全身X射线照射对小鼠胸腺细胞凋亡的影响——原位末端标记法检测DNA断裂
作者：陈东 刘树铮 刘佳梅
单位：陈东、刘佳梅：130021 长春，白求恩医科大学组胚教研室；刘树铮：卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志990216 胸腺是T淋巴细胞发育、分化和成熟的场所。在T淋巴细胞的发育过程中，只有小部分胸腺细胞完成其发育过程，大部分胸腺细胞未发育成熟而在胸腺中死亡[1]，现已证实，未成熟的胸腺细胞主要通过细胞凋亡途径被清除[2]，胸腺细胞凋亡已成为机体免疫调节的主要途径之一。高剂量辐射可诱导胸腺细胞凋亡已被证实[3]，低剂量辐射使胸腺细胞凋亡减少已有初步报道[4]，尚需用更灵敏的检测方法进一步证实。作者采用检测细胞凋亡的十分灵敏的原位末端标记(TUNEL)法，半定量地研究了不同剂量X射线全身照射对小鼠胸腺细胞凋亡影响的时效关系和量效关系，为进一步阐明低剂量辐射兴奋效应的机制提供理论依据。
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一、材料和方法
1.动物及照射
本实验采用雄性健康昆明系小白鼠，由白求恩医科大学实验动物部提供，体重(20±2)g。动物随机分为假照组和照射组。用Philips深部X射线治疗机全身照射。电压200 kV，电流10 mA，滤片铜0.5 mm和铝1.0 mm。时效关系：分别观察低剂量照射(0.025、0.05、0.075 Gy：靶皮距212 cm，剂量率12.5 mGy/min)和高剂量照射(2 Gy：靶皮距50 cm，剂量率0.287 Gy/min)后0.5、1、2、4、8、12、24、48、72小时 TUNEL阳性细胞数的变化，各个时间点均设假照动物做对照。量效关系：低剂量采用0.025、0.05、0.075、0.1 Gy；高剂量采用0.5、1、2 Gy照射后12小时与假照同时取材。
2.组织标本制备
各个时间点动物于处死后立即摘取胸腺，用恒冷箱切片机切成6 μm切片，载置APES包被的载玻片上，室温干燥30分钟，-70℃冰箱中保存备用。
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3.TUNEL法[5]原位检测DNA断裂
各个时间点不同剂量及假照的恒冷箱切片按TUNEL试剂盒(购自德国宝灵曼公司)说明书进行染色。
4.结果判定及统计学处理
假照组和每个剂量组的每个时间点至少取3只动物，对每个动物的胸腺切片皮质部位观察其高倍镜下任意15个不重复视野在100个目镜网格中的阳性细胞数，取其平均值，进行t检验。
二、结果
假照组胸腺皮质内即有少量TUNEL阳性细胞出现，TUNEL阳性物质呈棕黄色，集中分布于细胞核，常聚集于核膜附近。高、低剂量照射后的时间-效应关系如图1所示。2 Gy照射后30分钟始胸腺皮质内迅速出现TUNEL阳性细胞，2小时阳性细胞数急剧上升，12小时达高峰，光镜下可见胸腺皮质内大量TUNEL阳性细胞，有些TUNEL阳性细胞聚集呈簇状(图2)，24～48小时呈下降趋势，72小时低于假照射组水平；0.075 Gy照射后30分钟，胸腺皮质内TUNEL阳性细胞数略高于假照水平，随后开始下降，12小时降至最低，显著低于假照组(P<0.05)(图1，图3，图4)，24小时后恢复至假照组水平；0.05 Gy照射后12小时，TUNEL阳性细胞数明显低于假照组(P<0.05)；0.025 Gy照射后各个时程与假照组相比均无明显差异。
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图1 辐射诱导胸腺细胞凋亡的时间-效应关系
图2 2 Gy X射线全身照射后12小时，TUNEL染色，甲基绿复染，胸腺皮质内
可见大量TUNEL阳性细胞
C:皮质，M：髓质×100
图3 照射后12小时胸腺细胞凋亡的剂量-效应关系
图4 0.075 Gy X射线全身照射后12 小时，TUNEL染色，甲基绿复染，胸腺皮质内
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有少数TUNEL阳性细胞
C:皮质，M：髓质×120
全身照射后12小时的剂量-效应关系如图3所示：高剂量(0.5，1，2 Gy)照射后TUNEL阳性细胞均增加，以2 Gy组增加最为显著(P<0.01)；低剂量(0.025、0.05、0.075、0.1 Gy)照射后TUNEL阳性细胞均有不同程度的降低，以0.05和0.075 Gy组最为明显(P<0.05)，此剂量-效应曲线呈“J”型。
三、讨论
电离辐射可以诱导胸腺细胞凋亡已在许多研究中得到证实[3]。本实验采用TUNEL法，半定量地研究了高、低剂量全身X射线照射诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间-效应关系及剂量效应关系。2 Gy照射后12小时内，随着时间的推移，TUNEL阳性细胞数显著增加直至高峰，此结果与牟颖等[4]采用荧光分光光度法定量及琼脂糖凝胶电泳法定性地观察4 Gy全身照射小鼠胸腺的研究结果基本一致。0.075 Gy整体照射后，先出现TUNEL阳性细胞短暂地增多，可能的解释是由于0.075 Gy的X射线直接作用使胸腺细胞DNA发生断裂所致；照射后1小时开始回降，至 12小时时明显低于假照组水平；0.05 Gy照射后12小时TUNEL阳性细胞也明显低于假照，提示低剂量辐射使胸腺细胞凋亡减少。TUNEL法检测的0.025～2 Gy全身照射后12小时的“J”型剂量-效应曲线进一步证实了高、低剂量整体照射对胸腺细胞凋亡的影响是截然相反的。本室以往的研究已证实低剂量辐射后可促进T细胞激活和增殖，增强免疫机能，其分子机制已从T细胞信号传递方面的研究得到初步阐明[6]。低剂量辐射后12小时胸腺细胞凋亡减少的原因可能由于T细胞信号传递的易化促进细胞存活所致；另有研究表明低剂量辐射后bc1-2表达水平上升及bc1-2/Bax增高[7]，提示低剂量辐射在早些时程所引起的DNA损伤作用可能激发了胸腺细胞存活因子的表达，从而抑制了胸腺细胞的凋亡，即启发了胸腺细胞自我修复及保护机制。
, 百拇医药
以往应用荧光分光光度法检测小鼠经4 Gy整体照射后2小时胸腺细胞凋亡开始增加[4]，而本实验中观察到2 Gy照射后 30分钟即出现TUNEL阳性细胞增加；以往采用流式细胞术检测整体照射后0.5 Gy以上的剂量可引起胸腺细胞凋亡百分率明显增高，而0.2 Gy及其以下的剂量对胸腺细胞凋亡无明显影响[8]，本实验中0.075 Gy照射后30 分胸腺皮质中可检测到TUNEL阳性细胞增多，且照射后12小时在0.075和0.05 Gy组TUNEL阳性细胞均明显低于假照组。上述结果的差异可能由于TUNEL法检测胸腺细胞凋亡比其他方法更敏感所致。此外，荧光分光光度法及流式细胞术等是采用全胸腺细胞进行测定，而TUNEL法可原位检测胸腺皮质中细胞凋亡情况，故TUNEL法实为检测细胞凋亡较快速、敏感且能准确定位的方法。
本课题受国家教委回国人员科研启动基金资助
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39570188)
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参考文献
1 Joel DD, Chanana AD, Cottier H, et al. Fate of thymocytes: studies with [125I] iododeoxyuridine and [3H] thymidine in mice. Cell Tissue Kinet, 1977, 10:57-59.
2 Cohn JJ.Apoptosis and programmed cell death in immunity. Ann Rev Immunol, 1992, 10:267-268.
3 Waters RL. Radiation-induced apoptosis in a murine T-cell hybridoma. Cancer Res, 1992, 52:883-885.
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4 牟颖，刘树铮.X射线对小鼠胸腺细胞凋亡的影响.中华放射医学与防护杂志，1996，16：296-298.
5 Gavriel Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119:493-496.
6 刘树铮编著. 低水平辐射兴奋效应.北京：科学出版社，1996. 271-316.
7 Liu SZ,Wan H, Chen SL, et al. Molecular changes related to the stimulatory effect of low dose radiation on immunity. J N Bethune Univ Med Sci, 1996, 22:559-561.
8 Liu SZ, Zhang YC, Mu Y, et al. Thymocyte apoptosis in response to low-dose radiation. Mutat Res, 1996, 358:185-187.
(收稿：1998-07-15 修回:1998-11-28), http://www.100md.com
单位：陈东、刘佳梅：130021 长春，白求恩医科大学组胚教研室；刘树铮：卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志990216 胸腺是T淋巴细胞发育、分化和成熟的场所。在T淋巴细胞的发育过程中，只有小部分胸腺细胞完成其发育过程，大部分胸腺细胞未发育成熟而在胸腺中死亡[1]，现已证实，未成熟的胸腺细胞主要通过细胞凋亡途径被清除[2]，胸腺细胞凋亡已成为机体免疫调节的主要途径之一。高剂量辐射可诱导胸腺细胞凋亡已被证实[3]，低剂量辐射使胸腺细胞凋亡减少已有初步报道[4]，尚需用更灵敏的检测方法进一步证实。作者采用检测细胞凋亡的十分灵敏的原位末端标记(TUNEL)法，半定量地研究了不同剂量X射线全身照射对小鼠胸腺细胞凋亡影响的时效关系和量效关系，为进一步阐明低剂量辐射兴奋效应的机制提供理论依据。
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一、材料和方法
1.动物及照射
本实验采用雄性健康昆明系小白鼠，由白求恩医科大学实验动物部提供，体重(20±2)g。动物随机分为假照组和照射组。用Philips深部X射线治疗机全身照射。电压200 kV，电流10 mA，滤片铜0.5 mm和铝1.0 mm。时效关系：分别观察低剂量照射(0.025、0.05、0.075 Gy：靶皮距212 cm，剂量率12.5 mGy/min)和高剂量照射(2 Gy：靶皮距50 cm，剂量率0.287 Gy/min)后0.5、1、2、4、8、12、24、48、72小时 TUNEL阳性细胞数的变化，各个时间点均设假照动物做对照。量效关系：低剂量采用0.025、0.05、0.075、0.1 Gy；高剂量采用0.5、1、2 Gy照射后12小时与假照同时取材。
2.组织标本制备
各个时间点动物于处死后立即摘取胸腺，用恒冷箱切片机切成6 μm切片，载置APES包被的载玻片上，室温干燥30分钟，-70℃冰箱中保存备用。
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3.TUNEL法[5]原位检测DNA断裂
各个时间点不同剂量及假照的恒冷箱切片按TUNEL试剂盒(购自德国宝灵曼公司)说明书进行染色。
4.结果判定及统计学处理
假照组和每个剂量组的每个时间点至少取3只动物，对每个动物的胸腺切片皮质部位观察其高倍镜下任意15个不重复视野在100个目镜网格中的阳性细胞数，取其平均值，进行t检验。
二、结果
假照组胸腺皮质内即有少量TUNEL阳性细胞出现，TUNEL阳性物质呈棕黄色，集中分布于细胞核，常聚集于核膜附近。高、低剂量照射后的时间-效应关系如图1所示。2 Gy照射后30分钟始胸腺皮质内迅速出现TUNEL阳性细胞，2小时阳性细胞数急剧上升，12小时达高峰，光镜下可见胸腺皮质内大量TUNEL阳性细胞，有些TUNEL阳性细胞聚集呈簇状(图2)，24～48小时呈下降趋势，72小时低于假照射组水平；0.075 Gy照射后30分钟，胸腺皮质内TUNEL阳性细胞数略高于假照水平，随后开始下降，12小时降至最低，显著低于假照组(P<0.05)(图1，图3，图4)，24小时后恢复至假照组水平；0.05 Gy照射后12小时，TUNEL阳性细胞数明显低于假照组(P<0.05)；0.025 Gy照射后各个时程与假照组相比均无明显差异。
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图1 辐射诱导胸腺细胞凋亡的时间-效应关系
图2 2 Gy X射线全身照射后12小时，TUNEL染色，甲基绿复染，胸腺皮质内
可见大量TUNEL阳性细胞
C:皮质，M：髓质×100
图3 照射后12小时胸腺细胞凋亡的剂量-效应关系
图4 0.075 Gy X射线全身照射后12 小时，TUNEL染色，甲基绿复染，胸腺皮质内
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有少数TUNEL阳性细胞
C:皮质，M：髓质×120
全身照射后12小时的剂量-效应关系如图3所示：高剂量(0.5，1，2 Gy)照射后TUNEL阳性细胞均增加，以2 Gy组增加最为显著(P<0.01)；低剂量(0.025、0.05、0.075、0.1 Gy)照射后TUNEL阳性细胞均有不同程度的降低，以0.05和0.075 Gy组最为明显(P<0.05)，此剂量-效应曲线呈“J”型。
三、讨论
电离辐射可以诱导胸腺细胞凋亡已在许多研究中得到证实[3]。本实验采用TUNEL法，半定量地研究了高、低剂量全身X射线照射诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间-效应关系及剂量效应关系。2 Gy照射后12小时内，随着时间的推移，TUNEL阳性细胞数显著增加直至高峰，此结果与牟颖等[4]采用荧光分光光度法定量及琼脂糖凝胶电泳法定性地观察4 Gy全身照射小鼠胸腺的研究结果基本一致。0.075 Gy整体照射后，先出现TUNEL阳性细胞短暂地增多，可能的解释是由于0.075 Gy的X射线直接作用使胸腺细胞DNA发生断裂所致；照射后1小时开始回降，至 12小时时明显低于假照组水平；0.05 Gy照射后12小时TUNEL阳性细胞也明显低于假照，提示低剂量辐射使胸腺细胞凋亡减少。TUNEL法检测的0.025～2 Gy全身照射后12小时的“J”型剂量-效应曲线进一步证实了高、低剂量整体照射对胸腺细胞凋亡的影响是截然相反的。本室以往的研究已证实低剂量辐射后可促进T细胞激活和增殖，增强免疫机能，其分子机制已从T细胞信号传递方面的研究得到初步阐明[6]。低剂量辐射后12小时胸腺细胞凋亡减少的原因可能由于T细胞信号传递的易化促进细胞存活所致；另有研究表明低剂量辐射后bc1-2表达水平上升及bc1-2/Bax增高[7]，提示低剂量辐射在早些时程所引起的DNA损伤作用可能激发了胸腺细胞存活因子的表达，从而抑制了胸腺细胞的凋亡，即启发了胸腺细胞自我修复及保护机制。
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以往应用荧光分光光度法检测小鼠经4 Gy整体照射后2小时胸腺细胞凋亡开始增加[4]，而本实验中观察到2 Gy照射后 30分钟即出现TUNEL阳性细胞增加；以往采用流式细胞术检测整体照射后0.5 Gy以上的剂量可引起胸腺细胞凋亡百分率明显增高，而0.2 Gy及其以下的剂量对胸腺细胞凋亡无明显影响[8]，本实验中0.075 Gy照射后30 分胸腺皮质中可检测到TUNEL阳性细胞增多，且照射后12小时在0.075和0.05 Gy组TUNEL阳性细胞均明显低于假照组。上述结果的差异可能由于TUNEL法检测胸腺细胞凋亡比其他方法更敏感所致。此外，荧光分光光度法及流式细胞术等是采用全胸腺细胞进行测定，而TUNEL法可原位检测胸腺皮质中细胞凋亡情况，故TUNEL法实为检测细胞凋亡较快速、敏感且能准确定位的方法。
本课题受国家教委回国人员科研启动基金资助
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39570188)
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参考文献
1 Joel DD, Chanana AD, Cottier H, et al. Fate of thymocytes: studies with [125I] iododeoxyuridine and [3H] thymidine in mice. Cell Tissue Kinet, 1977, 10:57-59.
2 Cohn JJ.Apoptosis and programmed cell death in immunity. Ann Rev Immunol, 1992, 10:267-268.
3 Waters RL. Radiation-induced apoptosis in a murine T-cell hybridoma. Cancer Res, 1992, 52:883-885.
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4 牟颖，刘树铮.X射线对小鼠胸腺细胞凋亡的影响.中华放射医学与防护杂志，1996，16：296-298.
5 Gavriel Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119:493-496.
6 刘树铮编著. 低水平辐射兴奋效应.北京：科学出版社，1996. 271-316.
7 Liu SZ,Wan H, Chen SL, et al. Molecular changes related to the stimulatory effect of low dose radiation on immunity. J N Bethune Univ Med Sci, 1996, 22:559-561.
8 Liu SZ, Zhang YC, Mu Y, et al. Thymocyte apoptosis in response to low-dose radiation. Mutat Res, 1996, 358:185-187.
(收稿：1998-07-15 修回:1998-11-28), http://www.100md.com