogenesis of and development of gastric cancer induced by N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) in Wistar rats. Methods The expression of p53 and H-ras genes in normal mucosa, precancerous lesions and induced-cancers were studied immunohistochemically. DNA isolated from the precancerous lesion and tumors were analysized by PCR-SSCP for exon 5-8 of p53 gene and exon 1 and 2 of H-ras gene. Results p53 protein were detected in 50% (20/40) of the gastric cancers studied, but not in the precancerous lesion, while p21 ras protein seen in 23% (9/40) of the gastric cancers and 44% (23/52) of the precancerous lesions. p53 gene mutations were detected in 45% (18/40) of the cancers and none in the precancerous lesions by PCR-SSCP. H-ras gene mutation was not found in either the cancers or the precancerous lesions. Conclusions The activation of ras gene is an early event and may be involved in the carcinogenesis of gastric cancer induced by MNNG. Inactivaton of p53 gene may influence the development of the cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Animal testing alternatives Stomach neoplasms Genes,p53 Genes, ras
大量研究显示，细胞癌变及恶性肿瘤的形成是多因素、多阶段、多基因变异所致的结果。癌变过程的每一个阶段都存在癌基因和抗癌基因一系列变化[1，2]。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的一种抑癌基因[3，4]，p53基因的缺失和突变可引起细胞恶性增殖，导致肿瘤的发生。p53基因通常与异常激活的癌基因协同作用[5]。许多研究也表明，ras基因的激活与多种人类肿瘤的发生密切相关[6]。亚硝酰胺类化合物是与人类胃癌发生密切相关的致癌剂，我们利用其代表物亚硝基胍(MNNG)诱发大鼠胃腺癌和癌前病变模型，并对p53基因、H-ras基因在不同病变组织中的表达和突变进行了研究，旨在探讨p53、H-ras基因在胃癌发生发展过程中的作用。
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材料与方法
1.实验性胃癌模型：Wistar雄性大鼠90只(北京医科大学实验动物中心提供)。4周龄，体重45～55g，分为模型组80只，对照组10只，分笼常规饲养。模型组动物饲水中加入MNNG，终浓度为8×104μg/L，连续用药9个月，停药后继续常规饲养至12个月。对照组动物饮用自来水。实验满12个月时乙醚麻醉下处死动物，将胃沿大弯侧切开，在胃窦部沿小弯侧及肿瘤部位取材 ，用于石蜡切片，另取 0.5～1.0g新鲜组织提取DNA。
2.免疫组化染色：用ABC法，p53抗体(CM-5)由英国Dundee大学Davie教授赠送，H-ras(259)单抗购于Santa Cruza公司，ABC试剂盒购于Vector公司。用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染。结果判断：组织中至少有一群粘膜(腺)上皮细胞胞浆(p21ras)或胞核(p53)有明显的DAB染色(棕黄色)者判断为阳性。实验以正常大鼠胃粘膜组织作阴性对照，以已知阳性胃癌标本作阳性对照。
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3.PCR反应：用蛋白酶K-酚-氯仿方法提取癌前病变、胃癌组织DNA，正常对照用正常大鼠胃粘膜组织。用PCR扩增p53基因第5、6、7、8外显子及H-ras基因第1、2外显子，引物序列及有关资料见附表。PCR反应体系为25 μl，含模板DNA 150～250 ng，上下游引物各50 pmol，Taq DNA聚合酶1U。反应条件：94℃变性2分钟，然后94℃ 45秒，退火温度和时间见附表，72℃ 30秒，35个循环后72℃延伸5分钟，反应完成后，取5 μl PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
附表 p53、H-ras基因PCR扩增引物序列
基因
外显
子
引物序列(5′→3′)
, 百拇医药
产物
长度
退火温
度(℃)
时间
(s)
p53
5
ACT CAA TTT CCC TCA ATA AG
180 BP
46
50
CAC CAT CAG AGC AAC GCT CA
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6
TAT TCT TGC TCT TAG GCC TG
235 bp
55
40
GAG TCT TCC AGC GTG ATG AT
7
CCG GGT AGT GGG AAT CTT
CTG G
206 bp
58
40
, 百拇医药
AAG GGG TGA CTT TGG GGT
CAA
8
GAG GTG AGC AGG CAG GAC
152 bp
50
40
AAG GGT GAA ATA TTC TCC
ATC G
H-ras
1
TGA TTC TCA TTG GCA GGT GG
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152 bp
50
35
GAG CTC ACC TCT ATA GTG G
2
CCC GAA ACA GGT AGT CAT
TGA T
152 bp
50
35
GGT CAC CTG TAC TGA TGG
ATG T
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4.SSCP分析：取5 μl PCR产物与等量加样缓冲液(95%去离子甲酰胺，20 mmol/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青蓝)混合，沸水中煮10分钟变性后迅速放入冰浴中，上样于8%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)，在1×TBE中电泳，4℃，50 V，12小时。电泳结束后将凝胶置于含30%乙醇和10%乙酸的溶液中平缓摇动10小时(固定)，然后30%乙醇漂洗2次，每次10分钟，再用三蒸漂洗3次，每次10分钟。0.1% AgNO3溶液染色30分钟，三蒸水快洗，2.5% Na2CO3-0.02%甲醛中显影至条带清晰，用1%乙酸终止显色反应5分钟。玻璃纸封胶自然风干，可长期保存。结果
1.p53基因、ras基因蛋白表达的免疫组化结果：胃癌组织中p53蛋白阳性颗粒均在胞核中(图1)，阳性率为50%(20/40只)。早期癌p53蛋白5只阳性，进展期胃癌15只阳性(包括2只有肝转移者)。癌前病变组织及正常对照组胃粘膜未见p53阳性染色。p21ras在肠化和异型增生组织中阳性率为44%(23/52只)，胃腺癌中为23%(9/40只)，在少数形态正常的粘膜腺颈部或底部可见少数散在的p21阳性细胞。p21蛋白定位于胞浆和胞膜(图2)。
, 百拇医药
图1 胃腺癌组织p53蛋白免疫组化阳性，棕黄色颗粒定位于细胞核 ABC法×200 图2 胃粘膜肠上皮化生组织p21蛋白免疫组化阳性，棕黄色颗粒定位于细胞浆 ABC法×200
2.PCR-SSCP结果：与正常对照比较，存在突变的肿瘤标本呈现异常条带，包括单链条带泳动变位、缺失或多带。胃癌组织中p53突变率为45%(18/40只)，见图3，其中第5外显子7例，第6外显子11只突变，癌前病变组织未见突变。PCR-SSCP与免疫组化结果相比有3只不一致，其中2只免疫组化阳性，而PCR-SSCP阴性，1只免疫组化阴性。而PCR-SSCP阳性。p53基因第7、8外显子未见突变。ras基因第1、2外显子在癌前病变及癌组织中均未发现突变。
箭头所指为异常泳动带，N：正常对照组织，T：肿瘤组织图3 p53基因第5外显子(左)，第6外显子(右)
, 百拇医药
SSCP结果
讨论
近年来人们对p53和ras基因的研究倾注了极大的热情。研究显示，p53基因的失活及ras基因的激活在人类肿瘤发生发展过程中起着重要作用，但对MNNG诱发动物实验性胃癌过程中p53和ras基因改变研究极少。本实验用MNNG所诱发的大鼠胃癌均为腺癌，其发生过程也与人类胃癌相似，即多经历由胃粘膜腺体肠上皮化生、不典型增生到癌变的过程。进一步研究显示，MNNG在诱发大鼠实验性胃癌发生发展过程中引起p53基因突变，并可激活H-ras基因使其表达升高，但不引起H-ras基因突变。
人类野生型p53基因定位于染色体17p13，突变热点为5～8外显子，大鼠p53基因定位于11号染色体。野生型p53基因表达的蛋白半衰期甚短，一般检测方法难以检出，而当基因发生突变时，其表达的蛋白质构型发生改变，半衰期延长，因此免疫组化测得的p53蛋白为突变型蛋白[7]。野生型p53基因在正常细胞生长分化过程中起着负调控作用。而突变的p53基因则失去了野生型p53功能，能与激活的ras基因一起转化原代细胞[3]。p53基因的缺失或突变可引起细胞恶性增殖，导致肿瘤发生。我们的研究显示，p53基因突变集中在第5、6外显子，可能为MNNG致癌的特异性改变。提示检测胃癌组织中p53基因的突变情况对推测其病因有一定意义，可为胃癌的预防提供依据。我们研究显示p53基因突变多出现在进展期胃癌，提示p53基因突变可能与胃癌进展有关，与Kakeji等[8]的观点一致。
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许多研究表明ras基因的激活与细胞癌变有关，很多恶性肿瘤中有ras基因的突变和ras蛋白的过量表达。我们的实验结果表明，ras蛋白高表达出现在肠化和异型增生的胃粘膜组织中，而癌组织中阳性率反而降低。PCR-SSCP检测在胃癌组织及癌前病变组织中均未发现突变，提示可能是MNNG通过某种不使基因突变途径激活H-ras基因，H-ras基因的高水平表达与细胞增殖有关。在9只ras蛋白呈阳性表达的胃癌标本中有7只p53蛋白也呈阳性染色，两者存在相关性，显示p53基因的突变和H-ras基因的激活在胃癌的发生发展过程中有一定的协同作用。
参考文献
1 Bishop JM. The molecular genetics of cancer. Science, 1987, 226：235-242.
2 Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990, 61：79-86.
, 百拇医药
3 Hinds P, Finlay C, Levine AJ. Mutation is required to activate the p53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. J Virol, 1989, 63：739-743.
4 Levine AJ, Momond J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene. Nature, 1991, 351：453-456.
5 Nigro JM, Baker SJ, Preisinger AC, et al. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumor types. Nature, 1989, 342：705-707.
6 Gonzalez AF, Deangelo AB, Nasim S, et al. Ras oncogene activation during hepato carcinogenesis in B6C3F1 male mice by dichloroacetic and trichloroacetic acids. Carcinogenesis, 1995, 16：495-500.
7 Donehower LA, Bradley A. The tumor suppressor p53. Biochem Biophys Acta, 1993, 1155：181-186.
8 Kakeji Y, Korenaga D, Tsujitani S, et al. Gastric cancer with p53 overexpression has high potential for metastasising to lymph nodes. Br J Cancer, 1993, 67：589-593.
(收稿：1997-04-13 修回：1997-11-10), 百拇医药
单位：
关键词：
New Page 1 【摘要】 目的 探讨p53、ras基因在亚硝基胍(N-methyl-N′nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中的作用。方法 用免疫组织化学、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术对大鼠正常腺胃粘膜、癌前病变和胃腺癌组织中p53，ras基因的表达和突变进行检测。结果 p53蛋白在癌组织中的阳性表达率为50%(20/40只)，正常和癌前病变组织中为阴性；ras蛋白(p21)癌前病变组织中阳性率为44%(23/52只)，在癌组织中为23%(9/40只)。癌组织中p53基因突变率为45%(18/40只)，非癌组织为阴性。癌组织及癌前病变组织中均未发现ras基因突变。结论 在MNNG诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中，ras基因的激活是一早期事件，可能参与了癌的发生过程，而p53突变则主要与胃癌的进展有关。
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Expression and mutation of p53 and H-ras genes in the carcinogenesis and development of gastric adenocancinoma induced by MNNG in rats Meng Zhenhang, Lei Daonian, Wang Jiang, et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of p53 and H-ras genes in the carcinogenesis of and development of gastric cancer induced by N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) in Wistar rats. Methods The expression of p53 and H-ras genes in normal mucosa, precancerous lesions and induced-cancers were studied immunohistochemically. DNA isolated from the precancerous lesion and tumors were analysized by PCR-SSCP for exon 5-8 of p53 gene and exon 1 and 2 of H-ras gene. Results p53 protein were detected in 50% (20/40) of the gastric cancers studied, but not in the precancerous lesion, while p21 ras protein seen in 23% (9/40) of the gastric cancers and 44% (23/52) of the precancerous lesions. p53 gene mutations were detected in 45% (18/40) of the cancers and none in the precancerous lesions by PCR-SSCP. H-ras gene mutation was not found in either the cancers or the precancerous lesions. Conclusions The activation of ras gene is an early event and may be involved in the carcinogenesis of gastric cancer induced by MNNG. Inactivaton of p53 gene may influence the development of the cancer.
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【Key words】 Animal testing alternatives Stomach neoplasms Genes,p53 Genes, ras
大量研究显示，细胞癌变及恶性肿瘤的形成是多因素、多阶段、多基因变异所致的结果。癌变过程的每一个阶段都存在癌基因和抗癌基因一系列变化[1，2]。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的一种抑癌基因[3，4]，p53基因的缺失和突变可引起细胞恶性增殖，导致肿瘤的发生。p53基因通常与异常激活的癌基因协同作用[5]。许多研究也表明，ras基因的激活与多种人类肿瘤的发生密切相关[6]。亚硝酰胺类化合物是与人类胃癌发生密切相关的致癌剂，我们利用其代表物亚硝基胍(MNNG)诱发大鼠胃腺癌和癌前病变模型，并对p53基因、H-ras基因在不同病变组织中的表达和突变进行了研究，旨在探讨p53、H-ras基因在胃癌发生发展过程中的作用。
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材料与方法
1.实验性胃癌模型：Wistar雄性大鼠90只(北京医科大学实验动物中心提供)。4周龄，体重45～55g，分为模型组80只，对照组10只，分笼常规饲养。模型组动物饲水中加入MNNG，终浓度为8×104μg/L，连续用药9个月，停药后继续常规饲养至12个月。对照组动物饮用自来水。实验满12个月时乙醚麻醉下处死动物，将胃沿大弯侧切开，在胃窦部沿小弯侧及肿瘤部位取材 ，用于石蜡切片，另取 0.5～1.0g新鲜组织提取DNA。
2.免疫组化染色：用ABC法，p53抗体(CM-5)由英国Dundee大学Davie教授赠送，H-ras(259)单抗购于Santa Cruza公司，ABC试剂盒购于Vector公司。用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染。结果判断：组织中至少有一群粘膜(腺)上皮细胞胞浆(p21ras)或胞核(p53)有明显的DAB染色(棕黄色)者判断为阳性。实验以正常大鼠胃粘膜组织作阴性对照，以已知阳性胃癌标本作阳性对照。
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3.PCR反应：用蛋白酶K-酚-氯仿方法提取癌前病变、胃癌组织DNA，正常对照用正常大鼠胃粘膜组织。用PCR扩增p53基因第5、6、7、8外显子及H-ras基因第1、2外显子，引物序列及有关资料见附表。PCR反应体系为25 μl，含模板DNA 150～250 ng，上下游引物各50 pmol，Taq DNA聚合酶1U。反应条件：94℃变性2分钟，然后94℃ 45秒，退火温度和时间见附表，72℃ 30秒，35个循环后72℃延伸5分钟，反应完成后，取5 μl PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
附表 p53、H-ras基因PCR扩增引物序列
基因
外显
子
引物序列(5′→3′)
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产物
长度
退火温
度(℃)
时间
(s)
p53
5
ACT CAA TTT CCC TCA ATA AG
180 BP
46
50
CAC CAT CAG AGC AAC GCT CA
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6
TAT TCT TGC TCT TAG GCC TG
235 bp
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40
GAG TCT TCC AGC GTG ATG AT
7
CCG GGT AGT GGG AAT CTT
CTG G
206 bp
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AAG GGG TGA CTT TGG GGT
CAA
8
GAG GTG AGC AGG CAG GAC
152 bp
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AAG GGT GAA ATA TTC TCC
ATC G
H-ras
1
TGA TTC TCA TTG GCA GGT GG
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152 bp
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GAG CTC ACC TCT ATA GTG G
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CCC GAA ACA GGT AGT CAT
TGA T
152 bp
50
35
GGT CAC CTG TAC TGA TGG
ATG T
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4.SSCP分析：取5 μl PCR产物与等量加样缓冲液(95%去离子甲酰胺，20 mmol/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青蓝)混合，沸水中煮10分钟变性后迅速放入冰浴中，上样于8%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)，在1×TBE中电泳，4℃，50 V，12小时。电泳结束后将凝胶置于含30%乙醇和10%乙酸的溶液中平缓摇动10小时(固定)，然后30%乙醇漂洗2次，每次10分钟，再用三蒸漂洗3次，每次10分钟。0.1% AgNO3溶液染色30分钟，三蒸水快洗，2.5% Na2CO3-0.02%甲醛中显影至条带清晰，用1%乙酸终止显色反应5分钟。玻璃纸封胶自然风干，可长期保存。结果
1.p53基因、ras基因蛋白表达的免疫组化结果：胃癌组织中p53蛋白阳性颗粒均在胞核中(图1)，阳性率为50%(20/40只)。早期癌p53蛋白5只阳性，进展期胃癌15只阳性(包括2只有肝转移者)。癌前病变组织及正常对照组胃粘膜未见p53阳性染色。p21ras在肠化和异型增生组织中阳性率为44%(23/52只)，胃腺癌中为23%(9/40只)，在少数形态正常的粘膜腺颈部或底部可见少数散在的p21阳性细胞。p21蛋白定位于胞浆和胞膜(图2)。
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图1 胃腺癌组织p53蛋白免疫组化阳性，棕黄色颗粒定位于细胞核 ABC法×200 图2 胃粘膜肠上皮化生组织p21蛋白免疫组化阳性，棕黄色颗粒定位于细胞浆 ABC法×200
2.PCR-SSCP结果：与正常对照比较，存在突变的肿瘤标本呈现异常条带，包括单链条带泳动变位、缺失或多带。胃癌组织中p53突变率为45%(18/40只)，见图3，其中第5外显子7例，第6外显子11只突变，癌前病变组织未见突变。PCR-SSCP与免疫组化结果相比有3只不一致，其中2只免疫组化阳性，而PCR-SSCP阴性，1只免疫组化阴性。而PCR-SSCP阳性。p53基因第7、8外显子未见突变。ras基因第1、2外显子在癌前病变及癌组织中均未发现突变。
箭头所指为异常泳动带，N：正常对照组织，T：肿瘤组织图3 p53基因第5外显子(左)，第6外显子(右)
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SSCP结果
讨论
近年来人们对p53和ras基因的研究倾注了极大的热情。研究显示，p53基因的失活及ras基因的激活在人类肿瘤发生发展过程中起着重要作用，但对MNNG诱发动物实验性胃癌过程中p53和ras基因改变研究极少。本实验用MNNG所诱发的大鼠胃癌均为腺癌，其发生过程也与人类胃癌相似，即多经历由胃粘膜腺体肠上皮化生、不典型增生到癌变的过程。进一步研究显示，MNNG在诱发大鼠实验性胃癌发生发展过程中引起p53基因突变，并可激活H-ras基因使其表达升高，但不引起H-ras基因突变。
人类野生型p53基因定位于染色体17p13，突变热点为5～8外显子，大鼠p53基因定位于11号染色体。野生型p53基因表达的蛋白半衰期甚短，一般检测方法难以检出，而当基因发生突变时，其表达的蛋白质构型发生改变，半衰期延长，因此免疫组化测得的p53蛋白为突变型蛋白[7]。野生型p53基因在正常细胞生长分化过程中起着负调控作用。而突变的p53基因则失去了野生型p53功能，能与激活的ras基因一起转化原代细胞[3]。p53基因的缺失或突变可引起细胞恶性增殖，导致肿瘤发生。我们的研究显示，p53基因突变集中在第5、6外显子，可能为MNNG致癌的特异性改变。提示检测胃癌组织中p53基因的突变情况对推测其病因有一定意义，可为胃癌的预防提供依据。我们研究显示p53基因突变多出现在进展期胃癌，提示p53基因突变可能与胃癌进展有关，与Kakeji等[8]的观点一致。
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许多研究表明ras基因的激活与细胞癌变有关，很多恶性肿瘤中有ras基因的突变和ras蛋白的过量表达。我们的实验结果表明，ras蛋白高表达出现在肠化和异型增生的胃粘膜组织中，而癌组织中阳性率反而降低。PCR-SSCP检测在胃癌组织及癌前病变组织中均未发现突变，提示可能是MNNG通过某种不使基因突变途径激活H-ras基因，H-ras基因的高水平表达与细胞增殖有关。在9只ras蛋白呈阳性表达的胃癌标本中有7只p53蛋白也呈阳性染色，两者存在相关性，显示p53基因的突变和H-ras基因的激活在胃癌的发生发展过程中有一定的协同作用。
参考文献
1 Bishop JM. The molecular genetics of cancer. Science, 1987, 226：235-242.
2 Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990, 61：79-86.
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3 Hinds P, Finlay C, Levine AJ. Mutation is required to activate the p53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. J Virol, 1989, 63：739-743.
4 Levine AJ, Momond J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene. Nature, 1991, 351：453-456.
5 Nigro JM, Baker SJ, Preisinger AC, et al. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumor types. Nature, 1989, 342：705-707.
6 Gonzalez AF, Deangelo AB, Nasim S, et al. Ras oncogene activation during hepato carcinogenesis in B6C3F1 male mice by dichloroacetic and trichloroacetic acids. Carcinogenesis, 1995, 16：495-500.
7 Donehower LA, Bradley A. The tumor suppressor p53. Biochem Biophys Acta, 1993, 1155：181-186.
8 Kakeji Y, Korenaga D, Tsujitani S, et al. Gastric cancer with p53 overexpression has high potential for metastasising to lymph nodes. Br J Cancer, 1993, 67：589-593.
(收稿：1997-04-13 修回：1997-11-10), 百拇医药